分子診斷技術(shù)臨床應(yīng)用

狹義的分子診斷是基于核酸的診斷技術(shù)，是通過對DNA或RNA的檢測來實(shí)現(xiàn)對疾病的檢測和診斷。但是，隨著第一張人類基因組測序圖的完成，以及由此而帶來的基因組學(xué)、蛋白組學(xué)、代謝物組學(xué)等新興學(xué)科的發(fā)展，分子診斷的內(nèi)涵已經(jīng)從單純的DNA/RNA拷貝、突變等變化的檢測，拓展到核酸與DNA片段、蛋白與多肽、抗原與抗體、受體與配體等生物大分子的檢測，并廣泛應(yīng)用于疾病的篩查、診斷、治療監(jiān)測、預(yù)后與預(yù)防等生命科學(xué)的各個領(lǐng)域。一、分子診斷的概念第一頁，共32頁。根據(jù)分子診斷技術(shù)特征劃分為三類：一、基于分子雜交為基礎(chǔ)的分子診斷技術(shù)兩條同源核酸分子（DNA或RNA）可以在堿基互補(bǔ)的原則下形成異質(zhì)雙鏈?zhǔn)沁z傳物質(zhì)最重要的化學(xué)特征，這一過程亦被稱為分子雜交。分子雜交是所有分子生物學(xué)技術(shù)的基礎(chǔ)，從最初的印跡雜交到聚合酶鏈反應(yīng)（PCR），從基因芯片再到高通量的DNA測序技術(shù)，都離不開堿基互補(bǔ)的分子雜交反應(yīng)。第二頁，共32頁。二、基于測序技術(shù)為基礎(chǔ)的分子診斷技術(shù)DNA的序列分析是分子診斷學(xué)的金標(biāo)準(zhǔn)，各種遺傳疾病，病毒或細(xì)菌的感染與變異，在基因表達(dá)水平上的個性化用藥，多基因疾病的診斷與預(yù)測，最終都可以借助基因測序平臺的應(yīng)用。第三頁，共32頁。三、基于擴(kuò)增技術(shù)為基礎(chǔ)的分子診斷技術(shù)1983年Mullis發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerasechainreaction，PCR），使體外擴(kuò)增DNA成為可能，開啟了體外擴(kuò)增和操作DNA或RNA技術(shù)的發(fā)展。到現(xiàn)在，擴(kuò)增DNA的技術(shù)已經(jīng)成為分子診斷應(yīng)用最廣的技術(shù)之一，并發(fā)展變化了數(shù)十種核酸擴(kuò)增檢測技術(shù)。第四頁，共32頁。二、PCR概述（一）PCR概念PCR（PolymeraseChainReaction）即聚合酶鏈反應(yīng)，是指在DNA聚合酶催化下，以母鏈DNA為模板，以特定引物為延伸起點(diǎn)，通過變性、退火、延伸等步驟，體外復(fù)制出與母鏈模板DNA互補(bǔ)的子鏈DNA的過程。是一項體外核酸擴(kuò)增技術(shù)，能快速特異地在體外擴(kuò)增任何目的DNA。第五頁，共32頁。

PCR技術(shù)能在一個試管內(nèi)將所要研究的目的基因或某一DNA片段于數(shù)小時內(nèi)擴(kuò)增至十萬乃至百萬倍，使肉眼能直接觀察和判斷；可從一根毛發(fā)、一滴血、甚至一個細(xì)胞中擴(kuò)增出足量的DNA供分析研究和檢測鑒定。二、PCR概述第六頁，共32頁。九十年代中期PCR臨床應(yīng)用在國內(nèi)全面展開1998年熒光定量PCR技術(shù)開始在中國應(yīng)用于臨床檢測PCR發(fā)展簡史1983

Mullis于12月16日成功發(fā)明了PCR1985關(guān)于PCR的文章首次由Mullis及其同事等人在《Science》雜志上發(fā)表198912月《Science》雜志將PCR和它所使用的TaqDNA聚合酶命名為第一個“年度分子”。199310月13日Mullis獲諾貝爾化學(xué)獎

1995熒光定量PCR技術(shù)出現(xiàn)第七頁，共32頁。PCR技術(shù)PCR核心技術(shù)是從水棲高溫菌中分離到能耐高溫的Taq酶，使擴(kuò)增反應(yīng)不需要每一個循環(huán)加一次DNA聚合酶，從而實(shí)現(xiàn)了自動化，使應(yīng)用領(lǐng)域迅速擴(kuò)大，PCR技術(shù)成為了分子生物學(xué)中的一項突破性技術(shù)。第八頁，共32頁。PCR概述——2000至2013年發(fā)表論文1280748篇第九頁，共32頁。二、PCR概述（二）原理雙鏈DNA變性

退火

延伸

（膜板）

（雙鏈分成單鏈）

（膜板與引物雜交）

（DNA合成）不斷重復(fù)PCR循環(huán)次數(shù)與DNA產(chǎn)量關(guān)系第十頁，共32頁。高靈敏度高特異性簡便快捷高效擴(kuò)增、忠實(shí)復(fù)制！PCR反應(yīng)的特點(diǎn)第十一頁，共32頁。三、熒光定量PCR技術(shù)的臨床應(yīng)用病毒性肝炎（HBV、HBV-YMDD、HCV）的基因檢測性病相關(guān)病原體（CT、NG、UU、HPV、HIV）的基因檢測優(yōu)生優(yōu)育項目診斷：人巨細(xì)胞病毒（HCMV）、單純皰疹病毒（HSV）、弓形蟲（TOX）、風(fēng)疹病毒（RUB）其它病原體檢測：結(jié)核桿菌、肺炎支原體、EB病毒、傷寒桿菌、幽門螺旋桿菌等一病原體檢測第十二頁，共32頁。常規(guī)結(jié)核病實(shí)驗室診斷方法及不足1.痰涂片作抗酸染色：陽性率低、費(fèi)時2.細(xì)胞培養(yǎng)“金標(biāo)準(zhǔn)”：周期太長(4-8W)3.血清學(xué)診斷：

a.接種BCG可出現(xiàn)陽性

b.不能區(qū)分活動性結(jié)核病和治愈后留下?lián)p傷灶的病人

c.交叉反應(yīng)，假陽性不能早期診斷！容易漏診、誤診！第十三頁，共32頁。熒光定量PCR檢測TB-DNA的意義1.能穩(wěn)定檢測10copy的TB-DNA，靈敏度高，特異性強(qiáng)2.早期、快速、準(zhǔn)確地診斷結(jié)核病。痰液、肺及支氣管灌洗液——肺結(jié)核血液——播散性結(jié)核和各臟器的結(jié)核病腦脊液——中樞神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)核病宮頸拭子、尿道拭子——泌尿生殖道結(jié)核病第十四頁，共32頁。3.熒光定量PCR檢出結(jié)核桿菌陽性率顯著高于痰涂片抗酸染色和改良羅氏培養(yǎng)法。

4.TB-DNA濃度可用于判斷療效：痰標(biāo)本中結(jié)核桿菌的數(shù)量呈逐漸下降趨勢，TB-DNA拷貝數(shù)下降。根據(jù)病原體DNA濃度，對藥物治療及療效觀察提供參考依據(jù)熒光定量PCR檢測TB-DNA的意義第十五頁，共32頁。二腫瘤相關(guān)基因表達(dá)的檢測：1、包括癌基因、抗癌基因2、腫瘤轉(zhuǎn)移基因3、轉(zhuǎn)移抑制基因三、熒光定量PCR技術(shù)的臨床應(yīng)用第十六頁，共32頁。三遺傳病1、等位基因檢測2、多基因遺傳病的突變檢測3、基因表達(dá)異常所致遺傳病檢測三、熒光定量PCR技術(shù)的臨床應(yīng)用第十七頁，共32頁。四其它應(yīng)用1.法醫(yī)學(xué)鑒定2.抗病毒藥物療效的觀察、指導(dǎo)3.縮短診斷的窗口期三、熒光定量PCR技術(shù)的臨床應(yīng)用第十八頁，共32頁。窗口期：所謂“窗口期”,是指從感染病原體開始,直至用某種檢測方法能夠檢測到該病原體存在為止的這一段時間。美國90％以上輸血傳播HIV和HBV以及75％以上輸血HCV的危險性均來自“窗口期”感染獻(xiàn)血。第十九頁，共32頁。

提供直接證據(jù)縮短“窗口期”PCR檢測的臨床意義第二十頁，共32頁。RNA+Ab-P24+Ab-血清陽轉(zhuǎn)后的方法RNAp24Ab血清陽轉(zhuǎn)抗體檢測臨界值

特異性抗體比例時間反應(yīng)指標(biāo)感染

血清陽轉(zhuǎn)前的方法怎樣檢測HIV早期感染?第二十一頁，共32頁。

嬰幼兒感染HIV診斷：12月內(nèi)核酸檢測，13-17月先抗體，陽性者檢測核酸，18個月以上抗體檢測第二十二頁，共32頁。四、PCR檢測的標(biāo)本采集要求

第二十三頁，共32頁。第二十四頁，共32頁。五、NAT（核酸檢測）技術(shù)類型：第二十五頁，共32頁。實(shí)時熒光核酸恒溫擴(kuò)增檢測技術(shù)（SAT）實(shí)時熒光核酸恒溫擴(kuò)增檢測技術(shù)（SAT）是將核酸恒溫擴(kuò)增和實(shí)時熒光檢測相結(jié)合的一種新型核酸檢測技術(shù)。國內(nèi)公司（上海仁度生物科技有限公司）自主研發(fā)，擁有一整套自主知識產(chǎn)權(quán)和核心技術(shù)。第二十六頁，共32頁。（SAT）技術(shù)原理：

同一溫度下（42℃），以RNA為起始模板，通過M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶產(chǎn)生一個雙鏈DNA拷貝，然后利用T7RNA多聚酶從DNA拷貝上產(chǎn)生多個（100～1000個）RNA拷貝；每一個RNA拷貝再從反轉(zhuǎn)錄開始進(jìn)入下一個擴(kuò)增循環(huán)；同時，帶有熒光標(biāo)記的探針和這些RNA拷貝特異結(jié)合，產(chǎn)生熒光。該熒光信號可由熒光檢測儀器實(shí)時捕獲，直觀反映擴(kuò)增循環(huán)情況。第二十七頁，共32頁。SAT檢測技術(shù)的優(yōu)勢：檢測靶標(biāo)：RNA靈敏度高，特異性強(qiáng)，易鑒別死菌、活菌，適合臨床判愈;擴(kuò)增產(chǎn)物：RNA高效擴(kuò)增，低污染;核酸提?。捍胖榉ㄌ崛〖兌雀呓Y(jié)果準(zhǔn)確;檢測方法：實(shí)時熒光檢測，擴(kuò)增、檢測同時進(jìn)行全程監(jiān)控;擴(kuò)增方式：42℃恒溫?zé)o需熱循環(huán)，設(shè)備成本低。第二十八頁，共32頁。總結(jié)

分子診斷技術(shù)經(jīng)歷近30年的快速發(fā)展，已經(jīng)形成了主要以雜交、測序和擴(kuò)增三種反應(yīng)模式為主的測試技術(shù)群，并且在臨床診斷中獲得了廣泛的應(yīng)用。原位雜交為主的技術(shù)對于檢測基因表達(dá)異常的遺傳性疾病具有明顯的優(yōu)勢，已成為細(xì)胞遺傳學(xué)實(shí)驗室最有力的檢測工具之一。而全基因組測序技術(shù)的快速發(fā)展，使得高通量的測序方式來檢測全基因的表達(dá)差異或突變檢測的成本均大大降低，而且測試速度將逐漸適合臨床的需求，因此對于大量基因的表達(dá)和突變檢測，高通量測序技術(shù)的優(yōu)勢將會越趨明顯。另一方面，RT-PCR、STA等PCR技術(shù)對于感染性疾病、低突變位點(diǎn)或變異的檢測，在成本上明顯優(yōu)于前兩者，因此PCR技術(shù)可能在臨床上擁有更好的應(yīng)用空間。不同的技術(shù)平臺有各自的優(yōu)缺點(diǎn)，我們要針對不同的實(shí)驗標(biāo)本對象及需求,選擇適合的技術(shù)方法，力求在“高效,高質(zhì)量,低成本”這三者間找到合適的平衡點(diǎn)。第二十九頁，共32頁。

分子診斷學(xué)的快速發(fā)展，得益