東南大學(xué)生化王大勇第7章

Whydoyouneedtopurifytheprotein?SequenceanalysisStructuralstudiesRaiseantibodiesIdentifysitesofmodificationFunctionalstudies當前1頁，總共69頁。Section1:Propertiesofprotein當前2頁，總共69頁。蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì)對某一種蛋白質(zhì)來說，在某一pH，它所帶的正電荷和負電荷恰好相等，也即凈電荷為零，這一pH稱為蛋白質(zhì)的等電點。當前3頁，總共69頁。蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì)當前4頁，總共69頁。當前5頁，總共69頁。Section2:SizeandshapeMethodsformeasuringproteinMW當前6頁，總共69頁。蛋白質(zhì)分子的大小和形狀蛋白質(zhì)分子量很大，相對分子量變化范圍在6000-1000000或更大一些。測定蛋白質(zhì)分子量的方法：1.根據(jù)蛋白質(zhì)化學(xué)組成測定最低相對分子量2.滲透壓法測定相對分子量3.蛋白質(zhì)的擴散和擴散系數(shù)4.沉降分析法測定蛋白質(zhì)相對分子量5.凝膠過濾法測定相對分子量6.SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定相對分子量當前7頁，總共69頁。bygelfiltration當前8頁，總共69頁。當前9頁，總共69頁。Electrophoresis/電泳當前10頁，總共69頁。SDS—PAGE當前11頁，總共69頁。Electrophoreticmobilitydependson:ChargesMassorsizeshape當前12頁，總共69頁。SDS，有效變性劑，帶負電荷巰基乙醇，打開二硫鍵蛋白質(zhì)亞基在電場中的行為只與分子大小有關(guān)。當前13頁，總共69頁。Section3:ColloidpropertyandprecipitationProteinsolutionisahydrophiliccolloid(1-100nm);1)Whyareproteincolloidsstable?①hydrationmantle/水化膜②charges③Brownmovement當前14頁，總共69頁。1.蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)

分散相質(zhì)點在膠體系統(tǒng)中保持穩(wěn)定，需要具備3個條件：第一，分散相的質(zhì)點大小在1～100nm范圍內(nèi)，動力學(xué)上穩(wěn)定，在介質(zhì)中作布朗運動；第二，分散相的質(zhì)點帶有同種凈電荷，互相排斥，不易聚集成大顆而沉淀；第三，分散相的質(zhì)點能與溶劑形成溶劑化層當前15頁，總共69頁。蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)蛋白質(zhì)的分子大小屬于膠體質(zhì)點范圍。蛋白質(zhì)溶液是一種親水膠體，蛋白質(zhì)分子表面的親水基團，如一NH2，-COOH,-OH以及–CO-NH-等，在水溶液中能與水分子起水化作用，使蛋白質(zhì)分子表面形成一個水化層。蛋白質(zhì)分子表面上的可解離基團，在適當?shù)膒H條下．都帶有相同的凈電荷，與其周圍的反離子構(gòu)成穩(wěn)定的雙電層。蛋白質(zhì)溶液由于具有水化層——雙電層兩方面的穩(wěn)定因素，所以作為膠體系統(tǒng)是相當穩(wěn)定的。蛋白質(zhì)溶液也和一般的膠體系統(tǒng)一樣具有丁達爾效應(yīng)、布朗運動以及不能通過半透膜。當前16頁，總共69頁。2.蛋白質(zhì)的沉淀

如果條件發(fā)生改變，破壞了蛋白質(zhì)溶液的穩(wěn)定性，蛋白質(zhì)就會從溶液中沉淀出來。蛋白質(zhì)溶液的穩(wěn)定性與質(zhì)點大小、電荷和水化作用有關(guān)。

鹽析法

有機溶劑沉淀法

重金屬鹽沉淀法

生物堿試劑和某些酸類沉淀法

加熱變性沉淀法

當前17頁，總共69頁。鹽析法向蛋白質(zhì)溶液中加入大量的中性鹽（硫酸胺、硫酸鈉或氯化鈉等），使蛋白質(zhì)脫去水化層而聚集沉淀。一般不引起蛋白質(zhì)變性;當除去鹽后，復(fù)可溶解。當前18頁，總共69頁。有機溶劑沉淀法向蛋白質(zhì)溶液中加入一定量的極性有機溶劑（甲醇、乙醇或丙酮等），因引起蛋白質(zhì)脫去水化層以及降低介電常數(shù)而增加帶電質(zhì)點間的相互作用，致使蛋白質(zhì)顆粒容易凝集而沉淀。有機溶劑沉淀法，如果控制在低溫下操作并且盡量縮短處理的時間則可使變性速度減慢。當前19頁，總共69頁。重金屬鹽沉淀法當溶液pH大于等電點時，蛋白質(zhì)顆粒帶負電荷，這樣它就容易與重金屬離子結(jié)合成不溶性鹽而沉淀。誤服重金屬鹽的病人可口服大量牛乳或豆?jié){等蛋白質(zhì)進行解救就是因為它能和重金屬離子形成不溶性鹽，然后再服用催吐劑排出體外。當前20頁，總共69頁。生物堿試劑和某些酸類沉淀法生物堿試劑是指能引起生物堿沉淀的一類試劑，如驟酸即2，4，6-三硝基酚、鎢酸和碘化鉀等。某些酸類指的是三氯醋酸，磺基水楊酸和硝酸等。當溶液pH小于等電點時，蛋白質(zhì)顆粒帶正電荷，容易與生物堿試劑和酸類的酸根負離子發(fā)生反應(yīng)生成不溶性鹽而沉淀。這類沉淀反應(yīng)經(jīng)常被臨床檢驗部門用來除去體液中干擾測定的蛋白質(zhì)。當前21頁，總共69頁。加熱變性沉淀法幾乎所有的蛋白質(zhì)都因加熱變性而凝固。少量鹽類促進蛋白質(zhì)加熱凝固。當?shù)鞍踪|(zhì)處于等電點時，加熱凝固最完全和最迅速。加熱變性引起蛋白質(zhì)凝固沉淀的原因可能是由于熱變性是蛋白質(zhì)天然結(jié)構(gòu)解體，疏水基外露，因而破壞了水化層，同時由于蛋白質(zhì)處于等電點也破壞了帶電狀態(tài)。我國很早就創(chuàng)造了將大豆蛋白質(zhì)的濃溶液加熱并點入少量鹽鹵（含MgCl2)的制豆腐的方法，這是成功的應(yīng)用加熱變性沉淀蛋白質(zhì)的一個例子。當前22頁，總共69頁。Section4:GeneralprinciplesaboutproteinpurificationComplicatedandspecific“Blackart”當前23頁，總共69頁。SELECTSOURCEOFMATERIALConcentration:

choosetissue,

organismwithhighproduction/concentrationof

targetproteinDevelopmentalstage:Doeslevelofproteinchangewithdevelopment?Subcellularlocalization

Useofexpressionsystem當前24頁，總共69頁。ProteinpurificationPretreatment/預(yù)處理Roughfractionation/粗分級Finefractionation/細分級當前25頁，總共69頁。

1.前處理

2.粗分級分離

3.細分級分離

當前26頁，總共69頁。1.前處理植物組織和細胞：由于具有由纖維素、半纖維素和果膠等物質(zhì)組成的細胞壁，一般需要用與石英砂或玻璃粉和適當?shù)奶崛∫阂黄鹧心サ姆椒ㄆ扑榛蛴美w維素酶處理也能達到目的。細菌：整個細菌細胞壁的骨架實際上是一個借共價鍵連接而成的肽肽聚糖囊狀大分子，非常堅韌。破碎細菌細胞壁的常用方法有超聲波震蕩，與砂研磨、高壓擠壓或溶菌酶處理（以分解肽聚糖）等。組織和細胞破碎以后，選擇適當?shù)木彌_液把所要的蛋白質(zhì)提取出來。細胞碎片等不溶物用離心或過濾等方法除去。如果所要的蛋白質(zhì)主要集中在某一細胞組分，如細胞核、染色體、核糖體或可溶性的細胞質(zhì)等，則可利用差速離心方法將它們分開，收集該細胞組分作為下步純化的材料。當前27頁，總共69頁。2.粗分級分離當?shù)鞍踪|(zhì)提取液（有時還雜有核酸、多糖之類）獲得后，需要將所要的蛋白質(zhì)與其他雜蛋白分離開來。一般這一步的分級分離用鹽析、等電點沉淀和有機溶劑分級分離等方法。這些方法的特點是簡便、處理量大．既能除去大量雜質(zhì)（包括脫鹽），又能濃縮蛋白質(zhì)溶液。有些蛋白質(zhì)提取液體積較大，又不適于用沉淀或鹽析法濃縮，則可采用超過濾、凝膠過濾、冷凍真空干燥或其他方法（如聚乙二醇濃縮法）進行濃縮。當前28頁，總共69頁。3.細分級分離

結(jié)晶：蛋白質(zhì)分離純化的最后步驟。盡管結(jié)晶并不能保證蛋白質(zhì)一定是均一的，但只有某種蛋白質(zhì)在溶液中數(shù)量上占優(yōu)勢時才能形成結(jié)晶。重結(jié)晶又可除去少量夾雜的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)的結(jié)晶不僅是純度的一個標志，也是斷定制品處于天然狀態(tài)的有力指標。一般使用層析法包括凝膠過濾，離子交換層析，吸附層析以及親和層析等。必要時還可選擇電泳法，包括區(qū)帶電泳、等電聚焦等作為最后的純化步驟。用于細分級分離的方法一般規(guī)模較小，但分辨率很高。當前29頁，總共69頁。電泳

前處理粗分離細分離生物組織

無細胞提取液破碎、差速離心、溶解膜蛋白等選擇性沉淀法親和層析離子交換層析精制后的蛋白質(zhì)可結(jié)晶純化凝膠過濾疏水層析吸附層析分段鹽析、有機溶劑分級沉淀、凝膠層析當前30頁，總共69頁。Section5:MethodsforProteinPurificationTakeadvantageofthefollowingpropertiesofdifferentprotein.★molecularweight/MW★solubility★chargedifference★selectiveadsorption★ligandspecificity（親和層析）★hydrophobicproperty當前31頁，總共69頁。①dialysis/透析&ultrafiltration/超濾法Removesmallmoleculesorions②densitygradientcentrifugation密度梯度離心③gelfiltration/凝膠過濾法1、Accordingtosizeandshape當前32頁，總共69頁。semi-permeablemembrane.Poresofmembraneareofacertainsize.Proteinstaysin;smallmoleculespassthrough.1)Dialysis／透析當前33頁，總共69頁。半透膜袋蛋白質(zhì)溶液透析液磁棒磁力攪拌器透析：是利用蛋白質(zhì)等大分子不能通過半透膜的性質(zhì)，使蛋白質(zhì)和其它小分子物質(zhì)如無機鹽單糖等分開。常用的半透膜：

玻璃紙（賽璐玢紙，cellophanepaper）

火綿紙（賽璐玎紙,celloidinpaper）

其他改型纖維素材料當前34頁，總共69頁。2）超過濾（ultrafiltration）利用壓力、抽濾（A）或離心力（B）等多種形式，強行使水和其它小分子溶質(zhì)通過半透膜，而蛋白質(zhì)被截留在膜上，以達到濃縮和脫鹽目的。濾膜有多種規(guī)格，可選擇性的截留相對分子量不同的蛋白質(zhì)。濾膜抽氣濾膜離心AB當前35頁，總共69頁。Sedimentvelocitydependsonweight,densityandshapeofaparticle.SucrosegradientPolysucrosegradient3)Densitygradientcentrifugation密度梯度離心當前36頁，總共69頁。生物大分子及顆粒的沉降不僅決定于它的大小，而且也取決于它的密度。顆粒在具有密度梯度的介質(zhì)中離心時，質(zhì)量和密度大的顆粒沉降的快，并且每種蛋白質(zhì)顆粒沉降到與自身密度相等的介質(zhì)密度梯度時，即停止不前，最后各自在離心管中被分離成獨立的區(qū)帶。分成區(qū)帶的樣品可以在管底刺一個小孔逐滴放出，分步收集。常用的介質(zhì)有蔗糖、氯化銫等。滴加樣品離心管蔗糖密度梯度蔗糖濃度當前37頁，總共69頁。4)GelFiltration／凝膠過濾層析ColumnmadeofporusbeadsSeparatesintermsofsizeBigproteinselutefirst當前38頁，總共69頁。凝膠過濾

原理：它是60年代發(fā)展起來的，利用凝膠把物質(zhì)按分子大小不同進行分離的一種方法。由于被分離物質(zhì)的分子大?。ㄖ睆剑┖托螤畈煌?，洗脫時大分子物質(zhì)由于直徑大于凝膠網(wǎng)孔不能進入凝膠內(nèi)部，只能沿著凝膠顆粒間的孔隙，隨溶劑向下移動，因此流程短，首先流出層析柱，而小分子物質(zhì)，由于直徑小于凝膠網(wǎng)孔，能自由進出膠粒網(wǎng)孔，使之洗脫時流程增長，移動速度慢而后流出層析柱。當前39頁，總共69頁。2.IntermsofsolubilityIsoelectricprecipitationSaltinginandsaltingoutOrganicsolventprecipitation當前40頁，總共69頁。1.等電沉淀和pH控制蛋白質(zhì)處于等電點時，其凈電荷為零，由于相鄰蛋白質(zhì)分子之間沒有靜電斥力而趨于聚集沉淀。利用蛋白質(zhì)在等電點時溶解度最低的原理，可以把蛋白質(zhì)混合物分開。當pH被調(diào)至蛋白質(zhì)混合物中某種成分的等電點pH時，這種蛋白質(zhì)的大部分或全部將沉淀下來，那些等電點高于或低于該pH的蛋白質(zhì)則仍留在溶液中這樣沉淀出來的蛋白質(zhì)保持著天然構(gòu)象，能重新溶解于適當?shù)膒H和一定濃度的鹽溶液中。當前41頁，總共69頁。2.蛋白質(zhì)的鹽溶和鹽析低濃度的中性鹽可以增加蛋白質(zhì)的溶解度，這種現(xiàn)象稱為鹽溶(saltingin)。鹽溶作用主要是由于蛋白質(zhì)分子吸附某種鹽類離子后，帶電層使蛋白質(zhì)分子彼此排斥，而蛋白質(zhì)分子與水分子間的相互作用卻加強，因而溶解度增高。當前42頁，總共69頁。3.有機溶劑分級分離（1）有機溶劑可以使蛋白質(zhì)沉淀，主要有乙醇、丙酮、乙酸乙酯等。（2）有機溶劑可以破壞水化膜。（3）有分級分離現(xiàn)象。（4）要求對有機溶劑低溫預(yù)冷。當前43頁，總共69頁。4.溫度對蛋白質(zhì)溶解度的影響在一定溫度范圍內(nèi)，約0-40℃之間，大部分球狀蛋白質(zhì)的溶解度隨溫度升高而增加，但也有例外，例如人的血紅蛋白從0到25℃，溶解度隨溫度上升而降低。在40-50℃以上開始變性，一般在中性pH介質(zhì)中即失去溶解力。大多數(shù)蛋白質(zhì)在低溫下比較穩(wěn)定，因此蛋白質(zhì)的分級分離操作一般都在0℃或更低的溫度下進行。當前44頁，總共69頁。IsoelectricprecipitationProteinhaslowestsolubilityatpI.當前45頁，總共69頁。Saltingin/SaltingoutSaltingINlowconcentrationsofsaltusuallyincreasesthesolubilityofchargedmacromolecules.SaltingOUThighconcentrationsofaddedsaltlowersthesolubilityofandtheycomeoutofsolution.EffectofK2SO4onthesolubilityofHb-CO當前46頁，總共69頁。1)Electrophoresis電泳Chargedproteinsmovetowardtheoppositeelectrode.3.Basedonchargedifference當前47頁，總共69頁。電泳電泳分離蛋白質(zhì)；是根據(jù)蛋白質(zhì)在電場中的遷移的差別達到分離目的的。蛋白質(zhì)樣品加到一塊預(yù)先制好的凝膠介質(zhì)上，只要在凝膠的兩端加上電場，就可以達到分離蛋白質(zhì)的目的，這樣的電泳稱之凝膠電泳（gelelectrophoresis）。凝膠可以是淀粉凝膠（starchgel）、瓊脂糖凝膠（agarosegel）和聚丙烯酰胺凝膠（polyacrylamidegel）。一般凝膠介質(zhì)中的pH被維持在堿性區(qū)，目的是使大多數(shù)蛋白質(zhì)都帶有負電荷，這樣它們可以向陽極遷移。蛋白質(zhì)的遷移與蛋白質(zhì)的質(zhì)量和帶電荷的多少有關(guān)。當前48頁，總共69頁。電泳技術(shù)分類垂直板電泳毛細管電泳水平板電泳電泳支持物濾紙凝膠薄膜圓盤電泳當前49頁，總共69頁。聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳：以聚丙烯胺凝膠為支持物，一般制成凝膠柱或凝膠板，凝膠是由相連的二部分組成（小的部分是濃縮膠，大的部分是分離膠），這二部分凝膠的濃度（孔徑大?。?、緩沖液組分和離子強度,pH以及電場強度都是不同的，即不連續(xù)的。這樣,電泳時樣品首先在不連續(xù)的兩相間積聚濃縮而成很薄的起始區(qū)帶（厚度約為0.1mm），然后再進行電泳分離。當前50頁，總共69頁。PAGE&SDSPAGE

polyacrylamidegelelectrophoresis

聚丙烯酰胺凝膠電泳當前51頁，總共69頁。等電聚焦（isoelectricfocusing）原理:

在一定抗對流介質(zhì)（如凝膠）中加入兩性電解質(zhì)載體(Ampholyte,是一種多氨基多羧基的混合物，由異構(gòu)物和同系物組成，其pK和pI值各自相異卻又相近），當直流電通過時，便形成一個由陽極到陰極pH值逐步上升的梯度。兩性化合物在此電泳過程中，就被濃集在與其pI相等的pH區(qū)域，從而使不同化合物能按其各自等電點得到分離。應(yīng)用：

高效率分離純化蛋白質(zhì)測定蛋白質(zhì)分子量pH10pH3pI1=pH8pI2=pH7pI3=pH5-+線性梯度當前52頁，總共69頁。AssaypIofproteinbyIEF當前53頁，總共69頁。2-dimensionalelectronphoresis當前54頁，總共69頁。IEF,pISDS,MW當前55頁，總共69頁。毛細管電泳

毛細管電泳：是在毛細管（2-75μm）中裝入緩沖液，從其一端注入樣品，在毛細管兩端加高壓直流電實現(xiàn)對樣品的分離，分離后的樣品依次通過設(shè)在毛細管一端的檢測器檢出。該法克服了傳統(tǒng)區(qū)帶電泳的熱擴散和樣品擴散的問題，實現(xiàn)了快速和高效分離。毛細管電泳被認為是90年代最有影響的分離手段之一。已廣泛用于氨基酸分析、蛋白質(zhì)高效分離、指紋圖譜研究、分離合成的寡核苷酸、DNA序列測定及PCR產(chǎn)物的分析鑒定等。當前56頁，總共69頁。2)

Ion-exchangechromatography

SeparatesproteinsonthebasisofchargeTwokinds:Anion/陰離子-exchangeCation/陽離子-exchange當前57頁，總共69頁。離子交換層析

（ion-changechromatography）

原理基質(zhì)疏水型離子交換劑；親水型離子交換劑應(yīng)用制備純化生物物質(zhì)定量、定性測定混合物中各組分1.平衡階段:離子交換劑與反離子結(jié)合2.吸附階段：樣品與反離子進行交換3、4.解吸附階段：用梯度緩沖溶液洗脫，先洗下弱吸附物質(zhì)，后洗下強吸附物質(zhì)5.再生階段：用原始平衡液進行充分洗滌，既可重復(fù)使用12345原始緩沖溶液的反離子樣品溶液梯度濃度當前58頁，總共69頁。常用的陽離子交換劑

離子交換劑可電離基團可電離基團結(jié)構(gòu)CM-纖維素（弱酸型）羧甲基P-纖維素（中強弱酸型）磷酸基SE-纖維素（強弱酸型）磺乙基SP-纖維素（強弱酸型）磺丙基當前59頁，總共69頁。常用的陰離子交換劑

AE-纖維素（弱減型）氨基乙基離子交換劑可電離基團可電離基團結(jié)構(gòu)PAB-纖維素（弱減型）對氨基苯甲酸DEAE-纖維素二乙基氨基乙基DEAE-Sephadex二乙基氨基乙基DEAE-纖維素（強減型）二乙基氨基乙基QAE-纖維素（強減型）二乙基（2-羥丙基）-氨基乙基（中弱減型）（中弱減型）當前60頁，總共69頁。4.利用選擇性吸附的純化方法某些稱為吸附劑的固體物質(zhì)具有吸附能力，能夠?qū)⑵渌N類的分子吸附在自己的表面，吸附力的強弱因被吸物質(zhì)的性質(zhì)而異。吸附層析就是利用待純化的分子和雜質(zhì)分子與吸附劑之間的吸附能力和解吸性質(zhì)不同而達到分離目的的。典型的吸附劑有硅膠、氧化鋁和活性炭等。當前61頁，總共69頁。5.利用配體特異性親和力的純化方法親和層析：利用蛋白質(zhì)分子對其配體分子特有的識別能力，也即生物學(xué)親和力建立起來的一種有效的純化方法。親和層析經(jīng)常只需要經(jīng)過一步的處理即可將某種所需蛋白質(zhì)從復(fù)雜的混合物中分離出來，并且純度相當高。親和層析最先用于酶的純化并從中得到發(fā)展，但現(xiàn)在已廣泛地用于核苷酸、核酸、免疫球蛋白、膜受體、細胞器甚至完整的細胞的純化。當前62頁，總共69頁。親和層析（affiuitychromatography）

應(yīng)用分離純化酶、抗原、抗體分離純化核酸研究酶的結(jié)構(gòu)與功能+待純化分子配體a.理論依據(jù)：待純化分子和配體間具有親和性+基質(zhì)b.活性基質(zhì)與配體結(jié)合產(chǎn)生親和吸附劑++雜質(zhì)c.待純化分子與親和吸附劑結(jié)合，與雜質(zhì)分離+d.偶聯(lián)復(fù)合物經(jīng)解離后