實驗六酵母蔗糖酶的粗提及其比活力測定

實驗六酵母蔗糖酶的粗提及其比活力測定第1頁/共10頁酵母蔗糖酶的粗提及其比活力測定

第2頁/共10頁蔗糖酶活性及比活性測定原理+蔗糖酶第3頁/共10頁

蔗糖酶的酶活單位：在40℃水浴反應10min，測定吸光值A540，增加0.01個光吸收值的酶量為一個酶活力單位（U）。蔗糖酶比活力測定：每毫克蔗糖酶蛋白所具有的活力單位，對同一種酶來說，酶的比活力越高，酶的純度越高。第4頁/共10頁試劑（一）蔗糖酶的粗提及活性測定（1）冰凍無水乙醇：1瓶/班（2）0.01mol/LpH6.0PBSbuffer，2000ml（全班共用）（3）0.5mol/L蔗糖,用0.01mol/LpH6.0PBSbuffer配制，200ml（大組共用）（4）2mol/LNaOH，1000ml（全班共用）（5）3,5-二硝基水揚酸(DNS)試劑：可配300ml（全班共用）19.2克酒石酸鉀鈉溶于50ml水中（電爐加熱溶解，不用沸騰），把.0.63克3,5-二硝基水楊酸(DNS)和26.2ml2mol/LNaOH加到酒石酸鉀鈉的熱溶液中，電爐加熱溶解，冷卻到50-60℃，再加0.5克苯酚和0.5克亞硫酸鈉．攪拌使溶解．冷卻后加水定容至100ml，過濾，貯于棕色瓶中。第5頁/共10頁實驗方法（一）粗提取酵母蔗糖酶（1）量取2g的面包酵母，加液氮研磨（加入少量石英砂）充分研磨，再加入18ml的0.01mol/LPBS（pH6.0），攪拌混合,再加入液氮研磨,（2）待溶液完全解凍后,轉入離心管,2mlPBS洗研缽,轉入離心管.第6頁/共10頁（二）熱提取酵母蔗糖酶（3）11000r/min離心10min，離心后取上清液，按下表方法分別測蔗糖酶A的活性及蛋白含量（蛋白含量略）。（4）將上述上清液置于45℃的恒溫水浴鍋中，用玻璃棒緩慢攪拌30min，然后置于冰浴中迅速冷卻5min。然后裝入離心管中，離心，轉速11000r/min條件下離心10min，離心后取上清液，按下表方法分別測蔗糖酶B的活性及蛋白含量。第7頁/共10頁（三）乙醇提取酵母蔗糖酶（1）取上述第4步中的上清液10ml，緩慢加入10ml的冰凍的無水乙醇（乙醇的終濃度為50％），并攪拌5min，此過程在冰浴中進行。然后裝入離心管中，轉速3000r/min條件下離心5min，離心后棄上清液，留沉淀，離心管倒置于濾紙上，盡可能去除乙醇殘液。（2）將沉淀用15ml的0.01mol/L的PBS（pH6.0）攪拌溶解30min，溶液如為渾濁液，10000r/min離心10min，離心后取上清液，按下表方法測蔗糖酶C的活性及蛋白含量。第8頁/共10頁表1酵母蔗糖酶酶活性及比活力測定試劑對照管粗提A1粗提A2熱提B1熱提B2醇提C1醇提C20.5mol/L蔗糖（ml）0.30.30.30.30.30.30.32mol/LNaOH（ml）0.100000040℃恒溫水浴準確保溫10min各組酶液（ml）0.10.10.10.10.10.10.01mol/LpH6.0PBS（ml）0.140℃恒溫水浴中準確反應10min2mol/LNaOH（ml）0.10.10.10.10.10.1DNS（ml）0.50.50.50.50.50.50.5100℃沸水浴準確加熱5min，立即冷卻蒸餾水（ml）5555555搖勻，以對照管作