第十三章基因藥物分析

第十三章基因藥物分析第一頁，共四十七頁，2022年，8月28日第一節(jié) 概述什么是生物藥物利用生物體、生物組織或器官等成分，綜合運(yùn)用生物學(xué)、生物化學(xué)、微生物學(xué)、免疫學(xué)、物理化學(xué)合藥學(xué)的原理與方法制得的藥物。

廣義的生物藥物包括各種天然生物活性物質(zhì)以及人工合成或半合成的天然物質(zhì)類似物。第二頁，共四十七頁，2022年，8月28日生化藥物Biochemicaldrugs生物技術(shù)藥物Bio-technologydrugs生物制品Biologicalproducts生物提取物生物-化學(xué)半合成現(xiàn)代生物技術(shù)什么是生化藥物和基因工程藥物？生物藥物生命基本物質(zhì)及其衍生物、降解物、結(jié)構(gòu)修飾物等運(yùn)用生物技術(shù)進(jìn)行新藥研發(fā)如基因工程藥物生物技術(shù)生物材料制備第三頁，共四十七頁，2022年，8月28日什么是基因工程藥物（Geneticengineeringdrugs）？功能蛋白預(yù)防、治療某種疾病調(diào)控基因的分離、純化或人工合成控制蛋白合成DNA重組技術(shù)可大量生產(chǎn)的受體細(xì)胞導(dǎo)入細(xì)菌、酵母菌、動(dòng)植物及其細(xì)胞基因的繁殖表達(dá)發(fā)現(xiàn)第四頁，共四十七頁，2022年，8月28日生化藥物和基因工程藥物的種類生化藥物基因工程藥物氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)酶類與輔酶類多糖類脂質(zhì)類核酸及其降解物、衍生物主要成分為多肽或蛋白質(zhì)激素類及神經(jīng)遞質(zhì)類細(xì)胞因子類酶類及凝血因子類…第五頁，共四十七頁，2022年，8月28日生化藥物和基因工程藥物的特點(diǎn)

來源均為生物體，并都具一定的生物活性和生物功能；

治療疾病的針對性強(qiáng)、毒副作用小、易為人體吸收；

分子量大，且往往不是定值；

結(jié)構(gòu)確證難；

質(zhì)量對多種因素敏感，需進(jìn)行全程質(zhì)量控制；

需進(jìn)行生物活性檢查、安全性檢查、效價(jià)檢查等；第六頁，共四十七頁，2022年，8月28日第二節(jié)質(zhì)量檢驗(yàn)的基本程序與方法理化鑒別法生化鑒別法生物鑒別法化學(xué)鑒別法UV光譜法HPLC法顯色、沉淀等肽圖譜酶法電泳法脫鹽后等電聚焦法利用酶的專屬性利用帶電荷差異利用等電點(diǎn)差異利用生物體進(jìn)行試驗(yàn)來鑒別藥物1.鑒別第七頁，共四十七頁，2022年，8月28日2.雜質(zhì)檢查一般雜質(zhì)檢查：原料藥的檢查同化學(xué)藥物多糖類：檢查低聚糖、核酸、蛋白質(zhì)等；特殊雜質(zhì)檢查：酶類：酶催化反應(yīng)基本產(chǎn)物分析，相關(guān)酶 的檢查；（生化藥物）第八頁，共四十七頁，2022年，8月28日基因工程藥物的生產(chǎn)涉及到生物材料和生物學(xué)過程，因此可能會(huì)存在很多傳統(tǒng)生產(chǎn)方法不可能存在的有害雜質(zhì)。生產(chǎn)過程中雜質(zhì)的檢查（尤其是基因工程藥物）基因工程藥物質(zhì)量控制必須結(jié)合最終產(chǎn)品、有效的中間測試以及有效的方法來去除可能的雜質(zhì)。如：原核細(xì)胞中表達(dá)的產(chǎn)品可能含有內(nèi)毒素、致敏原如：動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的產(chǎn)品可能含有DNA雜質(zhì)或病毒第九頁，共四十七頁，2022年，8月28日3.安全性檢查熱原和細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法過敏試驗(yàn)——檢查異性蛋白：有可能存在異性蛋白的藥物應(yīng)作過敏試驗(yàn)。異常毒性試驗(yàn)（異常毒性檢查法）：用一定劑量的藥物按指定的操作方法和給藥途徑給予規(guī)定體重的某種試驗(yàn)動(dòng)物，觀察其急性毒性反應(yīng)。反應(yīng)的判斷以試驗(yàn)動(dòng)物死亡與否為終點(diǎn)。第十頁，共四十七頁，2022年，8月28日降壓物質(zhì)檢查法：降壓物質(zhì)是指某些藥物中含有的能導(dǎo)致血壓降低的雜質(zhì)，包括組胺、類組胺或其他導(dǎo)致血壓降低的物質(zhì)。無菌檢查法——檢查藥品及敷料是否染有活菌：無菌檢查指示控制制品染菌狀況的一種檢測手段。要使藥品真正達(dá)到無菌，首先應(yīng)嚴(yán)格執(zhí)行GMP管理制度。第十一頁，共四十七頁，2022年，8月28日致突變試驗(yàn)生殖毒性試驗(yàn)可能的雜質(zhì)：殘留DNA、宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)、內(nèi)毒素、蛋白質(zhì)突變體和蛋白裂解物等基因工程藥物中可能的雜質(zhì)與污染物檢查可能的污染物：微生物、熱原和病毒等第十二頁，共四十七頁，2022年，8月28日4.含量（效價(jià)）測定含量測定效價(jià)測定（％）(生物效價(jià)或酶活力單位）HPLC法適用對象：結(jié)構(gòu)明確的小分子或水解后變成小分子的藥物酶類或蛋白質(zhì)藥物測定：以體內(nèi)或體外法測定參考品的生物學(xué)活性SDS法(蛋白質(zhì))同時(shí)測定蛋白質(zhì)含量，計(jì)算特異比活性，以單位數(shù)/毫克蛋白（IU/mg）標(biāo)示第十三頁，共四十七頁，2022年，8月28日第三節(jié)常用定量分析方法及其應(yīng)用主要包括理化分析法、生化測定法和生物檢定法一.理化分析法化學(xué)分析法：光譜分析法：色譜分析法：重量法、容量法、電化學(xué)分析等比色法，紫外、熒光分光光度法等高效液相，灌注色譜等第十四頁，共四十七頁，2022年，8月28日重量法：根據(jù)樣品中分離出的單質(zhì)或化合物的重量測定所含成分的含量。1．提取法：用適宜的溶劑提取出樣品中的某種成分，再蒸去溶劑進(jìn)行測定。2．揮發(fā)法：利用被測組分具有揮發(fā)性，或?qū)⑺D(zhuǎn)化為揮發(fā)性物質(zhì)來進(jìn)行含量測定的方法。3．沉淀法：利用沉淀反應(yīng)，將被測組分轉(zhuǎn)化成難溶物，以沉淀形式從溶液中分離出來，然后經(jīng)過濾、洗滌、烘干或熾灼，最后稱重并計(jì)算其含量的方法?；瘜W(xué)分析法：重量法、滴定分析、電化學(xué)分析第十五頁，共四十七頁，2022年，8月28日滴定分析法：根據(jù)樣品中某些成分與標(biāo)準(zhǔn)溶液能定量地發(fā)生酸堿中和、氧化還原或絡(luò)合反應(yīng)等進(jìn)行測定例：用電位滴定法測定L－鹽酸精氨酸含量；胰淀粉酶的效價(jià)測定：以淀粉為底物，經(jīng)淀粉酶水解后產(chǎn)生還原糖，在堿性溶液中還原糖又將斐林試劑中的Cu2＋還原成Cu＋，多余的Cu＋在酸性溶液中與KI作用析出碘，然后用硫代硫酸納滴定所析出的碘，來推算糖的含量，進(jìn)而標(biāo)定淀粉酶的效價(jià)。電化學(xué)分析法——離子選擇性電極分析法：電極借助敏感膜對某一離子產(chǎn)生選擇性的響應(yīng)。第十六頁，共四十七頁，2022年，8月28日比色法：樣品與顯色劑可發(fā)生顏色反應(yīng)，依顏色反應(yīng)的強(qiáng)度測定含量。光譜分析法例：用比色法測定硫酸軟骨素的含量原理：樣品先用鹽酸水解生成氨基己糖，然后在堿性條件下與乙酰丙酮反應(yīng)，再與對二甲氨基苯甲醛反應(yīng)產(chǎn)生紅色，以鹽酸氨基葡萄糖為對照品，用比色法測定。1.樣品配制：a.配制鹽酸氨基葡萄糖對照品溶液；b.配制供試品溶液，水解并中和多余鹽酸；方法：第十七頁，共四十七頁，2022年，8月28日2.顯色反應(yīng)：精密量取兩份對照品、供試品溶液，以水作為空白，在堿性條件下與乙酰丙酮反應(yīng)，再與對二甲氨基苯甲醛進(jìn)行顯色反應(yīng)；3.吸光度測定：在525nm的波長處分別測定對照品溶液與供試品溶液的吸收度，以兩份的平均值，按下式計(jì)算：A、As分別為樣品和對照品溶液吸收度的平均值；Ws為對照品溶液每lml中含鹽酸氨基葡萄糖的量（mg）；W為供試品重量（mg）；0.8309為氨基葡萄糖與鹽酸氨基葡萄糖分子量的比值。第十八頁，共四十七頁，2022年，8月28日樣品或轉(zhuǎn)化后的產(chǎn)物在某一波長處有最大吸收，在一定的濃度范圍內(nèi)，其濃度與吸收度成正比，則可進(jìn)行定量測定。紫外分光光度法樣品或其衍生物經(jīng)紫外光照射后發(fā)出熒光，利用熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量；或利用衍生化反應(yīng)和熒光淬滅進(jìn)行測定。熒光分光光度法第十九頁，共四十七頁，2022年，8月28日HPLC法：特點(diǎn)：不破壞樣品，適合分析高沸點(diǎn)、大分子、強(qiáng)極性和熱穩(wěn)定性差的生化藥物，尤其是具有生物活性的物質(zhì)。色譜分析法常用的固定相、流動(dòng)相、檢測器1．反相高效液相（RP-HPLC）：主要用于分析肽類、氨基酸、蛋白質(zhì)和多糖等的定量分析常用的HPLC法包括：第二十頁，共四十七頁，2022年，8月28日2．高效離子交換色譜法（HPIEC）：常用于分離分析蛋白質(zhì)、多肽；特點(diǎn)：蛋白質(zhì)、多肽的分離是根據(jù)其相應(yīng)的離子化程度而進(jìn)行的；分離過程是以鹽濃度增大的梯度洗脫法進(jìn)行的；柱效中等但具有較高質(zhì)量的活性回收。第二十一頁，共四十七頁，2022年，8月28日3．高效凝膠過濾色譜法（HPGFC）可用于多肽和蛋白質(zhì)等生化藥物分離，并測定分子量。特點(diǎn)：本法填料和樣品間的相互作用在所有的液相色譜技術(shù)中，是最溫和的。在固定比例的水溶液中分離，流動(dòng)相通常為緩沖液；分離是根據(jù)蛋白質(zhì)或多肽在溶液中相應(yīng)的有效粒徑而進(jìn)行的。第二十二頁，共四十七頁，2022年，8月28日灌注色譜法：20世紀(jì)90年代發(fā)展起來的用于分離純化和分析的色譜新技術(shù)。特點(diǎn)：采用新的分離介質(zhì)，允許液體傳送流經(jīng)介質(zhì)的內(nèi)表面，樣品直接灌注入介質(zhì)顆粒中，大大消除了傳統(tǒng)色譜分離中擴(kuò)散速率對分離容量和分辨率的負(fù)面影響，提高分離的速度和效率。應(yīng)用：基因工程藥物和其它大分子藥物的分離純化和分析第二十三頁，共四十七頁，2022年，8月28日分類：定義：在電解質(zhì)溶液中，帶電粒子或離子在電場作用下，以不同的速度向其所帶電荷相反方向遷移的現(xiàn)象叫電泳。二、生化測定法原理：基于溶質(zhì)在電場中的遷移速度不同而進(jìn)行的分析方法電泳法根據(jù)電泳的分離特點(diǎn)及工作方式，電泳可分為三大類：（l）自由界面電泳：第二十四頁，共四十七頁，2022年，8月28日★（2）區(qū)帶電泳：在電泳過程中，應(yīng)用各種不同的惰性支持介質(zhì)，在電場作用下，使具有不同泳動(dòng)速度的組分形成各自區(qū)帶的電泳。紙電泳法；醋酸纖維素薄膜電泳法；聚丙烯酰胺凝膠電泳法；十二烷基硫酸納（SDS）聚丙烯酰胺凝膠電泳法；（3）高效毛細(xì)管電泳：是在一根內(nèi)徑約50μm的毛細(xì)管中，在高壓電場下進(jìn)行樣品分離分析的一種新型電泳技術(shù)。常用方法：根據(jù)所用的支持物不同可分為：第二十五頁，共四十七頁，2022年，8月28日酶法酶活力測定法酶分析法以酶為分析對象的分析方法以酶為分析工具或分析試劑的分析方法酶活力測定法酶分析法以酶能夠高效、專一地催化某些化學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，通過對酶反應(yīng)速度的測定或生成物等濃度的測定而檢測相應(yīng)物質(zhì)的含量原理：定義：目的：測定某種酶的活力或活性，用酶的活力單位和比活性表示以酶為試劑測定樣品中酶以外的其它物質(zhì)的含量第二十六頁，共四十七頁，2022年，8月28日酶反應(yīng)速度用單位時(shí)間反應(yīng)底物的減少或產(chǎn)物的增加來表示

酶活力測定法1.概念：酶活力：指酶催化一定化學(xué)反應(yīng)的能力酶活力的測定即是測定一個(gè)被酶所催化的化學(xué)反應(yīng)的速度A

B

酶第二十七頁，共四十七頁，2022年，8月28日2.酶活力評(píng)價(jià)指標(biāo)酶的活力單位（enzymaticactivityunit）酶的比活性（specificactivity）定義：一定條件下，單位時(shí)間內(nèi)轉(zhuǎn)化一定量底物所需酶的量。酶在25℃以最適當(dāng)?shù)牡孜餄舛?、最適當(dāng)?shù)木彌_液離子強(qiáng)度以及最適當(dāng)?shù)膒H等條件下，每分鐘能轉(zhuǎn)化1μmol底物的酶量為一個(gè)活性單位，用IU表示。定義：每毫克蛋白質(zhì)中所含的酶單位數(shù)，用IU/（mg

蛋白質(zhì)）表示每毫克酶的活力單位數(shù)×在酶高度純凈，酶的分子量已知時(shí)，可采用分子活力表示。第二十八頁，共四十七頁，2022年，8月28日3.酶促反應(yīng)的條件及影響因素：使所有待測定的酶分子都應(yīng)該能夠正常地發(fā)揮它的作用。★如何選擇酶促反應(yīng)的條件：?底物濃度影響：反應(yīng)速率受到底物濃度影響?pH影響：pH影響酶的活性和反應(yīng)方向[S]＝100KmpH7pH10乳酸丙酮酸如：乳酸脫氫酶第二十九頁，共四十七頁，2022年，8月28日?溫度影響：這一影響體現(xiàn)在兩個(gè)方面直接影響化學(xué)反應(yīng)速度影響酶通常選用25℃，30℃或37℃（±0.1℃）?輔助因子影響：

有些酶需要金屬離子，有些酶則需要相應(yīng)的輔酶物質(zhì)。為了提高酶在反應(yīng)系統(tǒng)中的穩(wěn)定性，有時(shí)需要某些相應(yīng)的物質(zhì)。如對巰基酶可加入二巰基乙醇、二巰基蘇糖醇等。第三十頁，共四十七頁，2022年，8月28日?空白和對照：通過不加酶，或不加底物，或二者都加（但酶需經(jīng)過失效處理）；空白是指雜質(zhì)反應(yīng)和自發(fā)反應(yīng)引起的變化量；提供未知因素的影響。對照是指用純酶或標(biāo)準(zhǔn)酶制劑測得的結(jié)果，主要用于比較或標(biāo)定。第三十一頁，共四十七頁，2022年，8月28日ii)常用方法有：適當(dāng)條件下將酶和底物混合①測定生成一定量產(chǎn)物所需的時(shí)間，即終點(diǎn)法②隔一定時(shí)間，間斷或連續(xù)地測定反應(yīng)變化③反應(yīng)一定時(shí)間后停止反應(yīng)，定量測定底物減少或產(chǎn)物生成的量i)包括物理法、化學(xué)法和酶分析法4.測定方法：第三十二頁，共四十七頁，2022年，8月28日按取樣和檢測方式分為取樣測定和連續(xù)測定：★取樣測定酶反應(yīng)開始后不同的時(shí)間，取出一定量反應(yīng)液，并用適當(dāng)?shù)姆椒ㄍＶ蛊浞磻?yīng)后，對產(chǎn)物和底物進(jìn)行定量分析，求得單位時(shí)間內(nèi)酶促反應(yīng)變化量的方法。加入酶變性劑加熱使酶變性第三十三頁，共四十七頁，2022年，8月28日基于底物和產(chǎn)物在物理化學(xué)性質(zhì)上的不同，在反應(yīng)過程中對反應(yīng)系統(tǒng)進(jìn)行直接連續(xù)檢測的方法?！镞B續(xù)測定②幾乎所有酶反應(yīng)都可根據(jù)產(chǎn)物或底物的化學(xué)性質(zhì)找出具體測定方法取樣測定法目前仍廣泛采用，這是因?yàn)椋孩偎恍枰厥鈨x器；③由于色源底物和熒光源底物的發(fā)展，可在原來的底物分子上接上相應(yīng)的有色基團(tuán)、發(fā)色基團(tuán)或熒光基團(tuán)。從準(zhǔn)確性和測定效率看，連續(xù)法都比取樣測定好。第三十四頁，共四十七頁，2022年，8月28日★檢測方法：常用UV-Vis和熒光分光光度法?UV-Vis分光光度法：?熒光分光光度法如：細(xì)胞色素氧化酶的底物為細(xì)胞色素C，該物質(zhì)的還原態(tài)在550nm的摩爾吸收系數(shù)為2.18×104，而氧化態(tài)為0.80×104，可利用這種吸收度差別來進(jìn)行測定。產(chǎn)物和底物之一有熒光，熒光強(qiáng)度變化可指示反應(yīng)速度。特別適于酶量或底物量極低時(shí)的快速分析。?旋光度法產(chǎn)物和底物在某波長或波段處有明顯的特征吸收差別。某些酶反應(yīng)過程常伴隨著旋光變化，在沒有其它更好的方法可用時(shí)，可考慮用旋光度測定法第三十五頁，共四十七頁，2022年，8月28日?其它法酶偶聯(lián)測定、電化學(xué)測定、放射化學(xué)法等5.計(jì)算：測定酶反應(yīng)速度V(velocity)求酶的濃度或含量C(concentration)V=k·C+b?酶反應(yīng)進(jìn)程曲線：不同酶量的產(chǎn)物濃度CB～時(shí)間t反應(yīng)速度Vt檢驗(yàn)酶反應(yīng)和測定系統(tǒng)是否正確?酶濃度曲線：反應(yīng)速度Vt～酶量C第三十六頁，共四十七頁，2022年，8月28日例：胃蛋白酶的活力測定原理：胃蛋白酶催化血紅蛋白水解成不被三氯醋酸沉淀的氨基酸，水解的芳香氨基酸如酪氨酸有紫外吸收，用UV分光光度法直接測定，計(jì)算酶活力。方法：1.對照品溶液的制備：精密稱取經(jīng)105℃干燥至恒重的酪氨酸適量，加鹽酸溶液（取1mol／L鹽酸溶液65mL，加水至1000mL）制成每1mL中含0.5mg的溶液。2.供試品溶液的制備：取本品適量，精密稱定，用上述鹽酸溶液制成每1ml中約含0.2～0.4單位的溶液。第三十七頁，共四十七頁，2022年，8月28日取試管6支，其中3支各精密加入對照品溶液1mL，另3支各精密加入供試品溶液1ml，置37±0.5℃水浴中，保溫5min，精密加入預(yù)熱至37±0.5℃的血紅蛋白試液5ml，搖勻，并精確計(jì)時(shí)，在37±0.5℃水浴中反應(yīng)10min。立即精密加入5％三氯醋酸溶液5ml，搖勻，濾過，取續(xù)濾液備用。另取試管2支，各精密加入血紅蛋白試液5ml，置37±0.5℃水浴中保溫10min，再精密加入5％三氯醋酸溶液5ml，其中1支加供試品溶液1ml，另1支加上述鹽酸溶液1ml，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，分別作為供試品和對照品的空白對照，照分光光度法，在275nm的波長處測定吸收度，算出平均值A(chǔ)s和A3.測定法：取樣測定空白測定第三十八頁，共四十七頁，2022年，8月28日4.計(jì)算：以每分鐘能催化水解血紅蛋白生成1μmol酪氨酸的酶量為一個(gè)蛋白酶活力單位，計(jì)算每1g含蛋白酶的活力單位：式中：Ws為1mL對照品溶液的酪氨酸含量（μg）；181.19為酪氨酸的分子量。W為供試品取樣量（g）；n為供試品的稀釋倍數(shù)；

A，As為對照品及供試品溶液吸收度的平均值；第三十九頁，共四十七頁，2022年，8月28日酶分析法★酶分析法是以酶為分析工具或分析試劑的分析方法，分析對象包括酶的底物、輔酶、活化劑和酶的抑制劑等。★分析過程：選擇“工具酶”酶反應(yīng)的測定含量濃度測定★方法：?總變量分析法：又稱為平衡法或終點(diǎn)法僅適用于底物的檢測方法。在酶作用的反應(yīng)完成后，借助理化方法測定其總變化量，并參考反應(yīng)的平衡點(diǎn)，計(jì)算被測物的實(shí)際含量或濃度的一種分析方法。第四十頁，共四十七頁，2022年，8月28日?動(dòng)力學(xué)分析法：討論：1.被測底物的濃度應(yīng)很小，且反應(yīng)須控制在一級(jí)反應(yīng)水平；2.其它因素應(yīng)盡量處于最適水平，雙底物反應(yīng)的另一底物應(yīng)具有足夠高的濃度。3.酶的用量要適宜足夠高，以保證反應(yīng)較快達(dá)到終點(diǎn)價(jià)格昂貴1～2Km(IU/mL)原理：通過條件控制，分別使底物、輔酶活化劑或抑制劑的濃度在酶反應(yīng)中起決定反應(yīng)速度的主導(dǎo)作用，這時(shí)酶反應(yīng)速度和上述相應(yīng)因素的濃度間將具有確定的比例關(guān)系，這樣測定酶反應(yīng)的速度就可求出它們的濃度。第四十一頁，共四十七頁，2022年，8月28日

方法：酶分析法采用的條件和酶活力測定法的條件基本相同，但其所用的酶量必須一定．被測物以外的其他反應(yīng)成分均須保證處于恒定和最適。（1）被測物是酶的底物：當(dāng)?shù)孜餄舛龋跾］<Km時(shí)，酶反應(yīng)相對底物為一級(jí)反應(yīng)，v=k·[S]，因此測定酶反應(yīng)速度可以得知其濃度。（2）被測物是輔酶（雙底物反應(yīng)）：需要NAD(P)、CoA之類輔酶的反應(yīng)可看作是雙底物反應(yīng)，這些輔酶可看作是底物之一。當(dāng)另一類底物濃度足夠高時(shí)，反應(yīng)速度將與其濃度成正比。第四十二頁，共四十七頁，2022年，8月28日（3）被測物為活化劑：當(dāng)其他條件最適且一定時(shí)，活化劑在低濃度范圍內(nèi)，酶反應(yīng)速度隨活化劑濃度增大而升高，并在一定范圍內(nèi)具有線性比例關(guān)系。（4）被測物是抑制劑：不可逆抑制劑對酶反應(yīng)的抑制程度隨抑制劑濃度呈線性增加，而且酶反應(yīng)的最終抑制程度由抑制劑的絕對量決定；可逆抑制劑在底物濃度一定時(shí)，在低濃度范圍內(nèi)，酶反應(yīng)速度隨抑制劑濃度升高呈線性降低。