免疫組織化學(xué)染色技術(shù)(研究生)

第二節(jié)免疫組織化學(xué)染色技術(shù)

Immunohistochemicaltechnique

該技術(shù)主要是用于研究和觀察細(xì)胞中的某些結(jié)構(gòu)或分子物質(zhì)和組織細(xì)胞間的成分，因此現(xiàn)又稱(chēng)為免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)。根據(jù)標(biāo)記物的不同，免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)可分為：

1.免疫酶細(xì)胞化學(xué)技術(shù)

2.免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)

3.免疫鐵蛋白技術(shù)

4.免疫金-銀細(xì)胞化學(xué)技術(shù)

5.免疫電子顯微鏡技術(shù)第一頁(yè)，共55頁(yè)。一、免疫組織化學(xué)染色方法的原理抗原（antigen）

1.定義：是一類(lèi)在適合條件下能激發(fā)機(jī)體免疫系統(tǒng)發(fā)生免疫應(yīng)答，并能與免疫應(yīng)答產(chǎn)生的效應(yīng)物質(zhì)（抗體和效應(yīng)細(xì)胞）在體內(nèi)或體外發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)的物質(zhì)?？乖哂袃煞N性能：（1）免疫原性（immunogenicity）指抗原分子具有誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的特性。（2）反應(yīng)原性（reactogenicity）指抗原分子與抗體或效應(yīng)T細(xì)胞等免疫應(yīng)答產(chǎn)物發(fā)生特異性反應(yīng)的特性。第二頁(yè)，共55頁(yè)。2.抗原的分類(lèi)

完全抗原、半抗原免疫學(xué)分類(lèi)胸腺依賴(lài)抗原與非依賴(lài)抗原外源性抗原：微生物、花粉等內(nèi)源性抗原：隱蔽的自身抗原、腫瘤相關(guān)抗原等臨床分類(lèi)同種異型抗原：人類(lèi)白細(xì)胞抗原、血型抗原異嗜性抗原：人與其他動(dòng)物、植物等之間存在的共同抗原第三頁(yè)，共55頁(yè)?？贵w（antibody）

1.定義：機(jī)體受到抗原刺激后，通過(guò)體液免疫應(yīng)答，B淋巴細(xì)胞活化、增殖，分化為漿細(xì)胞，由漿細(xì)胞合成并分泌的僅與該抗原發(fā)生特異性反應(yīng)的球蛋白，稱(chēng)為抗體。大部分抗體電泳后位于區(qū)帶，1972年國(guó)際免疫學(xué)聯(lián)合會(huì)正式將化學(xué)結(jié)構(gòu)相同或相似的一類(lèi)球蛋白分子統(tǒng)一命名為免疫球蛋白(immunoglobin，Ig)。

2.抗體的種類(lèi):

五類(lèi)，即IgA、IgD、IgE、IgG、IgM

免疫組織化學(xué)染色技術(shù)中，使用的抗體主要是IgG，個(gè)別情況下使用IgG的亞型，多為IgG1。第四頁(yè)，共55頁(yè)。免疫組織化學(xué)染色的反應(yīng)原理及顯色原理

1.免疫組織化學(xué)染色的反應(yīng)原理

染色反應(yīng)的最基本原理是抗原抗體的反應(yīng)。

通過(guò)對(duì)針對(duì)標(biāo)本中相應(yīng)抗原的抗體上標(biāo)記某種發(fā)色劑或酶類(lèi)，再通過(guò)激發(fā)發(fā)色劑或使用某種顯色劑，在顯微鏡下使標(biāo)本中抗原抗體反應(yīng)的部位產(chǎn)生肉眼可觀察到的顏色，以確定所要檢測(cè)的抗原是否存在。

通過(guò)免疫組織化學(xué)染色技術(shù)，在光學(xué)顯微鏡下即可檢測(cè)到所要研究的蛋白分子類(lèi)物質(zhì)的存在與否。第五頁(yè)，共55頁(yè)。2.免疫組織化學(xué)染色的顯色原理

(1)基本原理

熒光標(biāo)記或酶標(biāo)抗體的染色分為直接法和間接法。其中以酶標(biāo)抗體法應(yīng)用最為廣泛。

直接法：是將酶直接標(biāo)記在第一抗體上，用酶標(biāo)抗體與切片上待檢測(cè)的組織或細(xì)胞中抗原反應(yīng)，再用底物顯色，顯示出所檢測(cè)的目的抗原的部位。

間接法：是將酶標(biāo)記在第二抗體或與第二抗體具有親和性的某種分子上，檢測(cè)組織或細(xì)胞內(nèi)的特異性抗原物質(zhì)。

間接法中所用的一抗是針對(duì)組織或細(xì)胞中某種抗原的特異性抗體，多數(shù)抗體是由家兔制備的多克隆抗體或由小鼠制備的單克隆抗體。第六頁(yè)，共55頁(yè)。

第二抗體是第一抗體的抗體，所以只要不同的第一抗體均來(lái)自同一種屬動(dòng)物，與標(biāo)記的第二抗體結(jié)合就能用來(lái)顯示不同特異性抗原的存在。這樣可避免直接法中標(biāo)記每一種第一抗體的麻煩。通過(guò)某種技術(shù)增加第二抗體上標(biāo)記酶的含量，可提高免疫組織化學(xué)染色的敏感度。

IHC技術(shù)中，絕大多數(shù)以間接法為常用。（2）顯色的基本程序

1抗孵育切片或細(xì)胞涂片2抗（酶標(biāo)抗體）孵育切片發(fā)色劑顯色（核復(fù)染）第七頁(yè)，共55頁(yè)。（3）酶標(biāo)抗體法的顯色原理及顯色劑

辣根過(guò)氧化物酶（horseradishperoxidase，HRP）

HRP+H2O2HRP·H2O2HRP·H2O2+DH2HRP+D+2H2O

HRP催化的酶促反應(yīng)第一步是特異的，其余反應(yīng)是非特異的，因此，可選用各種供氫體作為顯色劑，可使反應(yīng)的終產(chǎn)物呈現(xiàn)不同的顏色，如：

CN（4-chloro-1-naphthol）為藍(lán)色

TMB（tetramethyl-benzidine）為深藍(lán)色

AEC（3-amino-9-ethyl-carbazole）為紅色

DAB（3，3-diaminobenzidine）為棕色第八頁(yè)，共55頁(yè)。堿性磷酸酶(alkalinephosphatase,ALP)

以AS-Mx（色酚AS-MX磷酸鹽）為底物，F(xiàn)B/FR(Fastblue/Fastred)為發(fā)色劑，生成藍(lán)色/紅色不容性沉淀物。

ALP標(biāo)記的抗體主要用于內(nèi)源性過(guò)氧化物酶含量較高的血細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等的ICC染色。

由于組織細(xì)胞內(nèi)含有內(nèi)源性ALP，在顯色液中需加入終濃度為2-4mol/L的左旋咪唑(levamisole)，大多數(shù)內(nèi)源性ALP活性可被抑制。葡萄糖氧化酶

(glucoseoxidase，GOD)

以葡萄糖為底物的酶，其顯色方法為-D-葡萄糖67mg、NBT6.7mg、PMS(吩嗪硫酸甲酯,phenazinemethyl-sulfate)0.167mg、0.05mol/LPBS(pH8.2)10.0ml，37oC孵育1小時(shí)，生成藍(lán)色不溶性沉淀物，該終產(chǎn)物不溶于有機(jī)溶劑，切片可經(jīng)脫水、透明后封片，長(zhǎng)期保存。

第九頁(yè)，共55頁(yè)。（4）核復(fù)染

在顯色后，特別是用DAB顯色后，切片可用蘇木素染料進(jìn)行核復(fù)染，經(jīng)水化后細(xì)胞核顯示藍(lán)色，與胞質(zhì)中的DAB棕色形成對(duì)比。但用AEC顯色后不能用蘇木素做核復(fù)染，因?yàn)榕渲铺K木素染料中使用酒精作為介質(zhì)，可使AEC的紅色終產(chǎn)物褪色，且AEC顯色后只能用水溶性封固劑封片。第十頁(yè)，共55頁(yè)。第三節(jié)免疫組織化學(xué)染色步驟（一）ABC或SP法進(jìn)行石蠟切片染色的主要步驟

1.組織材料的采?。?/p>

2.組織塊的固定；

3.組織塊的脫水、透明及石蠟包埋；

4.石蠟切片的制備；

5.石蠟切片的脫蠟及水化；

6.抑制內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性；

7.PBS洗滌切片；

8.抗原修復(fù)或蛋白酶消化切片，修復(fù)或暴露抗原；

9.PBS洗滌切片；第十一頁(yè)，共55頁(yè)。10.用與二抗來(lái)源相同的動(dòng)物非免疫正常血清（或同時(shí)加入BSA）孵育切片，防止抗體的非特異性吸附；11.用特異性一抗(單克隆、多克隆)孵育切片；12.PBS（可加入Tween20#，PBST）洗滌切片；13.用針對(duì)一抗的生物素化的二抗孵育切片；14.用PBS或PBST洗滌切片；15.滴加SP試劑或ABC試劑；16.PBS或PBST洗滌切片；17.DAB或AEC顯色；18.自來(lái)水洗滌切片，終止顯色；19.用蘇木素做核復(fù)染；20.切片脫水、透明，樹(shù)膠封片。第十二頁(yè)，共55頁(yè)。（二）各染色步驟的具體操作及注意事項(xiàng)1.組織材料的采取

活檢組織手術(shù)切除標(biāo)本尸檢標(biāo)本實(shí)驗(yàn)組織或培養(yǎng)細(xì)胞活檢組織：宮頸、鼻咽、口腔、喉、皮膚和內(nèi)窺鏡鉗取的組織

體積小，因活檢鉗直接鉗取，常受壓過(guò)度而變性。因此，活檢鉗的刃口必須銳利，以免組織受壓，活檢時(shí)應(yīng)采取主要的病灶區(qū)。

抗原在組織中的分布不均一，故病灶較大的切除標(biāo)本應(yīng)考慮切取主要病灶。病灶與正常組織交界區(qū)及遠(yuǎn)距病灶的正常區(qū)。組織標(biāo)本第十三頁(yè)，共55頁(yè)。

尸檢組織

由于取材時(shí)一般均已超過(guò)死亡后2小時(shí)以上，組織有不同程度自溶，其抗原或變性消失或有嚴(yán)重的彌散現(xiàn)象。法醫(yī)尸檢一般多在24小時(shí)以上，甚至數(shù)月后，檢材受死后變化影響嚴(yán)重，而影響染色結(jié)果。手術(shù)切除的組織較新鮮，取材后應(yīng)立即固定，以保存組織結(jié)構(gòu)和抗原。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)本新鮮，按需要取材；很多情況下是在灌流固定后取材，組織結(jié)構(gòu)和抗原保持良好，非常適用于免疫組織化學(xué)染色。取材標(biāo)本的大小尸檢組織材料大小以1cm1cm0.2cm為宜。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物常用大鼠或小鼠，其臟器體積小，有利于取材。一般標(biāo)本體積不宜過(guò)大，防止固定不透，影響抗原的保存，也浪費(fèi)試劑。第十四頁(yè)，共55頁(yè)。

2.組織塊的固定、水洗（1）固定液：種類(lèi)較多，常用的有以下2種：

4%甲醛/PBS(pH7.2-7.4)

配制方法：10ml40%甲醛(formalin)+90mlPBS

使用新鮮甲醛，久存甲醛可分解，形成白色沉淀(多聚甲醛)，還可形成甲酸，影響染色結(jié)果。

4%多聚甲醛/PBS(pH7.2-7.4)

配制方法：40g多聚甲醛(paraformaldehyde)+500ml0.1mol/LPB(pH7.2-7.4)，攪拌、加熱至60oC，同時(shí)滴入1NNaOH至溶液完全透明。冷卻后用1NHCl調(diào)PH值至，再用0.1mol/LPB將溶液加至1000ml。

?固定時(shí)間：一般根據(jù)組織塊大小及性質(zhì)，固定2-24小時(shí)。

?固定原理：甲醛通過(guò)使蛋白分子發(fā)生交聯(lián)而產(chǎn)生固定作用。甲醛與蛋白質(zhì)中的許多氨基酸反應(yīng)，并能保存脂類(lèi)和類(lèi)脂體。

?不利作用：甲醛使組織中蛋白分子發(fā)生交聯(lián)，使所檢測(cè)的抗原決定簇被封閉，影響抗原抗體的結(jié)合。第十五頁(yè)，共55頁(yè)。（2）水洗

沖洗時(shí)間與標(biāo)本的種類(lèi)、組織塊的大小和固定時(shí)間長(zhǎng)短有關(guān)。尸檢組織和大動(dòng)物組織一般沖洗24

小時(shí)，小動(dòng)物組織沖洗2～10小時(shí)。

新鮮標(biāo)本固定時(shí)間短，沖洗時(shí)間也相應(yīng)縮短，固定時(shí)間長(zhǎng)的標(biāo)本，沖洗時(shí)間也需延長(zhǎng)。

沖洗時(shí)組織放在廣口瓶中，瓶口用紗布罩好并扎緊，防止組織塊漏出。用一根適當(dāng)?shù)哪z管，一端接自來(lái)水，一端插入瓶底，使水緩慢流出，或?qū)⒔M織塊放入洗滌筐中，放在水盆內(nèi)沖洗。

對(duì)于過(guò)小組織或穿刺組織和小動(dòng)物組織多次換水浸泡即可。第十六頁(yè)，共55頁(yè)。3.組織塊的脫水、透明、浸蠟和包埋（1）脫水脫水劑：酒精、丙酮、異丙醇、正丁醇，最常用酒精。酒精可以與水以任何比例混合，脫水能力強(qiáng)，并可硬化組織。酒精對(duì)組織的穿透速度很快，對(duì)組織有較明顯的收縮作用。為避免組織過(guò)度收縮，應(yīng)從低濃度開(kāi)始，然后再依次增加其濃度。在常溫下或4

oC下進(jìn)行，以減少抗原的損失。

70%80%90%95%100%100%第十七頁(yè)，共55頁(yè)。

（2）透明

為使石蠟?zāi)芙虢M織塊，組織經(jīng)脫水后，必須經(jīng)過(guò)一種既能與酒精相溶，又能溶解與石蠟相溶。通過(guò)溶劑的媒介作用而達(dá)到石蠟浸入組織塊的目的。

透明劑：二甲苯、苯、甲苯、氯仿等，最常用二甲苯。

一般經(jīng)過(guò)2～3次純二甲苯溶液透明，每次10～15分鐘，同時(shí)應(yīng)根據(jù)組織的種類(lèi)和組織塊大小以及二甲苯的新鮮程度加以調(diào)整，不應(yīng)機(jī)械照搬。第十八頁(yè)，共55頁(yè)。（3）浸蠟

組織塊經(jīng)透明后在熔化的石蠟內(nèi)浸漬的過(guò)程稱(chēng)浸蠟。

為使石蠟充分滲入組織中，常需經(jīng)過(guò)2～3次石蠟浸漬。

用于免疫組織化學(xué)染色的組織塊浸蠟應(yīng)使用低熔點(diǎn)蠟，在60oC以下浸透。（4）包埋浸蠟后的組織塊放入包埋盒中，將熔化的石蠟到入包埋盒，冷卻后取出，修塊。第十九頁(yè)，共55頁(yè)。4.石蠟切片的制作（1）載玻片涂片的制作

防脫片劑：3-氨基丙基三乙氧基硅烷（3-aminopropyltriethoxysilane,APES）、多聚賴(lài)氨酸（Poly-L-lysine）、甲醛-甘油明膠。

APES

涂片的制作

原理：APES是一種新型玻片粘附劑，與一般的粘附劑不同，它是通過(guò)對(duì)玻璃表面起化學(xué)修飾作用，改變其表面的化學(xué)物理特性，使組織切片牢固地貼于玻璃片上，不易脫落，保留時(shí)間較久。

具體操作方法：

將載玻片用酸處理后，用95%酒精浸泡，再用綢布擦干，清除表面的污漬；

第二十頁(yè)，共55頁(yè)。將干凈的載玻片放入丙酮內(nèi)5min；將載玻片用鑷子夾住浸入APES試劑（1mlAPES+50ml丙酮）1～

2次；純丙酮內(nèi)洗2次后，37oC過(guò)夜，干燥；用鋁箔包好，室溫下存放，可存放半年。多聚賴(lài)氨酸（Poly-L-lysine，PLL）試劑配制：PLL0.5g+蒸餾水100ml

也可根據(jù)提供的方法配制?？捎?oC或～20oC保存?zhèn)溆茫煞磸?fù)凍存，效果無(wú)明顯影響。涂片前將其稀釋10～

50倍，均勻涂在處理后干凈的載玻片上，37oC下干燥過(guò)夜。第二十一頁(yè)，共55頁(yè)。甲醛-甘油明膠試劑：40%甲醛2.5ml，明膠0.5g，蒸餾水加至100ml。配制方法：用一部分蒸餾水（約80ml）加熱溶解明膠，待完全溶化后加入甲醛，最后補(bǔ)充蒸餾水至

100ml，混勻即可。粘附切片的效果較上述兩種方法差，特別是切片經(jīng)抗原熱修復(fù)或酶消化后，有時(shí)易脫片。（2）制做切片切片機(jī)：旋轉(zhuǎn)式或滑動(dòng)式切片機(jī)。切片厚度：5-7m。展片：切片放入玻璃平皿中的溫水中展開(kāi)切片（水浴鍋上加熱平皿）。撈片：用涂有防脫片劑的載玻片撈取切片。切片干燥：

37oC過(guò)夜，干燥。第二十二頁(yè)，共55頁(yè)。5．石蠟切片的脫臘及水化

脫蠟：將切片放入染色筐中，二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ

各15分鐘脫臘，水化：100%酒精Ⅰ、Ⅱ中各10分鐘、95%ALC5分鐘、90%ALC5分鐘、80%ALC5分鐘、70%ALC5分鐘，蒸餾水浸洗。6．清除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性

由于常規(guī)免疫組織化學(xué)染色的最后顯色是用辣根過(guò)氧化物酶

(horseradishperoxidase,HRP)和DAB(3,3-diaminobenzidinetetrahydrochloride)，而組織中常含有內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，為防止出現(xiàn)假陽(yáng)性反應(yīng)和減少背景染色，需要先清除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性。

第二十三頁(yè)，共55頁(yè)。具體方法：將切片置入甲醇(PBS)-H2O2液中20~30分鐘試劑：純甲醇99ml30%+H2O21ml充分混勻，使最后濃度為0.3%，或0.01mlPBS(pH7.2~7.4)99ml+30%H2O21ml7．PBS洗滌切片經(jīng)甲醇—H2O2或PBS—H2O2處理后的切片先用蒸餾水洗一次5min，再用PBS洗5min×3次。

0.01mol/LPBS(pH7.2~7.4)的配制：

NaH2PO42H2O0.45gNa2HPO412H2O3.23gNaCl8.0g

蒸餾水加至1000ml為防止抗體與組織發(fā)生靜電吸附而產(chǎn)生非特異性染色，可在PBS中加入Tween20#，制成含0.1%Tween20#的PBS。Tween20#為一種除污劑，可清除和封閉組織中的靜電荷。第二十四頁(yè)，共55頁(yè)。

8．抗原修復(fù)（antigenretrieval,AR）

某些抗原的免疫組化染色不需要此步驟即可染色，如橫紋肌中的myoglobin(Mb)、actin、myosin、腦組織中的S-100蛋白、GFAP、血型抗原A、B、H、生長(zhǎng)激素(growthhormone)、胰島素、波形蛋白(vimentin)、降鈣素(calcitonin)等。但有一部分抗原物質(zhì)或檢測(cè)的因子等由于組織經(jīng)甲醛固定后，因蛋白質(zhì)的交聯(lián)，將抗原封閉或發(fā)生變性，因此需要熱修復(fù)或蛋白酶消化。目前機(jī)理不清楚，但是以高溫、高壓對(duì)常規(guī)固定的石蠟切片進(jìn)行抗原修復(fù)處理經(jīng)驗(yàn)表明，可以提高抗原抗體陽(yáng)性檢測(cè)率，同時(shí)也會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性。尤其對(duì)原來(lái)僅表達(dá)在冰凍切片上的抗原，經(jīng)抗原修復(fù)后大部分抗體能用于常規(guī)甲醛固定的石蠟切片上。第二十五頁(yè)，共55頁(yè)。（1）抗原熱修復(fù)

方法①微波中96℃10~20min②直接加熱法100℃10min③高壓鍋/消毒鍋120℃10min

其他：水浴鍋100℃10min×2及真空加熱10min等。

熱修復(fù)的介質(zhì)

①0.01mol/LpH6.0檸檬酸緩沖液②0.05mol/LTris-HCl緩沖液(pH1~12)③0.01mol/LpH7.0PBS④2%硫酸鋁⑤2%硝酸鉛⑥生理鹽水⑦蒸餾水

溶液的摩爾濃度對(duì)修復(fù)效果無(wú)任何影響，而pH值則影響較大，緩沖液以檸檬酸緩沖液和Tris-HCl緩沖液較常用。

第二十六頁(yè)，共55頁(yè)。

溫度與修復(fù)時(shí)間的關(guān)系：許多的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：溫度高修復(fù)時(shí)間短，如Ki-67和P-gp的檢測(cè)，利用同一切片，達(dá)到相同染色結(jié)果需要：①100℃20min；②90℃30min；③80℃50min；④70℃20h

操作流程①微波處理：將切片插入25片塑料架上，在250ml塑盒內(nèi)加入200ml緩沖液，將微波高檔加溫緩沖液至90℃+，取出后自然冷卻至室溫后蒸餾水洗，PBS洗。②水浴鍋法：一種傳統(tǒng)的抗原修復(fù)方法，首先調(diào)節(jié)水溫達(dá)

95℃左右，將切片置入內(nèi)含200ml緩沖液的塑料盒或燒杯內(nèi)，放入水浴鍋，溫度平衡后開(kāi)始計(jì)算時(shí)間20min，取出容器后自然冷卻到室溫。③壓力鍋法：不銹鋼高壓鍋內(nèi)加入一定量的緩沖液，加熱鍋使液體煮沸，將切片加入切片架并置入鍋內(nèi)，蓋上鍋蓋，不加閥，開(kāi)始冒氣計(jì)時(shí)50min，關(guān)閉氣閥，使之加壓10min。再將壓力鍋置于流水槽中沖洗10min，冷卻后取出切片，PBS洗。第二十七頁(yè)，共55頁(yè)。

最佳修復(fù)方法的選擇

選擇最佳的修復(fù)方法設(shè)計(jì)表

檸檬酸BufferpH12pH6pH10-11Tris-HClBufferpH12pH7-8pH10-11微波100℃10min×2slide1slide2slide3壓力鍋120℃10minslide4slide5slide6微波或水浴90℃30minslide7slide8slide9slide10作對(duì)照，不作任何處理

第二十八頁(yè)，共55頁(yè)。

抗原熱修復(fù)應(yīng)注意的問(wèn)題

有些抗體在石蠟或冰凍切片上呈陰性反應(yīng)，但石蠟切片用抗原修復(fù)后卻能很好顯示，對(duì)某些應(yīng)表達(dá)在胞漿或膜上的抗原，經(jīng)修復(fù)后，絕大部分表達(dá)在核內(nèi)。而有些表達(dá)在核內(nèi)的抗原經(jīng)修復(fù)后會(huì)出現(xiàn)在胞漿內(nèi)，因此，在使用該方法時(shí)一定要小心，對(duì)結(jié)果的判定也要做出客觀的分析，同時(shí)在操作過(guò)程中還注意以下問(wèn)題：

第二十九頁(yè)，共55頁(yè)。①熱處理后應(yīng)自然冷卻切片。②不能煮干修復(fù)液。③不要任何抗原的檢測(cè)都使用該方法。④一批抗原的檢測(cè)其溫度和時(shí)間應(yīng)保持一致。⑤一般經(jīng)高溫修復(fù)后胞漿無(wú)明顯的破壞，但對(duì)細(xì)胞核的影響較大，會(huì)出現(xiàn)核破裂，蘇木素淡染現(xiàn)象。⑥如果在常用的緩沖（修復(fù)）液中無(wú)法實(shí)現(xiàn)抗原修復(fù)，得不出好的染色結(jié)果，或經(jīng)修復(fù)后，抗原定位發(fā)生改變，可改用一些不常用的緩沖液或加一些鰲合劑，如EDTA或EGTA等可能取得較好的效果。第三十頁(yè)，共55頁(yè)。

（2）蛋白酶消化法原理：蛋白酶消化可以去除覆蓋在抗原決定簇表面的雜蛋白，更為重要的是因甲醛固定而引起的交聯(lián)被酶消化打開(kāi)而引起暴露抗原決定簇的作用，使第一抗體能與抗原部分結(jié)合，提高陽(yáng)性檢測(cè)率。注意事項(xiàng)：用于IHC切片消化的酶有多種，所選擇酶的種類(lèi)、使用的濃度、pH值、消化時(shí)間及溫度等均要視組織固定的不同、所檢測(cè)抗原的性質(zhì)、組織類(lèi)型的不同而異，通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定。第三十一頁(yè)，共55頁(yè)。常用的消化酶類(lèi)：胰蛋白酶和蛋白酶K：檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)抗原切片的消化，如Keratin、CEA、GFAP等。

胃蛋白酶：細(xì)胞間質(zhì)抗原檢測(cè)切片的消化，如纖連蛋白(fibronectin)，各型膠原等。消化時(shí)間及溫度：一般消化時(shí)間與組織固定的長(zhǎng)短呈正比。蛋白酶的消化時(shí)間5~10~20min，視切片固定時(shí)間的長(zhǎng)短而定。第三十二頁(yè)，共55頁(yè)。（3）酶消化液的配制

除了商業(yè)銷(xiāo)售的成品，可按說(shuō)明書(shū)使用外，還可自行配制。

①0.1%胰蛋白酶胰蛋白酶0.1g0.1%氯化鈣(pH7.8)100ml

配制方法：先配制0.1%的CaCl2，用0.1mol/L的NaOH將其pH調(diào)至7.8，然后加入胰蛋白酶0.1g，溶解之。用前將胰蛋白酶液過(guò)濾，并在水浴中預(yù)熱至37℃，室溫下消化時(shí)間5~30min，多用于細(xì)胞內(nèi)抗原的暴露。。第三十三頁(yè)，共55頁(yè)。②0.4%胃蛋白酶

胃蛋白酶400mg0.1NHCl100ml

多用于間質(zhì)組織免疫組化染色切片的消化，37℃下消化時(shí)間約30min。③0.06%蛋白酶K

蛋白酶K0.06g0.05mol/LTris-HCl(PH7.5)100ml

用法同上。在免疫組化染色中，有時(shí)經(jīng)過(guò)度固定的標(biāo)本，影響一抗與抗原的結(jié)合，用蛋白酶溶液消化，起到暴露抗原部分的作用。消化時(shí)間應(yīng)根據(jù)不同組織而異?？傊诒３纸M織形態(tài)不破壞的前提下，宜盡量消化時(shí)間延長(zhǎng)。以上三種酶消化液，以第一種最為常用。第三十四頁(yè)，共55頁(yè)。

9.經(jīng)熱修復(fù)抗原或蛋白酶消化的切片經(jīng)洗滌后進(jìn)行下一步。10.用與制備二抗相同的動(dòng)物非免疫血清孵育切片防止一抗的非特異性吸附。

組織中非抗原抗體反應(yīng)出現(xiàn)的陽(yáng)性染色稱(chēng)為非特異性背景染色。最常見(jiàn)的原因是蛋白(第一抗體)吸附于高電荷的膠原和結(jié)締組織成分上。最有效的方法是在用第一抗體孵育切片前，用與制備第二抗體相同動(dòng)物的非免疫血清封閉組織上帶電荷基團(tuán)，而除去與第一抗體的非特異性結(jié)合(在室溫下進(jìn)行)。

非免疫血清的稀釋度1:5~1:20，還可加入BSA(bovineserumalbumin)使稀釋后的非免疫血清中含0.1~6%的BSA，可取得更佳的染色效果，阻止非特異性背景染色。該方法是減少非特異性背景染色的有效方法。第三十五頁(yè)，共55頁(yè)。11．用特異性一抗孵育切片

研究組織細(xì)胞中的某種抗原是否存在，應(yīng)用免疫組化染色，就要選用針對(duì)這種抗原的特異性抗體?，F(xiàn)在國(guó)際上有許多公司生產(chǎn)免疫組化試劑，包括一抗、二抗、顯色劑，并制成了成套的試劑盒，但一般試劑盒中不包括一抗，研究者可根據(jù)一抗的種屬性，選擇含有與一抗相匹配的二抗的試劑盒。

①一抗的種屬來(lái)源

一抗可來(lái)源于各種種屬的動(dòng)物，常見(jiàn)是來(lái)自家兔、山羊或小鼠，偶見(jiàn)來(lái)自馬。一般來(lái)自家兔和山羊的一抗都是多克隆的IgG抗體，而來(lái)自小鼠的多是單克隆的IgG抗體。根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物或標(biāo)本種屬的不同，選擇針對(duì)大鼠、小鼠或人的抗體。第三十六頁(yè)，共55頁(yè)。

②抗體劑型及滴度檢驗(yàn)

我國(guó)現(xiàn)在使用的多數(shù)抗體等試劑是由國(guó)外進(jìn)口，包括一抗和含二抗的試劑盒。國(guó)外生產(chǎn)的一抗一般濃度都是100-200g/ml，但國(guó)內(nèi)各經(jīng)銷(xiāo)商將進(jìn)口的原裝抗體又進(jìn)行了分裝，如分成瓶等，也經(jīng)銷(xiāo)1ml/瓶抗體，價(jià)格各不相同。國(guó)內(nèi)各經(jīng)銷(xiāo)商又根據(jù)需要將進(jìn)口抗體進(jìn)行稀釋?zhuān)N(xiāo)售的品種又分為即用型和濃縮型(進(jìn)口原裝的抗體)兩種。在免疫組化染色中，使用即用型一抗和試劑盒一般不需稀釋?zhuān)苯釉谇衅系渭蛹纯?。濃縮型必須在稀釋后才能使用，因?yàn)闈饪s型抗體濃度高，可引起嚴(yán)重的非特異性染色，因此，必須在正式染色前先用切片對(duì)不同滴度的抗體染色效果進(jìn)行評(píng)價(jià)，選擇濃度強(qiáng)度最好，非特異性反應(yīng)（背景染色）最低的抗體稀釋度來(lái)進(jìn)行正式染色。

第三十七頁(yè)，共55頁(yè)。③一抗體的稀釋

一般稀釋一抗的液體與洗滌切片的液體相同，即0.01mol/LPBSpH7.2～

7.4，為進(jìn)一步保證減少背景染色，用于稀釋一抗的PBS中也應(yīng)加入制備二抗的同種動(dòng)物的非免疫正常血清，有條件的還可加入BSA，兩者的濃度在1～

2～

5%即可。④一抗的孵育時(shí)間及條件

加入適當(dāng)稀釋的一抗的切片，可在常溫下或37℃下保溫盒內(nèi)孵育。經(jīng)過(guò)正常二抗同種動(dòng)物非免疫血清孵育后的切片不能用PBS洗滌，在去除多余的非免疫血清后，直接向切片上滴加稀釋好的第一抗體。孵育時(shí)間：30-60分鐘或更長(zhǎng)。如果待檢的抗原量很少，而增加一抗的濃度又能引起較明顯的背景染色，可增加一抗的稀釋倍數(shù)，將切片放在保濕盒中置于4℃冰箱內(nèi)過(guò)夜孵育，可達(dá)到滿意的效果。

第三十八頁(yè)，共55頁(yè)。12．PBS洗滌切片

將用一抗孵育后的切片用PBST洗滌3次，每次5min，用冷PBS洗滌，可減少非特異性反應(yīng)。13．用針對(duì)一抗的生物素化二抗孵育切片

根據(jù)一抗的種屬來(lái)源，選擇相應(yīng)的二抗。如：一抗是家兔抗某種抗原抗體，二抗一般選用山羊抗家兔IgG抗體。二抗分濃縮型和即用型兩種。即用型二抗不需稀釋?zhuān)苯邮褂?。濃縮型者一般用PBS直接以1:200～400倍稀釋使用，室溫下保濕盒內(nèi)孵育30～

60min。試劑盒：濃縮型或即用型SP試劑盒、ABC試劑盒試劑盒中包含：內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷劑二抗的同種動(dòng)物非免疫血清生物素標(biāo)記的抗IgG抗體（二抗）

SP試劑

[ABC試劑（單獨(dú)購(gòu)買(mǎi)）]第三十九頁(yè)，共55頁(yè)。14．PBS洗滌切片5min×3次15．滴加SP試劑或ABC試劑（1）生物素-抗生物素染色（ABC或SP法）的顯色原理

ABC法的染色原理

很早以前研究者就注意到給動(dòng)物飼以大量的雞蛋白，會(huì)引起明顯的“維生素H缺乏癥”，也稱(chēng)為“蛋白質(zhì)傷害”。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，在雞蛋白中含有一種堿性蛋白，分子量為68kD，屬于糖蛋白，當(dāng)時(shí)命名為卵白素（avidin）。機(jī)體中還有一種物質(zhì)叫生物素（biotin），又稱(chēng)維生素H，是一種小分子的維生素，廣泛分布于動(dòng)植物組織中，以輔酶的形式參與各種羥化酶反應(yīng)，分子量為244D。第四十頁(yè)，共55頁(yè)。

卵白素具有4個(gè)同生物素（維生素H）親和力極高的結(jié)合點(diǎn)。給動(dòng)物飼以大量的雞蛋白所致的維生素H缺乏，就是由于卵白素和大量維生素H結(jié)合所致。研究者根據(jù)這兩種物質(zhì)的特點(diǎn)，提出了卵白素-生物素免疫染色系統(tǒng)。由于習(xí)慣上將維生素H稱(chēng)為生物素，為便于理解，我國(guó)免疫細(xì)胞化學(xué)作者將卵白素稱(chēng)為抗生物素或親和素，因此卵白素-生物素免疫染色系統(tǒng)又稱(chēng)為抗生物素-生物素免疫染色法。

生物素的另一特點(diǎn)是它可以和抗體IgG的Fc段結(jié)合，不影響IgG的活性。同時(shí)，生物素經(jīng)活化后還可同過(guò)氧化物酶或ALP等結(jié)合，而不影響酶的活性。根據(jù)上述這些抗生物素-生物素的反應(yīng)原理和特性，1981年許世明設(shè)計(jì)出了免疫組織化學(xué)染色的ABC法（avidin-biotinperoxidasecomplexmethod，

ABC

），并已制成了商品化的試劑盒。第四十一頁(yè)，共55頁(yè)。

ABC法免疫組化的試劑盒中除包括制備二抗的同一種屬動(dòng)物的非免疫血清、生物素標(biāo)記的二抗外，還包括：A試劑(抗生物素)和B試劑(生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物)。在使用前半小時(shí)，將兩種試劑按說(shuō)明書(shū)要求相互混合，形成復(fù)合物，一般是在5ml的PBS中加一滴A試劑(約50l)，混勻后再加一滴B試劑(約50l)，混勻，半小時(shí)后加至經(jīng)過(guò)生物素標(biāo)記的二抗孵育的切片上，室溫下保濕盒內(nèi)孵育30-60分鐘。

第四十二頁(yè)，共55頁(yè)。

SABC法的染色原理及特點(diǎn)

(1)基本原理

鏈酶親和素是一種從鏈霉菌培養(yǎng)物中提取的蛋白質(zhì)，分子量60kD，不含糖鏈，等電點(diǎn)PI6.0。與親和素（卵白素）相同也有四個(gè)生物素結(jié)合點(diǎn)，親和力極高。與親和素相比是一種更近于完美的生物素結(jié)合蛋白。鏈酶親和素（鏈霉卵白素）同一定濃度的生物素化酶混合后，就能形成鏈酶卵白素-生物素-酶復(fù)合物。這種復(fù)合物中至少存在一個(gè)尚未被生物素占據(jù)的親和素結(jié)合位點(diǎn)，可以和各種生物素標(biāo)記的抗體結(jié)合。這種復(fù)合物即是SABC(streptavidin-biotincomplex)。

(2)SABC的特點(diǎn)

高敏感性；低背景；簡(jiǎn)便快速；結(jié)果穩(wěn)定第四十三頁(yè)，共55頁(yè)。

SP法的染色原理基本原理與ABC法相似，但與ABC法稍有不同，是采用生物素標(biāo)記的第二抗體與鏈霉卵白素連接的過(guò)氧化物酶及基質(zhì)素混合液來(lái)測(cè)定細(xì)胞和組織中的抗原。第四十四頁(yè)，共55頁(yè)。

第三節(jié)免疫組化染色的對(duì)照設(shè)置

在進(jìn)行免疫組化染色時(shí)，必須證實(shí)組織內(nèi)顯示的反應(yīng)產(chǎn)物，確實(shí)是抗原與相應(yīng)的特異性抗體反應(yīng)所產(chǎn)生的。由于免疫組織化學(xué)染色中影響抗原、抗體和免疫反應(yīng)的因素很多，因此對(duì)免疫組織化學(xué)染色結(jié)果的評(píng)價(jià)必須設(shè)置對(duì)照組才能做出正確的判斷。常用的對(duì)照組有以下幾種：

第四十五頁(yè)，共55頁(yè)。

一、陽(yáng)性對(duì)照

用已證實(shí)含用待測(cè)抗原的組織，與待檢標(biāo)本做同樣處理后，進(jìn)行免疫組化染色，結(jié)果應(yīng)為陽(yáng)性，稱(chēng)為陽(yáng)性對(duì)照。每次實(shí)驗(yàn)都應(yīng)做陽(yáng)性對(duì)照，通過(guò)陽(yáng)性對(duì)照可證明靶抗原有一定活性，染色過(guò)程中各個(gè)步驟以及所用的試劑都合乎標(biāo)準(zhǔn)，染色方法可靠。特別是當(dāng)待檢的標(biāo)本為陰性結(jié)果時(shí)，陽(yáng)性對(duì)照呈陽(yáng)性反應(yīng)，可排除待檢標(biāo)本假陽(yáng)性的可能。所以若預(yù)期染色結(jié)果是陰性時(shí)，就必須設(shè)陽(yáng)性對(duì)照。第四十六頁(yè)，共55頁(yè)。

二、陰性對(duì)照

用確知不存在待檢抗原的組織切片染色，結(jié)果為陰性。陰性對(duì)照可證實(shí)組織內(nèi)若不含靶抗原，就不應(yīng)染色，可排除在染色過(guò)程中由于非特異性染色或交叉反應(yīng)等因素造成的“假陽(yáng)性”結(jié)果。三、空白對(duì)照

是最常用的對(duì)照，用不加一抗的緩沖液，如PBS替代一抗，染色結(jié)果應(yīng)為陰性，說(shuō)明染色方法可靠，可排除組織的內(nèi)源性過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶、自發(fā)熒光等物質(zhì)引起的非特異性顯色。第四十七頁(yè)，共55頁(yè)。

四、替代對(duì)照

用與第一抗體來(lái)源的同一動(dòng)物免疫前血清，如第一抗體用的是兔抗人GFAP的IgG抗體，對(duì)照中用非免疫性的正常兔IgG血清來(lái)替代一抗，以相同的稀釋倍數(shù)進(jìn)行對(duì)照染色。這可證明待檢切片中陽(yáng)性結(jié)果不是抗體以外混雜的血清成分所致，而是所用特異性抗體與組織細(xì)胞內(nèi)待檢抗原的特異性反應(yīng)的結(jié)果。但使用的商品抗體往往不能用同一種動(dòng)物的免疫前血清做替代對(duì)照，也可用未經(jīng)免疫的同種動(dòng)物血清，即非免疫血清替代一抗。第四十八頁(yè)，共55頁(yè)。

五、吸收試驗(yàn)對(duì)照

用過(guò)量已知相應(yīng)的純化抗原與第一抗體反應(yīng)，抗體結(jié)合