總大腸菌群檢驗(yàn)法

2.總大腸菌群2.1多管發(fā)酵法范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了用多管發(fā)酵法測(cè)定生活飲用水及其水源水中的總大腸菌群。本標(biāo)準(zhǔn)適用于生活飲用水及其水源水中總大腸菌群的測(cè)定。術(shù)語(yǔ)和定義以下術(shù)語(yǔ)和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)?？偞竽c菌群系指一群在37P培養(yǎng)24h能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌。該菌群主要來源于人畜糞便，具有指標(biāo)菌的一般特征故以此作為糞便污染指標(biāo)評(píng)價(jià)飲水的衛(wèi)生質(zhì)量。水中總大腸菌群數(shù)系以1mL水樣中總大腸菌群最可能數(shù)(MPN)表示。培養(yǎng)基與試劑乳糖蛋白胨培養(yǎng)液成份A蛋白胨10gB牛肉膏3gC乳糖5gD氯化鈉5gE溴甲酚紫乙醇溶液(16g/L)1mLF蒸餾水10mL制法將蛋白胨、牛肉膏、乳糖及氯化鈉溶于蒸餾水中，調(diào)整pH為7.2?7.4,再參加1mL16g/L的溴甲酚紫乙醇溶液，充分混勻，分裝于裝有倒管的試管中，68.95Kpa(115C10lb高壓滅菌20min，貯存于冷暗處備用。二倍濃縮乳糖蛋白胨培養(yǎng)液按上述乳糖蛋白胨培養(yǎng)液(2.1.3.除蒸餾水外，其它成份量加倍。伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基成份A蛋白胨10gB乳糖10gC磷酸氫二鉀2gD瓊脂20?30gE蒸餾水10mLF伊紅水溶液(20g/L)20mLG美藍(lán)水溶液(5g/L)13mL制法將蛋白胨、磷酸鹽和瓊脂溶解于蒸餾水中，校正pH為7.2參加乳糖，混勻后分裝，以68.95Kpa(115C10lb高壓滅菌20min。臨用時(shí)加熱融化瓊脂，冷至50?55C，參加伊紅和美藍(lán)溶液，混勻，傾注平皿。革蘭氏染色液結(jié)晶紫染色液A成份a結(jié)晶紫1gb乙醇〔(C2H5OH)=95%〕20mLc草酸銨水溶液（10g/L）80mLB制法：將結(jié)晶紫溶于乙醇中，然后與草酸銨溶液混合。注：結(jié)晶紫不可用龍膽紫代替，前者是純品，后者不是單一成份，易出現(xiàn)假陽(yáng)性。結(jié)晶紫溶液放置過久會(huì)產(chǎn)生沉淀，不能再用。革蘭氏碘液A成份a碘1gb碘化鉀2gc蒸餾水3mLB制法：將碘和碘化鉀先進(jìn)展混合，參加蒸餾水少許，充分振搖，待完全溶解后，再加蒸餾水。脫色劑：乙醇〔（C2H5OH）=95%〕。沙黃復(fù)染液A成份a沙黃0.25gb乙醇〔（C2H5OH）=95%〕10mLc蒸餾水90mLB制法：將沙黃溶解于乙醇中，待完全溶解后參加蒸餾水。2.1.3.4.染色法A將培養(yǎng)18?24h的培養(yǎng)物涂片。B將涂片在火焰上固定，滴加結(jié)晶紫染色液，染1min，水洗。C滴加革蘭氏碘液，作用1min，水洗。D滴加脫色劑，搖動(dòng)玻片，直至無紫色脫落為止，約30s，水洗。E滴加復(fù)染劑，復(fù)染1min，水洗，待干，鏡檢。儀器培養(yǎng)箱：36±TC。冰箱：0?4C。天平。顯微鏡。平皿：直徑為9cm。試管。分度吸管：1mL，10mL。錐形瓶。小倒管。2.1.4.1（載玻片。檢驗(yàn)步驟乳糖發(fā)酵試驗(yàn)取10mL水樣接種到10mL雙料乳糖蛋白胨培養(yǎng)液中，取1mL水樣接種到10mL單料乳糖蛋白胨培養(yǎng)液中，另取1mL水樣注入到9mL滅菌生理鹽水中，混勻后吸取1mL（即0.1mL水樣）注入到10mL單料乳糖蛋白胨培養(yǎng)液中，每一稀釋度接種5管。對(duì)已處理過的出廠自來水，需經(jīng)常檢驗(yàn)或每天檢驗(yàn)一次的，可直接種5份10mL水樣雙料培養(yǎng)基，每份接種10mL水樣。檢驗(yàn)水源水時(shí)，如污染較嚴(yán)重，應(yīng)加大稀釋度，可接種1,0.1,0.011＜至0.1,0.01,0.Lm每個(gè)稀釋度接種5管，每個(gè)水樣共接種15管。接種1mL以下水樣時(shí)，必須作10倍遞增稀釋后，取1mL接種，每遞增稀釋一次，換用1支1mL滅菌刻度吸管。將接種管置36±TC培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)24±2h，如所有乳糖蛋白胨培養(yǎng)管都不產(chǎn)氣產(chǎn)酸，則可報(bào)告為總大腸菌群陰性，如有產(chǎn)酸產(chǎn)氣者，則按以下步驟進(jìn)展。別離培養(yǎng)將產(chǎn)酸產(chǎn)氣的發(fā)酵管分別轉(zhuǎn)種在伊紅美藍(lán)瓊脂平板上，于36±1C培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)18?24h，觀察菌落形態(tài)，挑取符合以下特征的菌落：深紫黑色、具有金屬光澤的菌落，紫黑色、不帶或略帶金屬光澤的菌落，淡紫紅色、中心較深的菌落，作革蘭氏染色、鏡檢和證實(shí)試驗(yàn)。證實(shí)試驗(yàn)經(jīng)上述染色鏡檢為革蘭氏陰性無芽孢桿菌，同時(shí)接種乳糖蛋白胨培養(yǎng)液，置36±1C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24±2h，有產(chǎn)酸產(chǎn)氣者，即證實(shí)有總大腸菌群存在。結(jié)果報(bào)告根據(jù)證實(shí)為總大腸菌群陽(yáng)性的管數(shù)，查MPN檢索表，報(bào)告每1mL水樣中的總大腸菌群MPN值。稀釋樣品查表后所得結(jié)果應(yīng)乘稀釋倍數(shù)。如所有乳糖發(fā)酵管均陰性時(shí)，可報(bào)告未檢出總大腸菌群。表2-1用5份10mL水樣時(shí)，各種陽(yáng)性和陰性結(jié)果組合時(shí)的MPN5個(gè)10mL管中陽(yáng)性管數(shù)MPN00TOC\o"1-5"\h\z2.25.19.216.0>16表2-2大腸菌群(MPN)檢索表〔總接種量55.5mL，其中5份10mL水樣，5份1mL水樣，5份0.1mL水樣〕接種量，mL接種量，mLmL0mL1010.11010.112121014241026351038TOC\o"1-5"\h\z47104105910512010211040114111601261128013711310014911412015111151402041206021612180227122100239123120241112415025131251703061308031713110032913212033111331503413134170351513519040814011041914113TOC\o"1-5"\h\z04211142150431314317044151441904517145220509150130511115115052131521705315153190541715422055191552420053008201730111202930213203123031620414304202051630523210731011211931114TOC\o"1-5"\h\z21212312172131431320214173142321519315272209320142211232117222143222022317323242241932427225223253123012330172311433121232173322423320333282342233432235253353624015340212411734124242203422824323343322442534436245283454025017350252512035129252233523225326353372542935441255323554541352340117501314022150243403255035840430504764053650595TOC\o"1-5"\h\z410175103341121511464122651263413315138441436514110415425151304202252049421265217042232522944233852312042444524150425505251804302753079431335311104323953214043345533180434525342104355953525044034540130441405411704424754222044354543280444625443504456954543045041550240451485513504525655254045364553920454725541645581555>162.2濾膜法范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了用濾膜法測(cè)定生活飲用水及其水源水中的總大腸菌群。本標(biāo)準(zhǔn)適用于生活飲用水及其水源水中總大腸菌群的測(cè)定。術(shù)語(yǔ)和定義以下術(shù)語(yǔ)和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。總大腸菌群是指用孔徑為0.45叩的微孔濾膜過濾水樣，將濾膜貼在選擇性品紅亞硫酸鈉培養(yǎng)基上37T培養(yǎng)24h,能形成紫紅或紅色有金屬光澤的需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽胞桿菌。計(jì)數(shù)生長(zhǎng)在濾膜上的典型大腸菌群菌落數(shù)。水中總大腸菌群數(shù)系以1mL水樣中總大腸菌群菌落形成單位(CFU)表示。培養(yǎng)基與試劑品紅亞硫酸鈉培養(yǎng)基成份A蛋白胨10gB酵母浸膏5gC牛肉膏5gD乳糖10gE瓊脂15?20gF磷酸氫二鉀3.5gG無水亞硫酸鈉5g左右H堿性品紅乙醇溶液(50g/L)20mLI蒸餾水10mL儲(chǔ)藏培養(yǎng)基的制備先將瓊脂加到5mL蒸餾水中，煮沸溶解，于另5mL蒸餾水中參加磷酸氫二鉀、蛋白胨、酵母浸膏和牛肉膏，加熱溶解，倒入已溶解的瓊脂，補(bǔ)足蒸餾水至10mL，混勻后調(diào)pH為7.2?7.4,再參加乳糖，分裝，68.95Kpa(115C10lb高壓滅菌20min，儲(chǔ)存于冷暗處備用。平皿培養(yǎng)基的配制將上法制備的儲(chǔ)藏培養(yǎng)基加熱融化，用滅菌吸管按比例吸取一定量的50g/L的堿性品紅乙醇溶液置于滅菌空試管中，再按比例稱取所需的無水亞硫酸鈉置于另一滅菌試管中，加滅菌水少許，使其溶解后，置沸水浴中煮沸10min以滅菌。用滅菌吸管吸取已滅菌的亞硫酸鈉溶液，滴加于堿性品紅乙醇溶液至深紅色退成淡粉色為止，將此亞硫酸鈉與堿性品紅的混合液全部加到已融化的儲(chǔ)藏培養(yǎng)基內(nèi)，并充分混勻防止產(chǎn)生氣泡)，立即將此種培養(yǎng)基15mL傾入已滅菌的空平皿內(nèi)。待冷卻凝固后置冰箱內(nèi)備用。此種已制成的培養(yǎng)基于冰箱內(nèi)保存不宜超過兩周。如培養(yǎng)基已由淡粉色變成深紅色，則不能再用。乳糖蛋白胨培養(yǎng)液，同多管發(fā)酵法2.1.3.。1儀器.濾器。濾膜，孔徑0.45叩。抽濾設(shè)備。無齒鑷子。其他儀器同多管發(fā)酵法檢驗(yàn)步驟準(zhǔn)備工作濾膜滅菌：將濾膜放入燒杯中，參加蒸餾水，置于沸水浴中煮沸滅菌3次，每次15min。前兩次煮沸后需更換水洗滌2?3次，以除去殘留溶劑。濾器滅菌：用點(diǎn)燃的酒精棉球火焰滅菌。也可用蒸汽滅菌器103.43Kpa(121C15lb)高壓滅菌20min。過濾水樣用無菌鑷子夾取滅菌濾膜邊緣局部，將粗糙面向上，貼放在已滅菌的濾床上，固定好濾器，將1mL水樣如水樣含菌數(shù)較多，可減少過濾水樣量，或?qū)⑺畼酉♂?注入濾器中，打開濾器閥門，在負(fù)0.5大氣壓下抽濾。培養(yǎng)水樣濾完后，再抽氣約5s，關(guān)上濾器閥門，取下濾器，用滅菌鑷子夾取濾膜邊緣局部，移放在品紅亞硫酸鈉培養(yǎng)基上，濾膜截留細(xì)菌面向上，濾膜應(yīng)與培養(yǎng)基完全貼緊，兩者間不得留有氣泡，然后將平皿倒置，放入37P恒