臨床免疫學檢驗質量保證

第十九章臨床免疫學檢驗的質量保證第一節(jié)分析前質量控制第二節(jié)分析中質量控制第三節(jié)分析后質量控制第一頁，共58頁。目的要求掌握免疫學檢驗質量控制的有關概念及質量控制原則掌握標本的正確收集及處理熟悉常用免疫學檢驗的質量控制、室間質量評價了解質量保證、室內質控和室間質量評價之間的關系，免疫學質量控制的意義第二頁，共58頁。免疫學檢驗質量控制的有關概念1．質量保證（qualityassurance，QA）2．室內質量控制(internalqualitycontrol，IQC)3．室間質量評價(externalqualityassessment，EQA)第三頁，共58頁。免疫學檢驗質量控制的有關概念4．準確度（accuracy）5．精密度(precision)6．標準品（standardcharacter）7．質控物(質控品，qualitytestingmaterials)

第四頁，共58頁。質量保證：為一產(chǎn)品或服務項目、為滿足特定的質量要求而提供的具有充分可信性所進行的、有計劃和系統(tǒng)的措施第五頁，共58頁。室內質量控制：由實驗室工作人員采取一定的方法和步驟，連續(xù)評價本實驗室工作的可靠程度目的是監(jiān)測和控制本室常規(guī)工作的精密度，提高本室常規(guī)工作中批內、批間樣本檢驗的一致性，以確定測定結果是否可靠、可否發(fā)出報告的一項工作第六頁，共58頁。室間質量評價：為客觀比較一實驗室的測定結果與靶值的差異，由外單位機構采取一定的方法，連續(xù)、客觀地評價實驗室的結果，發(fā)現(xiàn)誤差并校正結果，使各實驗室之間的結果具有可比性這是對實驗室操作和實驗方法的回顧性評價，而不是用來決定實時的測定結果的可接受性

第七頁，共58頁。準確度：即待測物的測定值與其真值的一致性程度準確度不能直接以數(shù)值表示，通常以不準確度來間接衡量對一分析物重復多次測定，所得均值與其真值或參考靶值之間的差異亦即偏差，即為測定的不準確度

第八頁，共58頁。精密度：在一定條件下所獲得的獨立的測定結果之間的一致性程度與準確度一樣，精密度同樣也是以不精密度來間接表示測定不精密度的主要來源是隨機誤差，以標準差（SD）和/或變異系數(shù)（CV）具體表示SD或CV越大，表示重復測定的離散度越大，精密度越差，反之則越好

第九頁，共58頁。標準品(物)：指性質純正的己知含量或成分的物質，通常用以比較檢測未知的物質或成分標準品有WHO國際標準品和國家標準品第十頁，共58頁。質控物(品)：是用以校準物相同的介質制備的，具有較好的穩(wěn)定性和重復性其作用主要是控制儀器的穩(wěn)定性，以保證儀器、試劑、工作環(huán)境具高度的穩(wěn)定性第十一頁，共58頁。第一節(jié)分析前質量控制一、檢驗項目的申請二、患者準備三、標本的采集、傳送與保存四、影響分析前質量的因素第十二頁，共58頁。概述分析前程序，也稱為檢驗前程序，按時間順序，檢驗前程序始于臨床醫(yī)師提出申請，止于啟動分析檢驗程序。其步驟包括檢驗申請、患者準備、原始樣品采集、樣本轉運到實驗室、在實驗室內部傳遞及檢驗前標本的預處理的全部過程。第十三頁，共58頁。一、檢驗項目的申請要求：信息的規(guī)范性和完整性形式：電子、紙質、二者兼有或者口頭（必須在規(guī)定時間內補充電子或紙質的才能執(zhí)行）（一）申請單格式和填寫（二）檢驗項目的申請原則第十四頁，共58頁。（一）申請單格式和填寫患者信息：患者姓名、患者性別及年齡、臨床診斷、患者唯一性標示（住院號、門診號、病案號等）申請醫(yī)師信息：醫(yī)師姓名、科室、申請時間原始樣本信息：血液、尿液、腦脊液、胸腹水等第十五頁，共58頁。（二）檢驗項目的申請原則

應結合患者的病情選擇適合的檢驗項目1.針對性:檢測指標要符合臨床醫(yī)師的檢測目的2.有效性:對診斷疾病的敏感性和特異性3.時效性:結果回報的及時性4.經(jīng)濟性:避免增加患者經(jīng)濟負擔第十六頁，共58頁。二、患者準備醫(yī)護人員、樣本采集人員、檢驗技術人員應了解采集前患者的狀態(tài)要求和影響結果的非疾病因素將相關的要求和注意事項通過合適的途徑告知患者，以獲得患者的配合保證所采集標本能客觀真實反映當前的疾病狀態(tài)第十七頁，共58頁。三、標本的采集、傳送與保存標本的采集：可用作ELISA的標本十分廣泛，體液（如血清，血漿，各種積液），分泌物（如唾液）和排瀉物（如糞便，尿液）均可作為標本以測定其中的抗原或抗體成分，一般使用血清?！驑吮静杉瘯r應盡量避免溶血，因紅細胞破裂可釋放過氧化物酶活性物質干擾結果，可造成假陽性；◎長菌的標本同樣的道理易產(chǎn)生假陽性。第十八頁，共58頁。標本的采集◎抗凝不完全的標本因纖維蛋白原的干擾而造成假陽性，建議盡量不用抗凝血尤其是用肝素抗凝劑?！驑吮驹诒渲斜４鏁r間過長易導致血清IgG聚合，使間接法的試劑本底加深，一般血清置4℃冰箱5天內完成測試。如需保存一周以上則要-20℃冰凍保存，融解時應上下顛倒充分混勻，同時避免氣泡。◎ELISA的靈敏度>1ng/ml水平上,標本間的污染要盡量避免，尤其不應與生化試驗用同一管標本.最起碼應先做免疫后做生化。第十九頁，共58頁。標本的采集

采樣時間：晨起空腹

激素和治療藥物測定第二十頁，共58頁。三、標本的采集、傳送與保存?zhèn)魉团c保存：

標本的傳送過程中應保證標本的密閉、防震、防漏、防污染。第二十一頁，共58頁。四、影響分析前質量的因素檢驗前影響因素具有：復雜性隱蔽性不可控性責任不確定性第二十二頁，共58頁。第二節(jié)分析中質量控制分析中階段是指從標本前處理到標本檢測完成，形成報告結果的過程包括標本前處理、標本檢測還應包括檢測體系的建立、人員培訓、檢測系統(tǒng)的選擇和性能確認、室內質量控制和室間質量控制、實驗室間比對等內容分析中階段是決定檢驗結果正確、可靠的關鍵第二十三頁，共58頁。工作人員培訓特點：項目廣泛，技術眾多，既有手工操作，又有自動化儀器操作根據(jù)實際工作需要，建立定期培訓計劃，保證工作人員的技術能滿足臨床免疫檢驗的需求第二十四頁，共58頁。工作人員培訓◎熟悉檢測儀器的原理及性能；掌握數(shù)據(jù)處理的能力和質量控制知識?！蚰承┨厥忭椖康臋z測如抗HIV等需經(jīng)有關部門組織的專門培訓班，考試合格后持證上崗。第二十五頁，共58頁。檢驗系統(tǒng)性能確認定量檢測系統(tǒng)：精密度（批內、批間）準確度分析測量范圍臨床可報告范圍參考期間驗證第二十六頁，共58頁。定性檢測系統(tǒng)符合率（靈敏度特異度）驗證精密度（批內精密度批間精密度，即中間精密度）驗證檢出限驗證臨界值（cut-off值）驗證第二十七頁，共58頁。方法學性能驗證實驗方案實驗計劃實驗實施實驗報告第二十八頁，共58頁。標準操作規(guī)程的建立在免疫測定中，試劑準備、加樣、溫育、洗板、顯色和測定等每一步驟均可能對測定結果產(chǎn)生較大影響因此，需要將每個操作步驟標準化并形成“標準操作程序”（SOP），所有操作人員必須按照SOP進行試驗操作第二十九頁，共58頁。加樣◎在ELISA中一般有3次加樣步聚，即加標本，加酶結合物，加底物?！蚣訕討梦⒘恳埔浩鳎訕訕?按規(guī)定的量加入微孔板的1/3處避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡?！蛎看渭訕討鼡Q吸嘴，做到一人一吸頭，以免發(fā)生交叉污染;干吸頭預先在血清中抽吸三次。第三十頁，共58頁。加樣◎樣本稀釋，目的是為了減少非特異性反應，所以一定要先加稀釋液后加樣本，特別注意加樣后要在微量振蕩器上振蕩30秒鐘，同時注意防止液體溢出。如后面操作步驟中加二種以上試劑時均需振蕩混勻?！蛉缬玫纹康渭釉噭葘⒌纹繐u勻并擠去第一滴有氣泡的試劑后加樣。第三十一頁，共58頁。ELISA競爭法的本質：酶標抗體與樣本抗體在同樣體系中，與固相抗原競爭結合是等比例關系。正確的加樣：應該先將樣本與酶標抗體混合均勻，然后加入孔中反應。實際工作中

分開加第三十二頁，共58頁。分開加會造成先加入的先結合，與后加入者并不是公平競爭關系，也不符合等比例原則。特別是在放置時間過長，溫度過高的情況下，對結果的影響很大。有研究表明，2min后加入酶標抗體，由于標本比酶標抗體先結合了2min，因此可出現(xiàn)7.4%的假陽性。30min后再加，假陽性率高達57.4%。第三十三頁，共58頁。溫育在ELISA中一般有兩次抗原抗體反應，即加標本和加酶結合物后的顯色反應。溫育常采用的溫度有43℃、37℃、室溫和4℃（冰箱溫度）等。37℃是實驗室中常用的保溫溫度，也是大多數(shù)抗原抗體結合的合適溫度。第三十四頁，共58頁。洗滌洗滌在ELISA過程中雖不是一個反應步驟，但卻也決定著實驗的成敗。ELISA是靠洗滌來達到分離結合與未結合抗原抗體復合物及酶標記物的目的。同時洗滌也可將非特異吸附的蛋白質的干擾以及血球、細菌中的酶干擾清除掉。第三十五頁，共58頁。顯色和比色◎HRP催化底物的一步呈色反應，同樣需要一定的時間和溫度?！蛞欢ㄒ凑照f明書規(guī)定的時間溫度（一般為37°C，10-15分鐘）恒定反應后終止。◎顯色反應終止后應立刻比色（30分鐘內）。第三十六頁，共58頁。報告方式定性試驗國內外為便于統(tǒng)一計算，一律按S/C.O方式報告，S為標本A值，C.O即CutOff值（陽性判定值)◎夾心法和間接法以S/C.O≥1為陽性；◎竟爭法與中和法以S/C.O﹤1為陽性第三十七頁，共58頁。室內質量控制定量室內質量控制：L-J質量控制圖定性室內質量控制第三十八頁，共58頁。定性室內質量控制定性試驗的臨床意義在于是否檢出病原體，與檢出量無關，因此QC要保證：控制提供反應的儀器/系統(tǒng)的穩(wěn)定性（靈敏度和特異性）。檢出假陽性反應和假陰性反應（即符合率和一致性）。（保證檢測結果陽性就是陽性、陰性就是陰性）HOOK效應的監(jiān)控。第三十九頁，共58頁。質控物的選擇：質控物來源：均采用自制質控物質。濃度梯度的設置：（1）陰性質控：0.5倍CutOff值附近的陰性OD值（2）陽性質控：

弱陽性質控：2-4倍CutOff值附近的弱陽性OD值

陽性質控：試劑盒所帶陽性對照OD值第四十頁，共58頁。控制提供反應的儀器/系統(tǒng)的穩(wěn)定性建議采用弱陽性質控物作Levey-Jennings質控圖，橫坐標（X軸）表明的是檢測日期，縱坐標（Y軸）用吸光度值表示。旨在監(jiān)測和控制本室常規(guī)工作的精密度、靈敏度，提高批內批間樣本檢驗的一致性第四十一頁，共58頁。檢出假陽性反應和假陰性反應建議采用Westgard質控規(guī)則改良法對第三方陰性、弱陽性質控進行分析繪制中心線和上下失控限三條線，中心線為質控物測量均值，利用臨界值（cutoff值）驗證值確定上下失控限。第四十二頁，共58頁。監(jiān)控HOOK效應建議采用試劑盒中試劑盒所帶質控（陽性對照）的OD值作Levey-Jennings質控圖來監(jiān)控，橫坐標（X軸）表明的是檢測日期，縱坐標（Y軸）用吸光度值表示。判斷：當?shù)谌劫|控（陰性、弱陽性）均在控時，試劑盒所帶質控（陽性對照）下限超限，此時，應考慮HOOK效應的發(fā)生第四十三頁，共58頁。HOOK效應處理對策當監(jiān)控到HOOK效應的發(fā)生時，應在LIS系統(tǒng)上回顧病人結果，對可疑結果、陽性低值結果、在cut-off值附近的結果采用同步稀釋法進行重復試驗第四十四頁，共58頁。室間質量控制室間質量評價：為客觀比較一實驗室的測定結果與靶值的差異，由外單位機構采取一定的方法，連續(xù)、客觀地評價實驗室的結果，發(fā)現(xiàn)誤差并校正結果，使各實驗室之間的結果具有可比性這是對實驗室操作和實驗方法的回顧性評價，而不是用來決定實時的測定結果的可接受性第四十五頁，共58頁。室間質量控制室間質量控制實施途徑：室間質量控制可通過能力驗證實驗（簡稱PT）來實現(xiàn)PT是指多家實驗室分析同一標本并由外部獨立機構收集、反饋實驗室上報結果并評價實驗室檢測能力的活動國家級PT計劃，由衛(wèi)生部臨檢中心組織實施省級PT計劃，有省臨檢中心組織實施第四十六頁，共58頁。實驗室間比對和人員比對實驗室間比對是按照預先規(guī)定的條件，由兩個或多個實驗室對相同或類似檢測物品（通常是患者新鮮標本）進行檢測（主要針對一些不能參加室間質量控制的項目）人員比對是指實驗室為發(fā)現(xiàn)及糾正不同工作人員從事相同檢測項目而導致檢測結果存在可接受的偏倚而采取的措施第四十七頁，共58頁。實驗室環(huán)境、設施及設備的控制環(huán)境：室溫：18℃----25℃

濕度：30%---60%設施及設備:

輔助設備及儀器包括移液器（加樣槍），水浴箱（溫箱），洗板機和酶標儀。第四十八頁，共58頁。

輔助設備及儀器◎移液器：ELISA加樣量?。?-100ｕl），其準確性直接影響實驗結果，利用稱重法檢查：吸取刻度指示量的水，萬分之一天平稱重后計算吸量是否準確，一般應在±10%以內；◎水浴箱經(jīng)常檢查水浴箱溫度計所示的溫度和水中（或溫箱內）實測溫度是否一致，允許有±1℃的誤差；第四十九頁，共58頁。

輔助設備及儀器◎洗板機每個廠家設置洗板后的殘留液有各自的規(guī)定一般不超過3ul，人工扣板時，墊紙不濕，定期檢查管孔是否堵塞；◎酶標儀經(jīng)常維護其光學部分，防止濾光片霉變，定期檢測校正，使其保持良好的工作性能。第五十頁，共58頁。第三節(jié)分析后質量控制一、檢驗結果的審核和發(fā)放二、檢驗后標本的保存與處理三、咨詢服務第五十一頁，共58頁。一、檢驗結果的審核和發(fā)放報告的審核和發(fā)放制度：實驗室應制定報告審核和發(fā)放制度，審核應由相應資格的工作人員進行：信