植物細(xì)胞減數(shù)分裂

實(shí)驗(yàn)一植物細(xì)胞減數(shù)分裂一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1)掌握制備植物細(xì)胞減數(shù)分裂玻片標(biāo)本的技術(shù)和方法。(2)了解高等植物細(xì)胞減數(shù)分裂過程，觀察染色體的動態(tài)變化。二、實(shí)驗(yàn)原理分裂是生物在形成性細(xì)胞過程中的一種特殊方式的細(xì)胞分裂，在此過程中先由有性組織(花藥或胚珠)中的某些細(xì)胞分化為二倍性的小孢子母細(xì)胞或大孢子母細(xì)胞，這些細(xì)胞連續(xù)進(jìn)行兩次細(xì)胞分裂即減數(shù)第一次分裂和減數(shù)第二次分裂。結(jié)果一個小孢子母細(xì)胞形成4個小孢子．一個大孢子母細(xì)胞形成一個大孢子，它們都只具有單倍的染色體。減數(shù)分裂在遺傳上具有重要意義。性母細(xì)胞(2n)經(jīng)過減數(shù)分裂形成染色體數(shù)目減半的配子(n)。經(jīng)過受精作用．雌雄配子融合為合子，染色體數(shù)目恢復(fù)2n。這樣在物種延續(xù)的過程中確保了染色體數(shù)目的恒定，從而使物種在遺傳上具有相對的穩(wěn)定性。另外在減數(shù)分裂過程中包含有同源染色體的配對、交換、分離和非同源染色體的自由組合，這些都是遺傳學(xué)分離．自由組合和連鎖互換規(guī)律的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。在這些基本規(guī)律的作用之下，導(dǎo)致了各種遺傳重組的發(fā)生，而遺傳重組又是生物變異的重要源泉。在適當(dāng)?shù)臅r候采集植物的花蕾制備染色體標(biāo)本就可在顯微鏡下觀察到植物細(xì)胞的減數(shù)分裂。三、實(shí)驗(yàn)材料蠶豆(Vicia．faba，2n=12)花藥、玉米(Zeamays，2n=20)花藥、小麥(Triticumspp．2n=42)花藥、大蔥(Alliumfistulosum2n=16)花藥、桔(Citrussinensis2n=18)花藥、洋蔥(Alliumcepa2n=16)花藥、番茄(LycopersicumescuSentum2n=24)花藥。四、實(shí)驗(yàn)器具和藥品1．器具顯微鏡、鑷子、解剖針、載玻片、蓋玻片、大培養(yǎng)皿、酒精燈、吸水紙。2．藥品無水乙醇、醋酸洋紅染液、石蠟、二甲苯、固定液(甲醇：冰醋酸：3：1)、加拿大樹膠、正丁醇或叔丁醇。五、實(shí)驗(yàn)步驟1．取材在一朵花的減數(shù)分裂的全過程中能觀察染色體的時間是很短的，一般在終變期，中期I，后期I。因此，選取剛現(xiàn)蕾的花序是觀察花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂的關(guān)鍵步驟,要注意花蕾的形態(tài)和大小，適時選材。(1)玉米北方的玉米5月份取材，時間以上午8:30為好，夏玉米一般在7月份取材，以上午7:00一8:00為好,在玉米雌穗未抽出前的7—10天手摸植株上部(喇叭口下部)有松軟感覺，表明雄花序即將抽出。用刀在頂葉近喇叭口處縱向劃一刀，切口長10一15cm，剝出雄花序，頂端花藥長3—5mm，花藥尚未變黃時取材。(2)蠶豆：從現(xiàn)蕾開始，上午10:00—11:00可選取2—3mm大小的花莆或一小段花序。蠶豆開花的次序是由下而上，由外而內(nèi)。(3)小麥：在植株開始挑旗，旗葉與下一葉片的葉耳間距約為3一4Cm,花藥長度大致在1.5—2.0mm,黃綠色時取材最好。如花藥為綠色時取材則為時過早,花藥為黃色，則已過時。上午7:00一8:00為取材最佳時間。(4)大蔥：在北方地里越冬的大蔥，第二年春季3—4月長出花序，待花序長出，顏色呈綠色，花蕾長度在3～4mm，花藥長度為1—1.1mm時取材。上午9:00一10:00為最佳取材時機(jī)。(5)洋蔥：4—5月長出花序，同上。(6)番茄：5—9月均可取材，時間以上午8:30—9:30為好，花蕾以3—4mm為宜(番茄花期持續(xù)時間長，可隨時取材)。(7)桔：桔花吐蕾時,在上午8:00一12:00取3—9mm的花蕾為宜。2．固定通常制作幼小花藥壓片時，可不經(jīng)固定，直接放在醋酸洋紅染液中，同時進(jìn)行固定和染色，但是先經(jīng)固定的材料容易著色、分色及便于保存。固定時將采集的材料置于卡諾氏固定液12—24小時，若不及時制片，可將固定后的材料用70%的乙醇沖洗直至聞不為止，后放入70%乙醇中存于4℃冰箱內(nèi)，可隨時取用。3．染色制片用蒸餾水將從固定液或從70％酒精保存液中取出的花蕾沖洗數(shù)遍，然后剝開花雷，放在載玻片上，用解剖針及虹膜刀將花藥橫切成3—4段(或縱切)，加一滴醋酸洋紅染液于材料上，用解剖針輕壓花藥使花粉母細(xì)胞從切口出來，靜止染色5—10分鐘，除去花藥壁。加上蓋玻片使染液剛好布滿載玻片與蓋玻片之間成一薄層(不可過多，過多花粉母細(xì)胞會逸出蓋玻片邊緣)，加上蓋玻片后，在酒精燈上輕微加熱，以利于進(jìn)一步著色和染色體的分散。在蓋玻片上覆以吸水紙用拇指適當(dāng)加壓．把周圍的染液吸干(勿使蓋片移動)，若細(xì)胞質(zhì)染色過深，可在蓋玻片的一邊滴加45％的醋酸，在另一邊用吸水紙吸，讓醋酸蓋玻片下流過，減輕細(xì)胞質(zhì)的著色程度。到醋酸味從4．鏡檢在顯微鏡下查找花粉母細(xì)胞，二分體、四分體，花粉粒以及各個時期的細(xì)胞。5．永久片的制作較好的臨時壓片，可制成永久玻片標(biāo)本。(1)將已制好的玻片浸入副盛有95％乙醇和45G醋酸各半的培養(yǎng)皿中，有蓋玻片的一面朝下，載玻片的一端架在玻片棒上使其傾斜，蓋玻片脫落后立即把蓋玻片和載玻片轉(zhuǎn)入盛有95％乙醇的培養(yǎng)皿中3—5分鐘，再轉(zhuǎn)入盛有3一5分鐘進(jìn)行脫水、透明，脫水后用溶于叔丁醇的加拿大樹膠封片。(2)由于正丁醇價格較便宜，因此也可用正丁醇代替叔丁醇。操作過程是將制好的臨時95％乙醇和45X醋酸各半的培養(yǎng)皿中5一6分鐘，并滴加幾滴正丁醇，依次再移入95%乙醇中1一2分鐘；95%乙醇和正丁醇各半的培養(yǎng)皿中2—5分鐘；95％乙醇和叔丁醇各半的培養(yǎng)皿中3—5分鐘，最后純叔丁醇中玻片以同樣的方法浸入盛有純正丁醇1—2分鐘，最后吸去多余的正丁醇，用溶于正丁醇的加拿大樹膠封片。六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果細(xì)胞的減數(shù)分裂包括減數(shù)第一次分裂(減數(shù)分裂I)和減數(shù)第二次分裂(減數(shù)分裂Ⅱ)。1．減數(shù)分裂(1)前期I：細(xì)線期：體很細(xì)很長，呈細(xì)線狀在核內(nèi)交織成網(wǎng)。每一染色體含兩個單體，但顯微鏡下看不到雙線結(jié)構(gòu)．染色體呈絲狀結(jié)構(gòu)。偶線期：體的形態(tài)與細(xì)線期差別不大，同源體配對，形成二價有兩個著絲點(diǎn)，染色絲比細(xì)線期粗。粗線期：體螺旋化，進(jìn)一步縮短變粗，顯微鏡下可明單體。二價體由四個姊妹單體和兩個著絲粒組成，這時非姊妹單體間可能有交換的發(fā)生。雙線期：體進(jìn)一步螺旋化，變得更為粗短，更為清晰可見，二價色體相互分開出現(xiàn)交叉現(xiàn)象，呈“X”“V”“∞”“O”等形狀。終變期：體高度濃縮，體均勻分散在核膜附近。此時是檢查體數(shù)的最好時這時核內(nèi)有多少個二價體，說明有多少對同源體。I體，每個二價體顯看到每個體的兩個姊妹體中的兩條同源染期，核仁和核膜在前期I始終存在，在終變期時核仁、核膜開始消失。(2)中期I：核仁、核膜消失，二價體均勻排列在赤道面上，紡綞體形成，從紡綞體的側(cè)面看，一個個二價體就像一列橫隊(duì)排列在細(xì)胞中，質(zhì)中。這時也是染色體計數(shù)的好時(3)后期I：二價的體兩個同源體分開，由紡錘絲拉向兩極。染色體又變成了絲狀。(4)末期I：同源體分別到達(dá)細(xì)胞兩極．染色體變成了質(zhì)狀，核膜，核仁重新出從紡錘體的極面看，一個個二價體分散在細(xì)胞期?，F(xiàn)，形成兩個子核，每個子核染色體數(shù)目減半為n。同時細(xì)胞質(zhì)分開形成兩個子細(xì)胞叫二分體。2．減數(shù)分裂(1)前期Ⅱ：染色體呈線狀，每個染色體具兩個姊妹染色單體，共用一個著絲粒．二者間有明顯互斥作用(分開趨勢)。前期Ⅱ快結(jié)束時核(2)中期Ⅱ：染色體(3)后期Ⅱ：每個染色體(4)末期Ⅱ：移到兩I形成Ⅱ膜消失。排列在赤道面上，每條染色體有兩個染色單體和一個著絲粒。從著絲粒處分裂為二，分別向兩極移動。極的染色體解螺旋，出現(xiàn)核仁、核膜，形成單倍的子核，這時減數(shù)分裂的兩個單倍核形成四個單倍核，最后形成四個子細(xì)胞叫四分體。理想的植物細(xì)胞減數(shù)分裂玻片標(biāo)本在顯微鏡下可觀察到減數(shù)分裂各個時期的典型細(xì)胞。七、實(shí)驗(yàn)作業(yè)繪制觀察到的植物細(xì)胞減數(shù)分裂不同時期的典型細(xì)胞(示染色體動態(tài)特征)。實(shí)驗(yàn)二果蠅的形態(tài)和生活史一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1)了解果蠅生活史中各個階段的形態(tài)特征，觀察果蠅的幾種常見突變類型。(2)掌握鑒別雌雄果蠅的方法。(3)學(xué)會果蠅的飼養(yǎng)管理方法和實(shí)驗(yàn)處置技術(shù)。二、實(shí)驗(yàn)原理普通果蠅(Drosophilamelanogaster)是昆蟲綱，雙翅目，果蠅屬的一個種。具完全變態(tài)。果蠅每12天左右可完成一個世代，生活史較短，生長迅速；繁殖能力強(qiáng)，每只受精的雌蠅可產(chǎn)卵400—500個；培養(yǎng)果蠅的材料來源廣泛，價格便宜；果蠅的生活要求簡單，常溫下就可生長繁育，容易飼養(yǎng)；果蠅不同的形態(tài)突變類型多達(dá)400以上，便于觀察分析；并且染色體數(shù)目較少(2，l=8)，再加之果蠅唾液腺染色體巨大的特點(diǎn)，因此是遺傳學(xué)研究中常用的實(shí)驗(yàn)材料。三、實(shí)驗(yàn)材料野生型果蠅(雌、雄)及常見的幾種突變型果蠅；雌雄果蠅裝片四、實(shí)驗(yàn)器具和藥品1．器具：顯微鏡、雙筒解剖鏡、放大鏡、小鑷子、麻醉瓶、麻醉皿、培養(yǎng)瓶、白磁磚(15cm×15cm)、毛筆、酒精、石棉網(wǎng)、黑紙、膠水、牛皮紙、瓊脂、玉米粉、白糖、酵母、丙酸；果蠅卵、蛹裝片。。2．藥品：乙醚、乙醇、香蕉等。五、實(shí)驗(yàn)步驟1．果蠅生活史的觀察果蠅為完全變態(tài)，生活史包括卵、幼蟲、蛹、成蟲四個時期各時期持續(xù)時間的長短隨溫度的高低而不同，在20℃條件下從卵到成蟲約為8天，蛹期為天左右，整個生活史15天即可完成，若25C條件下，從卵到幼蟲約5天，蛹期4.2天左右，整個生活史約10天。20—25C是果蠅生。活的適宜溫度，溫度過高(30℃以上)，會引起果蠅不孕或死亡，溫度過低(10℃條件下)，生活史可長達(dá)57天，又會使果蠅生活力降低果蠅一般培養(yǎng)在恒溫箱內(nèi)．要注意降溫。雌性成體一般能生活4周，雄性成體壽命較短，一對親蠅能產(chǎn)生幾百個后代。(1)卵：羽化后的雌蠅一般在時，精子可由卵前端的錐形突出部的小孔或卵孔進(jìn)入其中，雖然有很多精子進(jìn)入卵．但一般情況下只有一個精子與卵發(fā)生受精作用。其它多余的精子被雌體貯藏起來(所以雜交實(shí)驗(yàn)時，6盛夏時12小時后開始交配，交配后兩天開始產(chǎn)卵，當(dāng)卵經(jīng)過子宮必須選取處女蠅，a受精卵被排出體外發(fā)育或胚胎早期就在子宮內(nèi)進(jìn)行。用解剖針將附有卵的培養(yǎng)基取少許涂于載玻片上，或用解剖針輕壓雌果蠅腹部后部把卵擠在載玻片上，用低倍鏡觀察。果蠅的卵約0.5mm長，橢圓形，腹面稍扁平，在背面的前端伸出一對觸絲，它的作用是使卵附在培養(yǎng)基表面而利于發(fā)育。(2)幼蟲：卵蟲體長約5mm，頭部稍尖，壁可見到一對生殖腺位于身體后半部的上方兩側(cè)，精巢較大，為一明顯的黑色斑點(diǎn)，卵巢較小。(3)蛹：幼蟲生活7—8天準(zhǔn)備化蛹，化蛹之前從培養(yǎng)基中爬出，在培養(yǎng)基的濾紙上逐漸形成一個梭形的蛹，在蛹前部有兩個呼吸孔，后部有尾芽，起初蛹?xì)ゎ伾S柔軟，經(jīng)3—4天后變成深褐色，以示要羽化了。孵化成幼蟲后要經(jīng)過兩次蛻皮才能從一齡幼蟲發(fā)育成為三齡幼蟲。三齡幼位于頭部的口器為肉眼可見一小黑點(diǎn)，口器后面有一對透明的唾液腺，通過體附著在干燥的瓶壁或插（4）成蟲：幼蟲在蛹?xì)?nèi)完成成蟲體型和器官的分化，最后從蛹?xì)で岸伺莱?。剛從蛹?xì)だ镉鸹龅墓?，蟲體較長大，翅還沒有展開，體表也未完全幾丁質(zhì)化，呈半透明乳白色，不久蠅體變?yōu)榇侄虣E圓形，雙翅伸展，體色加深，如野生型果蠅由開始的淺灰色轉(zhuǎn)為灰褐色。果蠅成蟲分頭、胸、腹蘭部分。頭部有一對大的復(fù)眼、三個單眼和一對觸角；胸部有三對足、一對翅和一對平衡棒；腹部背面有黑色環(huán)紋，腹面有腹片，外生殖器在腹部末端，全身有許多體毛和剛毛。2．果蠅雌雄性鑒別利用果蠅做雜交實(shí)驗(yàn)時，必須準(zhǔn)確地識別性別，雌雄成蠅的區(qū)別有計多方面，可用放大鏡，顯微鏡(低倍)、雙筒解剖鏡或直接從外形上加以辨認(rèn)。表5.1雌雄果蠅的主要區(qū)別雌蠅雄蠅體型較大腹部末端稍尖腹部背面有五條黑色環(huán)紋無性梳體型較小腹部末端稍圓腹部背面有三條黑色環(huán)紋有性梳腹部腹面有6個腹片腹部腹面有4個腹片外生殖器外觀復(fù)雜，在低倍鏡下可看到生殖孤、肛上板、陰基。外生殖器外觀簡單3．果蠅幾種突變類型的觀察果蠅的突變性狀一般情況下用肉眼觀察或用放大鏡在培養(yǎng)瓶外觀察或在解剖鏡下觀察。主要有以下穩(wěn)定而明顯的特征：表5.2果蠅常見突變性狀特征性狀特征突變性狀名稱白眼基因符所在染色體WB復(fù)眼白色X棒眼復(fù)眼橫條形X檀黑體黑體E體呈烏木色，黑亮體呈深色ⅢRⅡLXB黃身Y體吳淺橙黃色殘翅VgSnm翅退休，部分殘留不能飛ⅡR焦剛毛小翅剛毛卷曲如燒焦?fàn)畛彷^短XX4．果蠅的麻醉對于成蠅和果蠅突變性狀的觀察以及果蠅的雜交實(shí)驗(yàn)分析，都必須先將果蠅麻醉使其處于靜止?fàn)顟B(tài)后方可進(jìn)行。在一軟木塞上釘一圖釘，在圖釘上纏上脫脂棉，將此軟木塞蓋在一200ml的廣口瓶上，即做成了麻醉瓶。再用一培養(yǎng)皿，在皿的底部粘上一條濾紙即做成麻醉用的麻醉皿。麻醉時，首先將培養(yǎng)瓶倒置，讓果蠅向瓶底部運(yùn)動麻醉瓶和培養(yǎng)瓶塞，迅速將培養(yǎng)瓶和麻醉瓶口相接(麻醉瓶在下，培養(yǎng)瓶在上)，左手緊蓋好兩個瓶塞，或者置，使培養(yǎng)瓶在下，麻醉瓶在上，用黑紙遮住培養(yǎng)瓶，，然后打開握兩。瓶接口稍傾斜，然后輕拍培養(yǎng)瓶瓶壁使果蠅落入麻醉瓶內(nèi)，迅速在培養(yǎng)瓶與麻醉瓶對口相接后翻轉(zhuǎn)位果蠅因趨光向麻醉瓶運(yùn)動，達(dá)到一定數(shù)量后分別蓋好兩個瓶塞。把乙醚滴一分鐘后果蠅即處于昏迷狀態(tài)，將其傾倒在用酒精擦進(jìn)行觀察。當(dāng)在白磁磚在麻醉瓶軟木塞上的脫脂棉上，蓋上塞子，過的白磁磚上，用毛筆輕輕撥動濾紙上滴加乙醚上的果蠅即將蘇醒時，可在麻醉皿的，扣在白磁磚上進(jìn)行第二次麻醉,麻醉的程度隨實(shí)驗(yàn)需要而定。麻醉后果蠅翅外展與身體呈45℃角時，表示已麻醉過度，不能復(fù)蘇。把不需要的果蠅倒入盛有酒精瓶中。六、實(shí)驗(yàn)作業(yè)的(1)繪果蠅的生活史圖。(2)繪雌雄果蠅第一對足外形圖(示性梳)。(3)野生型(十)、檀黑體(e)、殘翅(vg)、白眼(w)、小翅(m)、焦剛毛(sn)，等突變類型進(jìn)行觀察，將觀察結(jié)果填入下表：類型野生型殘翅檀黑體小翅白眼焦剛毛特征體色（十）（vg）（c）（m）（w）（sn）眼色翅形剛毛形態(tài)實(shí)驗(yàn)三果蠅唾液腺染色體觀察一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1)練習(xí)剖取果蠅三(2)掌握制作果蠅唾液腺染色體(3)觀察果蠅唾液腺染色體齡幼蟲唾液腺的方法。標(biāo)本的技術(shù)。的形態(tài)特征。二、實(shí)驗(yàn)原理1881年意大利的細(xì)胞學(xué)家巴爾比尼(Balbiani)在雙翅目昆蟲搖蚊(chironmus)幼蟲的唾液腺細(xì)胞間期核中發(fā)現(xiàn)了一種巨大染色體，由于存在于唾液腺細(xì)胞。所以又稱為唾液腺染色體。1933年美國學(xué)者貝特恩(Painter)等又在果蠅和其它雙翅目昆蟲的幼蟲唾液腺細(xì)胞間期核中發(fā)現(xiàn)了巨大染色體。果蠅三齡幼蟲的唾液腺細(xì)胞處于永久早期，染色體解旋呈伸展?fàn)顟B(tài)。在幼蟲發(fā)育過程中細(xì)胞核中的DNA多次復(fù)制，但細(xì)胞、細(xì)胞核不分裂、復(fù)制后的染色細(xì)胞中同源染色體互相靠般體細(xì)胞中的染色體粗1000--2000倍，長100—200單體DNA也不分開，這種現(xiàn)象叫做核內(nèi)有絲分裂，從而形成了多線染色體。加之唾液腺攏在一起呈現(xiàn)一種聯(lián)會狀態(tài)，而使其比一倍。由于在唾液腺細(xì)胞中8條染色體之間以著絲粒連結(jié)在一和同源染色體之間的假聯(lián)會，經(jīng)堿性染料染色后，可以觀察到一個染色較深的染色色盤為中心向外輻射出的5條染色體臂。在這些染色體臂上可以看到染色深淺不同，被稱做明帶、暗帶的橫紋，這些橫紋的位置，寬窄、數(shù)目都具有物種的特異性，不同物種，不同染色體的不同部位形態(tài)位置是固定的，因此根據(jù)染色體各條臂帶紋特征和各條臂端部帶紋特征能準(zhǔn)確識別各條染色體臂上還可看到某些帶紋通過染色體的解旋、膨大形成的疏起形成染色盤或異染中心盤和以染。在染色體松區(qū)和巴爾比尼氏環(huán)，其富含轉(zhuǎn)錄出來的RNA，因此不著色，是基因活動的區(qū)域。在個體發(fā)育的不同階段，疏松區(qū)或巴爾比尼氏環(huán)在染色體上出現(xiàn)的部位不同，據(jù)此可以研究基因的表達(dá)，開展各種染色體變異的研究等等。三、實(shí)驗(yàn)材料普通果蠅(Drosophilamelanogaster)的三齡幼蟲。四、實(shí)驗(yàn)器具和藥品1．器具雙筒解剖鏡、顯微鏡、鑷子、解剖針、載玻片、蓋玻片、濾紙、培養(yǎng)皿、酒精燈。2．藥品醋酸洋紅染液、生理鹽水(O.7％NaCl)蒸餾水、固定液(冰醋酸：乙醇=3:1)、1m01／LHCl、乙醇(100％、95％)、二甲苯、加拿大樹膠。五、實(shí)驗(yàn)步驟1．材料準(zhǔn)備發(fā)育充足、肥大的三齡幼蟲，唾液腺和唾液腺細(xì)胞發(fā)育良好。利用這樣的唾液腺細(xì)胞才能制備出理想的染色體玻片標(biāo)本。因此要求培養(yǎng)基營養(yǎng)豐富，含水量較高，比較松軟，發(fā)酵良好。將果蠅放人培養(yǎng)瓶(果蠅不應(yīng)過多，半磅牛奶瓶件下培養(yǎng)，接種12小時后，將成蟲的排卵持續(xù)時間．以免產(chǎn)生過多的求每cm。培養(yǎng)基表面20～40只幼蟲)，一齡幼蟲出現(xiàn)后，每天在培養(yǎng)基表面滴加2％一4.5％母液(或鮮酵母)。2—3齡幼蟲期應(yīng)滴加10％左右的酵母液，滴加的量以復(fù)蓋在培養(yǎng)基表面薄薄一層為宜。待三齡幼蟲大量爬出培養(yǎng)基時，也可將培養(yǎng)瓶移至3一5℃中放置12或24小時，進(jìn)行低溫處理，以獲得染色體分散良好的制片。2．剝離唾液腺在一干凈載玻片上滴一滴生理鹽水，選擇行動遲緩、肥大、爬在管壁上即將化蛹的三齡幼蟲，或者選擇經(jīng)低溫處理的果蠅三齡幼蟲置于載玻片上。由于果蠅的位于幼蟲體前1／3—1／4處，所以在解剖鏡下左手持解剖針按壓住幼蟲后端1／310對左右)，于15一l6℃的稍低溫度條成蟲移出，控制卵(要的酵唾液腺處，固定幼蟲，右手持解剖針扎住幼蟲頭部口器處，適當(dāng)用力向后拉，把頭部與身體拉開，唾液腺腺體隨之而出。把載玻片移到顯微鏡下查找唾液腺。果蠅的唾液腺是位于口器后端神經(jīng)節(jié)兩側(cè)的一對細(xì)胞輪廓清晰。用解剖針先將含組織分開。剖離腺體也可在解剖鏡下進(jìn)行。透明而微白的類似香蕉形的長形小囊，由單層細(xì)胞構(gòu)成，細(xì)胞大，細(xì)胞核大，有腺體的一團(tuán)組織與其它組織分開，然后再將腺體與脂肪等3．解離將唾液腺在載玻片上滴一滴1mol／LHCl，讓唾液腺在1mol／LHCl中解離2—3分鐘，以松軟組織，利于染色體分散。4．染色解離后的腺體剖和染色過程勿使腺體干燥)。在酒精燈上加熱以增強(qiáng)染色染色，也可以在將幼蟲頭部與身體拉開后馬上加染液染色，然后慢慢剖離腺體。5．滴片當(dāng)腺體被染成紅色后，用濾紙擦去染液周圍一圈的黑色沉淀物，然后加上蓋玻片，在蓋玻片上方再覆蓋一層濾紙，用鑷子在蓋玻片上輕輕敲擊幾下，再用拇指按住蓋玻力下壓，把腺體細(xì)胞壓破，把染色體壓散開。壓片時放載玻片的桌面要平，不要使蓋片滑動。制好的玻片標(biāo)本用蠟封住蓋玻片四周以防干燥。經(jīng)低溫冷凍處理的材料經(jīng)解離，染色，加蓋片后不必敲擊，鏡檢即可看到分散良好的染色體?？捎盟疀_洗2—3次后滴加醋酸洋紅染液染色15—20分鐘(解效果?？梢圆唤?jīng)解離一步而直接片用6．觀察將制好的片子先用低倍顯微鏡觀察，找到好的染色體圖像于視野中心，再用(冰蠟高倍鏡觀察之。如果制片理想，可做成永久制片，即先剔除封蠟，將玻片放入固定液酸：乙醇=3:1)中待蓋片脫落后，再經(jīng)70%35分鐘95%乙醇35分鐘100%乙醇100%乙醇35分鐘35分鐘(1)(2)二甲苯35分鐘二甲苯35分鐘加拿大樹膠封片等程序。(1)(2)六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果一般實(shí)驗(yàn)用的普通果蠅(Drosophilamelanogaster2n=8)，其中Y染色體為“J”形；第二呈“V”形；第四對染色體短小，為端著絲粒染色體，呈點(diǎn)狀，附在染X染色體的呈“V”字形向外伸展出四條臀(2L、2R、3L、3R)，Y染色體著絲粒附近的異染色質(zhì)參與了染色中心的所以理想的片子，不管雌雄果蠅的腺細(xì)胞在顯微鏡下均可見五條長臂(X、2L、2R、3L、3R)和一條短臂(第四條染色體臂不易觀察)。雄果蠅唾液腺細(xì)胞。中的X染色體臂比雌果蠅的稍細(xì)。在染色體許多明暗相間的帶。七、實(shí)驗(yàn)作業(yè)一對為性染色體(XY或XX)，XX染色體為端著絲粒染色體，呈桿狀，對、第三對染色體均為中央著絲粒染色體，色盤邊緣。由于唾液腺染色體的假聯(lián)會，一端在異染中心上，另一端游離；而第二，第三對染色體著絲粒在中央，可以從異染中心形成，唾液臂上可觀察到繪制你所觀察到的果蠅唾液腺染色體圖，示各臂末端5—10條帶紋，并注明是第幾條染色體和臂的左右。實(shí)驗(yàn)四粗糙鏈孢霉雜交一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1)學(xué)習(xí)和掌握粗糙鏈孢霉的培養(yǎng)方法和雜交技術(shù)。(2)驗(yàn)證遺傳學(xué)的分離定律和連鎖互換定律。二、實(shí)驗(yàn)原理粗糙鏈孢霉(Neurosporecrassa)屬于真菌類，它的營養(yǎng)體由單倍性的(n=7)多核菌絲組成，無性繁殖是菌絲片斷或分生孢子經(jīng)有絲分裂直接發(fā)育成菌絲體，有性繁殖有兩種方式：一種是兩種不同接合型的營養(yǎng)體相互接受對方的分生孢子發(fā)生雜交，形成合子；另一種是不同接合型的菌絲相互靠在一起，細(xì)胞融合形成異核體。兩種有性生殖方式形成的二倍性合子都可以經(jīng)減數(shù)分裂形成4個子細(xì)胞，每個子細(xì)胞又經(jīng)一形成8個子囊孢子。粗糙鏈孢霉形成的8個子囊孢子具有黑色、白色兩種類型，在子囊中8個子囊孢子常呈4黑4白的排列方式，次有絲分裂形成8個子細(xì)胞，進(jìn)一步發(fā)育子有順序的直線排列在子囊中。不同接合型的子囊孢因此可以在顯微鏡下直接觀察基因的分離現(xiàn)象。當(dāng)基因發(fā)生了互換時8個子囊孢子又會排列成2黑2白2黑2白或排列成2黑4白2黑和2白4黑2白，因此在顯微鏡下也可以觀察基因的連鎖互換現(xiàn)象。賴氨酸缺陷型(Lys-)的子囊孢子成熟的較晚，所以在一定時期呈現(xiàn)灰白色。野生型(Lys-)的子囊孢子成熟的較早，在一定時期呈現(xiàn)黑色。讓以上兩種接合型的粗糙鏈孢霉雜交，在適當(dāng)時期觀察子囊孢子可以看到六種子囊類型。黑色子囊孢子以“+號”表示，白色子囊孢子以“-”號表示。非交換型子囊：++++--------++++交換型子囊：++--++--++----++--++++--交換型子囊的出現(xiàn)是由于基因Lys-或Lys+與著絲粒之間發(fā)生了交換，所以，通過計算交換型子囊的百分?jǐn)?shù)可以算出Lys基因與著絲粒間的相對距離。+交換型子囊數(shù)重組值交換型子囊數(shù)非交換型子囊數(shù)100%12三、實(shí)驗(yàn)材料野生型粗糙鏈孢霉(Lys+)和賴氨酸缺陷型粗糙鏈孢霉(Lys-)。四、實(shí)驗(yàn)器具和藥品1．器具培養(yǎng)箱、顯微鏡、鑷子、解剖針、接種環(huán)、載玻片、蓋玻片、試管、酒精燈、濾紙、白的確涼布(10cm×lOcm)、滅菌鍋。2．藥品基本培養(yǎng)基、補(bǔ)充培養(yǎng)基、雜交培養(yǎng)基見附錄11。五、實(shí)驗(yàn)步驟1．菌種活化從冰箱中取出保存的野生型和賴氨酸缺陷型的原種，在無菌操作條件下把野生型接種在基本培養(yǎng)基上，賴氨酸缺陷型的接種在含賴氨酸的補(bǔ)充培養(yǎng)基上，把接種好的試管放在23℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)5—6天，直至在試管中長成許多菌絲，并且在菌絲上部有許多分生孢子時表明菌種活化成功。2．雜交用接種環(huán)挑取已活化好的Lys+和Lys-菌絲或分生孢子部插一折疊的濾紙。在盛雜交培養(yǎng)基的試管上注明雜交組合、雜交日期、操作者姓名等。把試管放入25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2—3周，直里的菌有棕黑色的、或解剖針觸摸時有堅(jiān)實(shí)感的子囊果出現(xiàn)。3．挑取子囊果在培養(yǎng)過程中可以用解剖針挑出幾個子囊果進(jìn)行制片觀察，若子囊中的8個子囊孢子都是灰白色的，說明培養(yǎng)物還未到最佳觀察時期，可以繼續(xù)培養(yǎng)。若8個子囊孢子都是黑色的，說明子囊孢子已老化，已錯過了最佳觀察時機(jī)。實(shí)驗(yàn)操作子礁果從試管中來放在白的確涼布上，用解剖針輕壓子囊果，若有堅(jiān)實(shí)感則說明此子囊果發(fā)育正常。用解剖針在白的確涼布上來回?fù)軇幼幽夜匀サ糇幽夜系木餐臃N于同一雜交培養(yǎng)基上，并在培養(yǎng)基的瓊脂斜面中貼上標(biāo)簽，至在試管絲上用鑷子時用解剖針把挑出絲或培養(yǎng)基。4．?dāng)D出內(nèi)含物把子囊果放在載玻片中央，讓子囊果的口孔(osti01e)朝向上方，在子囊果上方斜放一蓋玻片，見圖30.1一a，然后左手食指輕按蓋玻片壓碎子囊果。當(dāng)聽到“叭”一清脆響聲時即可看到在子囊果右下角擠出一灰色小米粒1／3—1／4大小的斑點(diǎn)。取下蓋玻片，小心把子囊果殼去掉，剩下的斑點(diǎn)就是被擠出來的許多小囊。見圖30.1-b、圖30.1-c。5．壓片在載玻片中央剩下的灰色斑點(diǎn)處加少量生理鹽水，輕輕蓋上蓋玻片，讓其自然落下，灰色斑點(diǎn)即可6．觀察把制好的玻片一些黑:白=5:3或6:2的子囊，六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果散開呈菊花瓣?duì)罨蛏刃谓Y(jié)構(gòu)。標(biāo)本放在顯微鏡下觀察子囊孢子在子囊中的排列順序。若看到這是由于染色單體轉(zhuǎn)換或半染色單體轉(zhuǎn)換所致。將觀察的10—15個子囊果中各種類型子囊的數(shù)目填入下表中。七、實(shí)驗(yàn)作業(yè)寫出實(shí)驗(yàn)報告。計算Lys基因與著絲粒間的重組值。實(shí)驗(yàn)五人類染色體組型分析一、教學(xué)目的：1.通過對人類染色體組型2.初步掌握人類染色體二、實(shí)驗(yàn)原理：進(jìn)行分析,使學(xué)生初步學(xué)會對染色體進(jìn)行分析的方法。的數(shù)目和形態(tài)特征。染色體核型通常是指生物體所有可測定的表型特征總稱，包括染色體的總數(shù)、染色體組的數(shù)目、組內(nèi)染色體基數(shù)、每條染色體大小、形態(tài)。它是物種特有的染色體信息之一，具有很高的穩(wěn)定性和再現(xiàn)性。染色體組型分析是對染色體進(jìn)行分組、對核型的各種特征進(jìn)行定量和定性描述，是研究染色體的基本手段之一，可以用來鑒別真假雜種、對研究染色體結(jié)構(gòu)變異、染色體數(shù)目變異、B染色體、物種的起源和植物的遺傳進(jìn)化，基因定位等有很大的參考價值。進(jìn)行核型分析可以利用有絲分裂染色體或減數(shù)分裂染色體，其中最常用的是有絲分裂染色體。三、實(shí)驗(yàn)材料：人類染色體正常染色體（46，XY）、21三體（47，XY+21）、Klinefelter綜合征（47，XXY）和Turner綜合征（45，X）的染色體圖片。四、實(shí)驗(yàn)步驟：1.剪取染色體照片剪取染色體以便于粘貼。時,要從大到小依次剪取,每個染色體的周圍要留出一圈白邊,2.染色體配對進(jìn)行染色體配對時,先通過目測比較染色體長度和著絲粒的位置,然后進(jìn)行配對。3.染色體排列進(jìn)行染色體排列時,將已配對的染色體從大到小按長度順序排列,平放于白紙上。排列的原則是:總臂長度由長到短。凡臂長相等的,短臂長的排列在前,短臂短的排列在后。4.調(diào)整后再編號染色體編號時,將每對染色體編成一個號,由大到小從1號編至22號。編號時要注意X染色體大小介于6號和7號染色體區(qū)別開來,并從中挑出。Y染色體與21、22號染色體相似但21、22號染色體而Y染色體長臂的兩條染色單體常并攏,依據(jù)此特點(diǎn),可以將Y染色體挑出。注意將性染色體與6、7號染色體之間,以及它的著絲粒更接近中部,將X染色體的長臂常分的區(qū)別,三者均為亞中著絲粒型,但可以根據(jù)X染色體與6、7號染色體開,的單獨(dú)排列。5.染色體的分組染色體分組時、大小和著絲粒的位置這兩個特點(diǎn),成7組。分組完成后,應(yīng)在每組染色體的號,再在每組的橫線中間處,用英文字母(A→G)6.粘貼粘貼時,同一對染色體應(yīng)靠攏,兩對染色體之間應(yīng)留出一定距離,而各組染色體之間則,可以根據(jù)染色體的形態(tài)將染色體分下面用鉛筆劃一道橫線,并注明染色體序注明組號。應(yīng)留出較大的距離。實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)：1.實(shí)驗(yàn)操作過程中,應(yīng)遵循先排列、再分組、后粘貼的原則,不要邊排列邊分組邊粘貼。否則,發(fā)生錯誤之后,已粘貼上的染色體2.粘貼染色體時,操作者不要喘粗氣,以免將已經(jīng)排列不容易取下來。好的染色體吹散、丟失。實(shí)驗(yàn)六微核檢測技術(shù)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1)了解微核檢測的原理及其在病理遺傳學(xué)上的意義。(2)掌握小鼠骨髓細(xì)胞和蠶豆根尖的微核檢測技術(shù)。二、實(shí)驗(yàn)原理微核是染色體畸變的另一種表現(xiàn)形式。為有絲分裂后期喪失著絲粒的染色體片斷，在間期細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中形成的一個或多個圓形或杏仁狀結(jié)構(gòu)。通過一定制備方法，可以在間期細(xì)胞中進(jìn)行觀察和計數(shù)。70年代初，Matter和Schmid等首先用嚙齒類動物骨髓細(xì)胞微核率來測定懷疑具有誘變活力的化合物，并稱之為微核測定法。許多理化因素，如輻射、化學(xué)藥劑等作用于分裂細(xì)胞而產(chǎn)生微核呈圓形或橢圓形，游離于主核之外，大小在主核的1／3以下。微核的折光率及細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)性質(zhì)和主核一樣，也具有合成DNA的能力。一般認(rèn)為微核是由有絲分裂后期喪失著絲粒。在間期細(xì)胞中，微核的染色體斷片產(chǎn)生的，但是已有實(shí)驗(yàn)證明，整條染色體或幾條染色體也能形成微核。這些斷片或染色體在有絲分裂過程中行動滯后，在分裂末期未能進(jìn)入主核，便形成了獨(dú)立于主核之外的核物質(zhì)塊。當(dāng)子細(xì)胞進(jìn)入下一次分裂間期時，它們便濃縮形成主核之外的小核，即形成微核。已經(jīng)證實(shí)，微核率同作用因子的劑量呈正相關(guān)。所以可用簡易的微核計數(shù)來代替繁雜的中期畸變?nèi)旧w計數(shù)。由于大量新的化合物的合成，原子能的應(yīng)用，各種各樣工業(yè)廢物的排放等都存在污染環(huán)境的可能性，欲了解這些因素對機(jī)體潛在的遺傳危害，需要一套高度靈敏，技術(shù)簡單易行的測試系統(tǒng)來監(jiān)測環(huán)境的變化。只有真核類的測物質(zhì)對人類或其它高等生物的遺傳危害。在這方面，微核測試是一種比較理想的方法。目前，國內(nèi)外不少部門已把微核測試用于輻射損傷、輻射防護(hù)、化學(xué)誘變劑、新藥試驗(yàn)、食品添加劑的安全評價，以及染色體遺傳疾病和癌癥前期診斷等各個方面。華中師范大學(xué)生物系自1983年開始，建立了一套蠶豆根尖微核技術(shù)(參見附錄6)，并首次用于監(jiān)測水環(huán)境污染，經(jīng)試系統(tǒng)更能直接推測誘變鑒定已列入國家《生物監(jiān)測技術(shù)規(guī)范(水環(huán)境部分)》。本實(shí)驗(yàn)介紹了小鼠骨髓細(xì)胞微核測試。三、實(shí)驗(yàn)材料成年小鼠(雌雄不限)。四、實(shí)驗(yàn)器具和藥品1．器具顯微鏡、刻度離心管、吸管、載玻片、離心機(jī)、注射器、燒杯、解剖工具。2．藥品環(huán)磷酰胺(1mg／m1)溶液、生理鹽水、小牛血清、甲醇、1／15mol／L磷酸緩沖液(pI-H6.8)、Giemsa原液。五、實(shí)驗(yàn)步驟1．微核的誘發(fā)按40μg／g體重的劑量對小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺溶液，誘發(fā)微核(若進(jìn)行其它因子測定或自然環(huán)境測定按下續(xù)步驟直接操作)。2．取股骨處理24—36小時后，采用脫頸椎處死小鼠，迅速剝?nèi)筛晒牵迌艏∪獾溶浗M織，并擦凈股骨上的血污。3．沖洗骨髓細(xì)胞剪去股骨兩端的骨骺，用注射器吸取2—3ml預(yù)溫到出來，置于10ml試管中，懸液轉(zhuǎn)入離心管內(nèi)，棄去殘?jiān)?。滌?xì)胞1000rpm離心5分鐘，收集細(xì)胞．棄去上清液，滴滅活小牛血清，將細(xì)胞輕輕均勻。5．制細(xì)胞懸液1000rpm離心5分鐘，收集細(xì)胞，管輕輕混勻。注：以上兩步驟的小牛血清也可用1%檸檬酸鈉代替，但兩步驟須在15分鐘內(nèi)完成。6．涂片滴一小滴細(xì)胞懸液在潔凈的載玻片上，涂成均勻涂片，在空氣中干燥。7．固定放入甲醇中固定10分鐘，取出干燥。8．染色用1:10Giemsa染液染色10分鐘，迅速用緩沖液洗六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇細(xì)胞密度適中，鋪展均勻，染色良好的地方，隨機(jī)觀察計數(shù)。骨髓細(xì)胞胞均出現(xiàn)微核，但是在只有少量胞漿的有核細(xì)胞常很難與正常核葉及核的突出物相鑒別，而在無核的嗜多染紅細(xì)胞的胞漿中，微核卻易于辨認(rèn)。因?yàn)槭榷嗳炯t細(xì)胞為骨髓細(xì)胞中一類主核剛被排出的年幼紅細(xì)胞，在它完成最后一次有絲分裂后幾小時，將主核排出。由染色體斷片形成的微核則保留在細(xì)胞此，一般觀察計數(shù)嗜多染紅細(xì)胞嗜多染紅細(xì)胞經(jīng)Giemsa染液染色呈灰藍(lán)色。成熟紅細(xì)胞呈桔紅色。微核或橢圓形。邊緣光滑整齊，嗜染性與核質(zhì)一樣．呈紫紅色或紫藍(lán)色。每只動物計數(shù)1000—2000個嗜多染紅細(xì)胞。觀察含有微核的嗜多染紅細(xì)胞數(shù)，微核率以千分率表示。一個嗜多染紅細(xì)胞中出現(xiàn)一個以上微核，仍按一個細(xì)胞計數(shù)。正常小鼠嗜多染紅細(xì)胞微核率為2.8‰±0.41，即正常小鼠嗜多染紅細(xì)胞微核率為5‰以超過該值為異常。37℃的生理鹽水，然后將針頭插入股骨腔，盡量將骨髓細(xì)胞沖洗把細(xì)胞團(tuán)塊用吸管吹打散。然后將細(xì)胞4．洗盡可能不留殘液。滴加2—3棄去上清液，再加1滴滅活小牛血清，用吸片，干燥后即可觀察。中有核的細(xì)中，微核而中。因中的微核。大多數(shù)呈圓形下，七、實(shí)驗(yàn)作業(yè)統(tǒng)計你所測定的材料的微核率。綜合本班所有同學(xué)的測定結(jié)果，判斷你所測定的物質(zhì)是否具有誘變能力。實(shí)驗(yàn)七人類X小體，Y小體檢測一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1)掌握人類X小體，Y小體玻片標(biāo)本的制作方法。(2)觀察識別X小體，Y小體形態(tài)特征及所在部位，鑒定個體的性別。二、實(shí)驗(yàn)原理1949年巴爾(Barr)等人在研究貓的間期神經(jīng)細(xì)胞時發(fā)現(xiàn)雌貓體細(xì)胞核膜邊緣有一個可被堿性染料染色的小體而雄貓沒有。后來有人發(fā)現(xiàn)在人類正常女性口腔上皮、陰道上皮、皮膚、結(jié)締組織、子宮頸、羊水等組織中都發(fā)現(xiàn)同樣的小體，繼而又有人進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)所有哺乳動物雌體細(xì)胞中都有一個這種小體。一般認(rèn)為這種小體是兩個X染色體所以把它叫做x小體。x染色質(zhì)，。X小體的數(shù)目在女性數(shù)目減1。如正常女性只有2條X染色體所以僅有一個X小體，具有3條X的不正常女性則有兩個X小體只有一條X染色體，則不發(fā)生異固縮，此沒有X小體。但性染色體組成為XXY的男性也可以有一個X小體。因此我們可以根據(jù)X小體的有無和數(shù)目來鑒定胎兒性別和性別畸形。Y小體是細(xì)胞中經(jīng)熒光染料染色后顯示強(qiáng)烈熒光的小體，Y染色體的長臂末端顯現(xiàn)出的明亮小體，因此被稱為Y小體或Y染色質(zhì)。人中的一個在間期時發(fā)生異固縮形成的，又叫巴氏小體中是性染色體染色體。雄性個體因這種小體是人類男性體細(xì)胞中們可以根據(jù)Y小體的有無來鑒定胎兒的性別和性別畸形。三、實(shí)驗(yàn)材料(1)口腔粘膜細(xì)胞(男、女)。(2)干凈新鮮尿液(女性)。(3)男性精液。(4)發(fā)根細(xì)胞(女性)。(5)羊水脫屑細(xì)胞。四、實(shí)驗(yàn)器具和藥品1．器具普通顯微鏡、熒光顯微鏡、恒溫水浴鍋、離心機(jī)、離心管、熒光燈、溫箱、載玻片、蓋玻片、鑷子、牙簽、橡膠水、玻璃棒、濾紙、紗布、燒杯、量簡等。2．藥品蒸餾水、固定液(甲醇：冰醋酸=3:1)、(95％乙醇：乙醚=1:1)、HCl(5mol／L、1mol／L)、75％乙醇、硫堇紫染液、乳酸地衣紅染液、醋酸地衣紅染液、鹽酸阿的平、Mallvaine氏緩沖液(pH5.5—80.4)、石蠟。五、實(shí)驗(yàn)步驟1．X小體觀察(1)取材：①口腔粘膜細(xì)胞：讓受檢者用水漱口數(shù)次，盡可能除去細(xì)菌及雜物，用潔凈無菌的牙簽從女性口腔兩側(cè)頰部刮取粘膜，在原位刮取2—3次，第一次的刮取物棄去，將第二次，第三次的刮取物分別涂在干凈載玻片上或者將刮取物裝入盛有生理鹽水的離心管內(nèi)。②尿中的脫屑細(xì)胞：用干凈容器接取尿液，然后移入離心管。③羊水脫屑細(xì)胞：按婦科常規(guī)穿刺抽取羊水10一15ml(一般先抽的2—3ml棄去。以免誤染母體細(xì)胞)移入離心管。④發(fā)根細(xì)胞：拔取女性帶有毛囊的頭發(fā)(約2cm長)，置于載玻片上。(2)固定置于離心管中的材料(口腔粘膜細(xì)胞，尿中的脫屑細(xì)胞，羊水的脫屑細(xì)胞)，先首2000rpm離心20分鐘，棄上清液，加入新配制的固定液(甲醇：冰醋酸=3:1)混勻后在37℃下靜置30分鐘，再1000rpm離心15分鐘后棄上清液，加入1ml的固定液充分混勻制成細(xì)胞懸液。置于載玻片上的材料待干后滴加固定液(95％乙醇：乙醚=1:1或乙醇)固定1小時左右后放空氣中干燥。(3)染色：制片：①將制成的細(xì)胞懸液用吸管滴一滴于預(yù)冷的載玻片上，涼干后置于固定液(甲醇：冰醋酸=3：1)中固定20分鐘，蒸餾水中漂洗2—3分鐘．然后用1mol／LHCl在37℃水浴中水解20分鐘，蒸餾水沖洗，用硫堇紫染液染色20分鐘，蒸餾水漂洗涼干待鏡檢。②直接涂片制成的標(biāo)本滴加1—2滴乳酸地衣紅在室溫下染色20—30分鐘(勿使干燥)，加上蓋玻片，墊上濾紙，用手指輕度加中30分鐘以上，取出后編號，置冰箱中保存。③發(fā)根細(xì)胞的染色可直接將材料上加一滴醋酸地衣紅染料，拔掉毛囊、棄發(fā)干，再加滴染液后蓋上蓋玻片，然后用文火微熱，靜置5分鐘后蓋一濾紙壓片?；蛘咴诓牧仙系我坏?5％醋酸(或5mol／LHCl)解離5分鐘后吸掉多余醋酸，用凈針頭或鑷子將軟化的毛囊剝下，去毛干，用針頭將剝下的組織均勻分散，待干后將玻片放入硫堇紫染液內(nèi)染色20分鐘。取出玻片移入75％乙醇0.5分鐘，輕輕搖動，然后取出玻片涼干待鏡檢。壓后進(jìn)行鏡檢，若不立即鏡檢，待干后立即放入95％乙醇一(4)鏡檢在低倍顯微鏡下計算100個核膜完全、細(xì)胞不重疊、無核固縮的細(xì)胞。細(xì)胞堆中的細(xì)胞不能計算，不規(guī)則的細(xì)胞不能計算，在高倍或油鏡下進(jìn)一步觀察。2．Y小體的觀察(1)取材：④口腔粘膜細(xì)胞：與“x小體觀察正常男人的新鮮精液，直接涂布于干凈的載玻片上。(2)固定、染色、制片：”相同。⑤精液細(xì)胞：取年齡為33—40歲的①將新鮮的正常男性口腔粘膜細(xì)胞涂片放入固定液(乙醇：乙醚=1:1)內(nèi)固定15分鐘至12小時(可達(dá)幾周)，后將標(biāo)本移入95％乙醇內(nèi)30分鐘，用0.5％的10分鐘，用自來水沖洗1分鐘；在標(biāo)本上加1—2滴Mcllvaine氏緩沖液(pH5.5—8.4)，覆以鹽酸阿的平水溶液染色蓋玻片，用橡膠水或蠟封片。②涼干后的精液細(xì)胞涂片。放入固定液(甲醇：冰醋酸=3:1)中靜置30分鐘后，空氣干燥，15分鐘，立即用自來水沖洗1分鐘左右，涼干后滴加1—2(pH5.5—8.0)，蓋上用0.5％鹽酸阿的平水溶液染色滴Moilvaine氏緩沖液蓋玻片待鏡檢。(3)用熒光顯微鏡檢查，先用低倍鏡，再用高倍油鏡觀察，整細(xì)個胞發(fā)出熒光亮者不算。六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果1．X小體顯微鏡下觀察大約1μm左右，常附著于核膜邊緣或靠近內(nèi)側(cè)，其形態(tài)有微凸形、三角形、卵形。正常性間期細(xì)胞核中X小體的比例約30％一50％，(由于口腔粘膜涂片比其它類型的標(biāo)本更難看到細(xì)胞核，所以在口腔粘膜涂片中凡不處于邊緣的X小體不予計數(shù)，所以X小體約在30％一50％之間)。男性中則偶爾可見(2％)且不典型。2．Y小體可見細(xì)胞核中有發(fā)亮的熒光小體，直徑約0.5一0.3μm，正常情況下，Y小體的顯現(xiàn)率25％一50%，正常女性無。性異?；颊?，如核型為47，XYY個體可見兩個Y小體。七、實(shí)驗(yàn)作業(yè)(1)統(tǒng)計x小體的頻率，繪4—5個典型細(xì)胞，(2)計算顯示Y小體細(xì)胞的頻率?？梢奨小體的形態(tài)表現(xiàn)為一結(jié)構(gòu)致密的濃染小體，輪廓清楚，女用熒光顯微鏡觀察染色體的示x小體的形態(tài)部位。實(shí)驗(yàn)八小白鼠骨髓細(xì)胞染色體標(biāo)本制備一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1)掌握動物骨髓細(xì)胞染色體(2)觀察染色體二、實(shí)驗(yàn)原理玻片標(biāo)本的制備方法。的形態(tài)特征，統(tǒng)計小白鼠體細(xì)胞中染色體數(shù)目。骨髓細(xì)胞具有高度的分裂增殖能力，動物經(jīng)過秋水仙素處理后，分裂增殖中的骨髓細(xì)胞由于紡錘絲的形成受到抑制，染色體不能正常趨向兩極而使大部分細(xì)胞處于分裂中期。同時染色體適當(dāng)縮短，輪廓比較清晰。把收獲的細(xì)胞進(jìn)行低滲、固定等處理，使其處于高度膨脹狀態(tài)，再利用一定方法把細(xì)胞懸液滴在載玻片上，從而把細(xì)胞破碎，染色體分散開，再進(jìn)行染色后即可觀察到染色體。骨髓細(xì)胞染色體制片方法簡便易行，不需無菌條件，設(shè)備簡單，取材容易，在一般實(shí)驗(yàn)室即可進(jìn)行。三、實(shí)驗(yàn)材料健康小自鼠(Musmusculus)四、實(shí)驗(yàn)器具和藥品1．器具注射器(1ml、5ml各一支)、5號針頭、解剖盤、解剖剪、鑷子、玻離吸管、10ml刻度離心管、離心機(jī)、載玻片、蓋玻片、顯微鏡、濾紙、擦鏡紙、白紗布小塊、量筒、玻離板。2．藥品0.02％秋水仙素(低溫避光保存)、0.075mol／LKCl、固定液(甲醇：冰醋酸=3:1)、Giemsa染液、0.01mol／L磷酸緩沖液(pH6.8)、2％檸檬酸鈉溶液、0.85％生理鹽水。五、實(shí)驗(yàn)步驟1．預(yù)處理實(shí)驗(yàn)腹腔注射秋水仙素溶液(切勿損傷內(nèi)臟)。2．取股骨用左手拇指和食指按住小白鼠勁向后拉斷其脊髓或用力掐斷其脊髓。處死后立即用剪刀剪開后腿上的皮毛，取出小白鼠股骨，剔掉股骨上的肌肉，并將一小塊白紗布包在股骨上用手反復(fù)搓動，以除凈股骨上肌肉碎渣和結(jié)締組織。3．取骨髓細(xì)胞用剪刀剪開股骨的兩端使骨髓露出。將裝有2％檸檬酸鈉溶液的5ml注射器插入股骨的上端，緩慢注射沖洗骨髓腔，沖洗的溶液一滴滴從股骨下端滲入到離心管中，反復(fù)沖洗直至股骨變灰白色。經(jīng)1000rpm離心10分鐘后棄去上清液。前3—4小時，取健康小白鼠一只按每克體重2一μg秋水仙素的量由頭部。右手拇指和食指掐住小白鼠頸部并用的4．低滲在離心管中加入0.075mol／LKCI溶液5ml，用吸管將骨髓細(xì)胞吹打成細(xì)胞37℃恒溫水浴鍋中低滲30分鐘。1000rpm離心10分鐘后棄去上清液。在離心前加入1ml固定液5．固定I沿離心管管懸液，并用吸管吹勻進(jìn)行預(yù)固定。壁慢慢加入固定液5ml，用吸管吹打成細(xì)胞懸液后在室溫下靜置30分鐘。1000rpm離心10分鐘后棄去上清液。6．固定Ⅱ重復(fù)第5步。離心棄去上清液后沿離心管壁加入0.3一0.5ml新配制的固定液，用吸管輕輕吹打成細(xì)胞懸液。7．滴片用鑷子從冰水中取出預(yù)冷的載玻片，甩掉載玻片的冰水后迅速用吸管吸取細(xì)胞懸液滴在載玻片上2—3滴(滴片的高度30—35cm，滴面不要重復(fù))，立即用嘴向同一方向吹，使細(xì)胞染色體散開。然后置于酒精燈上微微加熱干燥或放在玻片架上室漏下涼干。8．染色將涼干的玻片放在0.01mol／L磷酸緩沖液)滴加在玻片上染色20—30分鐘，用液。濾紙吸9．鏡檢將制備好的玻片置于顯微鏡下，首先用低玻片板上，將Giemsa染液(O.5mlGiemsa原液加9.5ml的蒸餾水或自來水沖去玻片上的染干或涼干后待鏡檢。倍鏡尋找細(xì)胞和中期分裂相，然后用中倍鏡和油鏡觀察染色體的形態(tài)，統(tǒng)計染色體的數(shù)目。好的標(biāo)本可制成永久片。六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果制備好的玻片標(biāo)本應(yīng)是細(xì)胞多，中期分裂相多，細(xì)胞核染色體被染成微紫紅色。細(xì)胞、染色體分散均勻，染色體形態(tài)清晰。小白鼠(Musmusculus)的染色體數(shù)目2n=40，性染色體組成為XX、XY，染色體的類型全部為近端著絲粒染色體，微顯鏡下觀察大多為“V”形，染色體的大小區(qū)別不明顯，雄性小白鼠有3條最短的染色體(19號染色體和Y染色體)．而雌性小鼠只有2條最短的染色體。七、實(shí)驗(yàn)作業(yè)(1)繪小白鼠骨髓細(xì)胞染色體核型圖。(2)每人交兩張制作好的染色體玻片標(biāo)本。實(shí)驗(yàn)九植物有性雜交一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1)理解有性雜交的原理。(2)了解幾種植物花器構(gòu)造和開花生物學(xué)特性。(3)掌握幾種植物的有性雜交技術(shù)。二、實(shí)驗(yàn)原理植物有性雜交是利用遺傳性狀不同的親本進(jìn)行交配，以組合兩個或多個親本的優(yōu)良性狀于雜種體中，并經(jīng)過基因的分離和重組。產(chǎn)生各種性狀的變異類型，從中選擇出最需要的基因型，進(jìn)而創(chuàng)造出對人類有利的優(yōu)良品種。根據(jù)雜交親本間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，有性雜交又分為近緣雜交和遠(yuǎn)緣雜交兩大類。前者是指同一植物種內(nèi)的不同品種之間的雜交，后者指在不同植物種或?qū)匍g進(jìn)行的雜交，也包括野生種和栽培種之間的雜交。品種間雜交為近緣雜交，由于品種間親緣關(guān)系較近，具有相同的遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)，因此品種間雜交易獲成功。通過正確選擇親本，能在較短時間內(nèi)選育出具有雙親優(yōu)良性狀的新品種，但在品種間雜交時，因有利經(jīng)濟(jì)性狀的遺傳潛力具有一定限度，往往存在品種之間在某些性狀上不能互相彌補(bǔ)的缺點(diǎn)。可以擴(kuò)大栽培植物庫，能把許多有益基因或基因片斷組合到新種中，以使產(chǎn)生新的有益性狀，從而豐富各類植物，還可獲得雄性不系育，擴(kuò)大雜種優(yōu)勢的利用。但遠(yuǎn)緣雜交交配結(jié)實(shí)率低，而且不易成功，完全不，育雜種夭亡；雜種后代出現(xiàn)強(qiáng)烈分離，中間類型表現(xiàn)不穩(wěn)定，因而增加了遠(yuǎn)緣雜交的復(fù)雜性租困難，限制了遠(yuǎn)在育種實(shí)踐上的應(yīng)用。而遠(yuǎn)緣雜交的種植的基因型。通過遠(yuǎn)緣雜交緣雜交三、實(shí)驗(yàn)材料小麥(Triticumaestivum)、玉米(Zeamays)、水稻(Oryzasativa)、棉花(Gossypiumhirsutum)。四、實(shí)驗(yàn)器具和藥品1.器具鑷子、小剪刀、玻璃紙袋、羊皮紙袋、牛皮紙袋、大頭針或曲別針、紙牌、廣口瓶、廣口暖水瓶、麥管、酒盅、鉛筆、記錄本。2.藥品50％以上濃度的酒精溶液、酒精棉球。五、實(shí)驗(yàn)步驟1．小麥有性雜交(1)選穗：根據(jù)已確定的雜交組合，在雜交親本中選擇母本性狀典型、健壯無病的單株作為母本，一般以主莖穗或大分蘗穗為好。被選中的小麥穗應(yīng)該是剛抽出葉鞘還未開花，麥穗莖部距旗葉葉鞘間距離為半寸左右，花藥呈綠色，柱頭還未羽毛狀分叉。(2)整穗：將選好的穗子先用鑷子去掉麥穗下部發(fā)育較遲的小穗，僅留中部5—6個小穗，再用鑷子取掉小穗上中間的幾朵小花，一般每個小穗只留基部兩朵發(fā)育最好的小花,最后用小剪刀剪去外穎上的芒。(3)去雄：將整好的麥穗去雄，一般采用以下兩種方法：①分穎去雄法：將整過的麥穗夾在左手拇指和中指中間，用食指逐個輕壓外穎的頂部，使內(nèi)外穎分開，然后用鑷子插入小花內(nèi)外穎的合縫內(nèi)，輕輕把三枚花藥取出．最好一次去凈，注意勿傷柱頭，同時不要將花藥夾破。如果夾破了花藥，應(yīng)摘掉此朵小花，并用酒精棉球擦洗鑷子頂端，以殺死其上附著的花粉,以免發(fā)生自交。去雄時先從穗的一側(cè)開始，自上而下逐個進(jìn)行，去完一側(cè)再去另一側(cè)，不要遺漏。去雄后立即將麥穗套上玻璃紙袋，用大頭針或曲別針將紙袋別好(注意不要損壞旗葉)并掛上紙牌，用鉛筆注明母本品種名稱、去雄日期和操作者姓名。②剪穎去雄法：用剪刀以不剪準(zhǔn)。然后用鑷子從剪口處把花藥取完一側(cè)再去另一側(cè)，不能遺漏，也不能損傷柱頭。現(xiàn)個別小花已散粉，應(yīng)立即摘掉散粉套上紙袋并別好，掛上紙牌，注明母本名稱。去雄日期和操作者姓名。(4)授粉：一般去雄后2—3天，花朵的柱頭呈羽毛狀分叉，并帶有光澤。此時標(biāo)志柱頭已發(fā)育成熟，可以進(jìn)行授粉。但由于品種抽穗期早晚和當(dāng)時的氣溫不同，柱頭成熟的速度也致。一般早抽穗的品種，柱頭成熟的時間較長些，晚抽穗的品種，特別是在高溫條件下，去雄后1—2天柱頭即可成熟．有的甚至邊去雄柱頭就已經(jīng)成熟．因此應(yīng)抓緊時機(jī)，適時授粉．以提高雜交結(jié)實(shí)率。每天上午8—11時，下午3_-5時是最佳授粉時機(jī)。①采粉授粉法：授粉前先采集父本花粉，于上午7—10時開花最盛時進(jìn)行。如果父本穗子數(shù)量多，可直接采收花粉。方法是：選擇麥穗中部有幾朵小花已開花的穗子，將上而下輕輕抹幾遍促使其開花，幾分鐘后就可看穎殼逐漸張開，花藥逐漸伸出，斜置于容器上方，用鑷子輕輕敲打麥穗，花藥即可落入容器之中。另外，如果父本穗子數(shù)量少，可選當(dāng)天有幾朵小花(花藥呈金黃色)，用鑷子撐開小花的出金黃放入酒盅中?；ǚ鄄杉螅R上取下麥穗上的紙袋，用小毛筆蘸取少量花粉或用鑷子夾2—3個花藥依次放入已去雄的小花柱頭上，也要按從上而下，授完一側(cè)再授另一側(cè)的順序進(jìn)行。為使柱頭授粉良好，粉在柱頭上全穗授粉完畢后，仍套上紙袋，用大頭針別好，掛上紙牌，注明父本名稱及授粉日期。把整好的麥穗上留的每朵小花的護(hù)穎及內(nèi)外穎剪去1／3—2／5，破花藥為出。此法也要自上而下逐朵小花進(jìn)行，去如發(fā)小花。去雄后不一此穗子自此時將穗子開花的穗子內(nèi)外穎，取色的花藥應(yīng)使花輕擦幾下，②采穗授粉法：此法配合剪穎法去雄。選擇當(dāng)天將要開花的父本穗為供粉穗，將穗子剪下，隨即把頂部和基部發(fā)育不好的小穗去掉，留下中間兩側(cè)的小穗，然后將穎殼斜剪1／3，以不傷花藥為準(zhǔn)，在陽光照射下約2—3分鐘后，花藥即可伸出穎外，將母本紙袋上部剪開，向內(nèi)吹氣使紙袋充分張開，輕輕拿起即將散粉的父本穗子，倒置插入母本紙袋。在袋內(nèi)捻轉(zhuǎn)幾下，花粉就自然落在柱頭上。授粉完畢后，父本穗取出，仍舊套上紙袋，用大頭針別好紙袋口，在紙牌上注明父本名稱及授粉日期。(詳見圖12.1)(5)檢查受精情況：授粉后1—2小時花粉粒就在柱頭上萌發(fā)，40多小時后完成受精。授粉后3—4天打開紙袋檢查雜交成功率。若子房已膨大，內(nèi)外穎合攏．柱頭萎縮，失去光澤說明已受精，否則未受精。若在一穗大部分小花都沒受精，則進(jìn)行第二次授粉。檢查完畢后仍然套上紙袋。(6)收獲：六月初小麥成熟后，把同一種雜交組合的雜交穗子剪下收集在一起，脫粒后裝在一個紙袋里，并在紙袋上注明雜交組合，種子粒數(shù)、收獲日期，上交實(shí)驗(yàn)室。(小麥花器構(gòu)造和開花習(xí)性詳見附錄1)2．玉米有性雜交(1)選穗：根據(jù)育種目標(biāo)和實(shí)驗(yàn)設(shè)計，選擇健壯優(yōu)良、無病、苞葉露出而沒有吐絲的植株。(2)隔離：用透光防水的硫酸紙袋套住母本的雌穗，同時也套住選作父本的雄穗，以防外來花粉的侵入。保證實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。套袋時將袋口插在莖稈和雌穗之間，以防吹落。另外種植時也應(yīng)考慮父、母本間在種(3)整穗：當(dāng)雌穗花絲伸長出苞葉一間不同，苞葉外的花絲可能長短不齊，取下透明紙袋植時間和空間的隔離。寸左右時，表明雌花發(fā)育成熟。由于各朵花吐絲時把花絲修剪成一寸左右，然后繼續(xù)套上透明紙袋。(4)授粉：整穗后應(yīng)馬上進(jìn)行授粉。上曲抖動，使花粉落在內(nèi)，然后取下紙袋，折疊袋口。授粉者應(yīng)頭戴草帽，迅速到授粉植株處，用草帽沿遮住雌穗上方，輕取下雌穗套袋，口向下傾斜，使花粉均勻倒在母本花絲上，然后立即套上原雌穗套袋，用大頭針連同苞葉一塊別好，用小繩將紙袋輕拴在莖上，并在系上紙牌，注明雜交組合、授粉日期及操作者姓名。每做完一個雜交組合，即用酒精擦手，殺死花粉，以免造成人為授粉混雜。另外授粉時動作要敏捷，取袋、套袋要迅速，盡量縮短花絲暴露的時間，不要用手觸摸花絲，并用草帽和身體擋住外來花粉，以免落在造成混雜。(5)檢查受精情況：授粉4—5天后，打開紙袋檢查，若大部分花絲已萎縮，沒有光澤說明受精情況正常。(6)收獲：將成熟的玉米雜交午9一10時將已開始開花散粉的父本雄穗輕輕彎透明紙袋將裝有花粉的透明紙袋玉米莖上母本花絲上，果穗連同植株上的紙牌一起收交實(shí)驗(yàn)室。(玉米花器構(gòu)造和開花習(xí)性見附錄2。)3．棉花有性雜交(1)選擇親本：在棉花開花的前一天下午4時以后，在擬定組合的母本行中選擇具有母意第二天早晨必開的花的外觀是：花冠呈螺旋本典型性狀的生長健壯、無病優(yōu)良的植株。注形折疊，但花瓣已經(jīng)長大露出苞葉。(2)去雄：A．徒手去雄：去雄的花應(yīng)選3—6果枝靠近主莖的第1—2節(jié)位花朵。去雄時用手撥開苞葉。用右手的大拇指甲，從花萼管外面切入，將花冠和整個雄蕊管完全剝凈，只意不要碰破花留下雌蕊和苞葉，露出花柱、柱頭和子房，并將該果枝打去邊心。去雄時，注藥或觸傷花柱、柱頭和子房。如果碰破花藥，應(yīng)立即用酒精棉球擦手．殺死粘在指甲上的花粉，以免影響雜交質(zhì)量。去雄后，立即用一端開口另一端有節(jié)密閉的麥管從柱頭頂端輕輕套下，一直達(dá)到子房上端，麥管套入后須高出柱頭1—2cm，即可避免外來花伸長時被碰傷。然后掛上紙牌，注明母本名稱、去雄日期和操作者姓名。B．麥管切頭和部分花藥，再用4cm長的粗壯麥管，一端折封，粉授粉，又可避免花柱雄：用剪刀或手剝?nèi)セü谏喜浚冻鲋硪欢藦闹^套下．并輕輕轉(zhuǎn)動向下壓，將雄蕊的花絲切斷，花藥脫落。去雄完畢后，麥管仍套在柱頭上，以防止花藥傳入。然后掛上紙牌，注明母本名稱、去雄日期和操作者姓名。C．手術(shù)去雄：用剪刀將花口；也可將花冠全部剪去，使雄蕊外露，再用剪刀或頭上套上麥管，進(jìn)行隔離。這種方法比較麻煩費(fèi)工，但花器受損傷小，結(jié)鈴率高。(3)父本隔離：在母本去雄的同時，選父本植株上次日可以開花蕾，用線或回形針或塑料管隔離，注意用線扎花冠頂端時不要太松，以免次日花冠上張開的小孔讓昆蟲進(jìn)入。使父本花粉混雜；也不要過緊，以免扎破花冠和扎住柱頭。(4)授粉：一般在去雄后次日上午9～10時進(jìn)行，這時的柱率高。授粉時先將隔離的父本花朵摘下來，剪去花冠，并將母本柱頭上的隔離麥管取下，用干凈毛筆蘸父本花粉輕輕涂抹在母本柱把花粉輕輕抖落在母本柱頭上。授粉后仍舊套上麥管進(jìn)行隔離。并在紙牌上注明父本名稱、授粉日期。(5)檢查受精情況：授粉后3--4天，若子房膨大，柱頭失去光澤說明雜交成功。冠縱面剪裂，或從側(cè)面剪去花冠的三分之一，成一個三角形的切鑷子輕輕除去花藥，把花藥全部摘凈后，再在柱的花頭和花粉生活力較強(qiáng)，結(jié)實(shí)頭上，或(6)收獲：雜交棉吐絮后，進(jìn)行單鈴收獲，脫粒后，把種子收放在種子袋中，注明雜交組合、種子粒數(shù)，收獲日期等，上交實(shí)驗(yàn)室。4.棉花自交棉花屬常異花授粉作物，天然異變率可達(dá)20%以上，為了防止生物學(xué)混雜，保持品種的遺傳特性，常采用自交方法。自交在開花主莖的花蕾，其方法有：(1)扎線法：用21～24cm長的棉線，一端系在準(zhǔn)備自交花地繞纏在花冠頂部，待花冠脫落后，棉線仍保持在果柄上，做自交記號。(2)回形針法：用回形針夾住花冠頂部，并在花柄上用線或漆做記號。(3)塑料管法：用特制的塑料管套在花柄上做標(biāo)記。(4)膠粘法：在尚未開放的花冠上涂膠粘劑，使花冠不能張開，并在花前花冠露出苞葉1.5cm以上為好。選擇典型、健壯、無病優(yōu)良植株中部靠近朵的花柄上，另一端不松不緊冠上，并在花柄上做標(biāo)記。(棉花的花器構(gòu)造和開花習(xí)性詳見附錄3。)5．水稻有性雜交(1)選穗：根據(jù)已確定的雜交組合，逸取植株生長健壯、無病蟲害、具有該品種典型性狀、稻穗已露出葉鞘3／4，穗尖已開過幾朵穎花的母本稻穗供去雄之用。A．溫湯殺雄：利用水稻的雌雄蕊對溫度的適應(yīng)能力不同的特性，在水稻自然45℃，稈。5—8分鐘后取出稻穗后20分鐘左右即可開穎，不開的全部剪掉。(注意防及穗枝梗)，隨即套上透明紙袋．以防串粉。系上紙牌注明母本名稱、去雄日期和操作者姓名(見圖12.2)。B.剪穎去雄：在雜交前一天下午4—5時后，或雜交當(dāng)天早晨7—8時進(jìn)行。選取露出葉鞘一半或2／3的母本穗子，剝開葉鞘，進(jìn)行整穗疏花，將下部過嫩的花全部剪去，留下中部預(yù)計次日能開的穎花(可將穎花在陽光下透視．當(dāng)穎花內(nèi)雄蕊伸長已剪去穎(2)去雄：開花前半小時時，將暖水瓶中的溫水調(diào)節(jié)到把選好的母本稻穗與暖水瓶相對傾斜，將稻穗全部浸入溫水中，注意勿折斷穗莖和穗涼干，(若水溫降至42—44℃，則處理8—10分鐘)。取出止剪傷開放的穎花上部已開的花和達(dá)穎殼的1／2以上時，即為次日要開的穎花)20--30朵，用剪刀橫殼的1／4或1／3(不要剪破花藥)，再斜剪外穎一側(cè)，然后用鑷子將6枚雄蕊輕輕夾去。去雄后，立即套上透明紙袋，掛上紙牌，注明母本名稱、去雄日期和操作者姓名。(3)授粉：溫湯去雄后，可以隨即授粉；如用剪穎去雄，開花當(dāng)天剪穎去雄的，以當(dāng)天授粉效果最好，也可以次日上午授粉，授粉方法主要有：A.彈花授粉法：在水稻自然開花時，輕輕剪下正在開花的父本稻穗，并置于已去雄的母本稻穗上方，用手輕輕抖動父本稻穗，使花粉落在母本柱頭上，連續(xù)進(jìn)行2--3次。如父母本相鄰種植，則不必剪穗，可就近授粉；若母本已去雄而父本尚未開花時，則可用黑紙袋罩住父本穗子，約10分鐘后，揭開紙袋即可開花授粉。B.授入花藥法：在水稻自然開花時，用鑷子夾住父本成熟的花藥，(剛開花而未散粉的花藥或未開花但雄蕊伸長穎殼達(dá)2／3以上的穎花的花藥)在已去雄的母本穎殼上輕輕磨擦，使花藥破裂，花粉散落在柱頭上，但注意不要損傷母本的花器。如果母本穎殼已經(jīng)關(guān)閉，可將2--3個花藥塞進(jìn)穎內(nèi)，讓其自然開裂散粉。授粉后，母本穗仍舊套上透明紙袋，用回形針別(4)檢查授精情況：可在授粉3天后檢查雜交是否已受精，可以長成稻粒，此時可以把袋摘下。(5)收獲：雜交后20天左右即可收獲稻穗，連同紙牌一塊交實(shí)驗(yàn)室好，并在紙牌上注明父本名稱，授粉日期。成功，其標(biāo)志要看子房是否膨大，膨大者表示。(水稻的花器構(gòu)造和開花習(xí)性參見附錄4。)六、實(shí)驗(yàn)作業(yè)根據(jù)上述小麥、玉米、棉花、水稻各自的雜交方法，每種作物在各自的開花盛期雜交3--5個，收獲后將雜交穗子或籽粒交實(shí)驗(yàn)室。實(shí)驗(yàn)十植物多倍體的誘發(fā)與鑒定一、實(shí)驗(yàn)(1)了解人工誘發(fā)多倍體植物的(2)初步掌握用秋水仙素誘發(fā)多倍體的實(shí)驗(yàn)二、實(shí)驗(yàn)原理目的原理、方法及其在植物育種上的意義。技術(shù)和多倍體的鑒定方法。多倍體廣泛地存在于植物界，目前已知被子植物中有三分之一以上的物種是多倍體，如普通小麥?zhǔn)钱愒戳扼w，棉花是四倍體，此外還有煙草等，這些部是自然界存在的多倍體。多倍體產(chǎn)生的途徑除自然發(fā)生外。也可以采用高溫、低溫、嫁接、切斷和射線處理等物理方法和化學(xué)藥劑處理方法，在這些方法中以化學(xué)藥劑處理最為有效，如秋水仙素，萘嵌戊烷、異生長素、植物激素、富民隆等，都可誘發(fā)多倍體，其中應(yīng)用最廣泛、效果最好的是秋水仙素。秋水仙素是由百合科秋水仙屬的秋種番紅花一一秋水仙素(Colchicumautumnale)的種子堿。化學(xué)分子式為CHNO112HO。它具有麻醉作用，和器官中提煉出來的一種生物222562對植物的種子、幼芽、花蕾、花粉、嫩枝等可產(chǎn)生誘變作用，它的作用機(jī)理是抑制細(xì)胞分裂時紡綞體的形成，使復(fù)制后的染色體不能拉向兩極，細(xì)胞不能繼續(xù)分裂形成兩個子細(xì)胞，從而導(dǎo)致染色體加倍，形成多倍體細(xì)胞，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步發(fā)育成多倍體植物，多倍體植物可以通過有性繁殖進(jìn)行繁殖下去。用人工方法誘導(dǎo)的多倍體，可以得到一般二倍體沒有的優(yōu)良性狀，如大粒、大穗、內(nèi)含物量增加、抗病性強(qiáng)等。人工培育的三倍體西瓜、三倍體甜菜、八倍體小黑麥已在生嚴(yán)上廠泛應(yīng)用。對多倍體的鑒定，除了檢查染色體數(shù)目變化外，形態(tài)特征的變異也是一個重要方面。多倍體植物的氣孔、花器、花粉粒、種子、果實(shí)等部分明顯變大，氣孔數(shù)目減少而密度變稀，同源多倍體育性有一定的降低，所以同源多倍體中有部分畸形的不育花粉粒。三、實(shí)驗(yàn)材料(1)洋蔥(Alliumcepa2n=16)、大麥(Hordeumspp.2n=14)、大蒜(Alliumsativum2n=16)、西瓜(Citrullusvulgaris2n=22)、玉米(Zeamays2n=20)、蠶豆(Viciafaba2n=12)等的種子、鱗莖。(2)葡萄植株、插條或其它果樹植株。四、實(shí)驗(yàn)器具和藥品1.器具顯微鏡、剪刀、培養(yǎng)皿、載玻片、蓋玻片、吸水紙、培養(yǎng)箱、鑷子、紗布、脫脂棉、酒精燈、測微尺。2.藥品秋水仙索(0.1％和0.025％)、HCl(mol／L)、硝酸銀(O.1％一0.2％)、碘化鉀(1％)、固定液、醋酸洋紅或卡寶品紅染色液。五、實(shí)驗(yàn)步驟1.植物根尖多倍體的誘發(fā)將玉米、大麥等植物種子洗凈后用水浸泡1—2天，然后擺放在鋪有濕潤濾紙(或紗布)的培養(yǎng)皿中置于25一28℃條件下發(fā)芽，當(dāng)根長到1cm時取出洗吸干后移到0.01％一0.1％的秋水仙25℃條件下處理直到根尖1小時，以備鏡檢。若用洋滿水的瓶口上。當(dāng)長出新的不定根后，再用秋水仙凈，把水素溶液中，使植物根部浸在藥液中，根尖朝下，明顯膨大為止。另外設(shè)加入清水的作為對照，然后取出材料洗凈，用卡諾氏固定液固定蔥作材料時，必須先剪去老根，然后置于盛素處理。2．多倍體植物的誘發(fā)(1)處理種子：將植物的種子放在0.1％秋水仙素溶液中浸種取出種子用自來24小時，了的吸水紙的培養(yǎng)皿中，般處理兩天就可長出幼苗。對干燥種子要多處理1天，種皮厚發(fā)芽慢的種子應(yīng)先催芽后進(jìn)行處理。用秋水仙素能阻礙根系發(fā)育，所以對已發(fā)芽的種子應(yīng)用較低的秋水仙素溶液處理較短的時間。處理后取出幼苗，用自來水緩緩沖洗以免損傷，然后將幼苗移栽到大田或盆缽內(nèi)，同時播種未經(jīng)處理的種子苗作為對照。(2)處理幼苗：對于發(fā)瓜籽浸種催芽。當(dāng)胚根長到1—1.5cm時，將25℃溫度下浸漬20一24小時，注意處理時需要用濕濾紙將根蓋好，避免失水。理后的幼苗，經(jīng)水洗進(jìn)行栽種或砂培。另外也可以采用田間處理幼苗的方法，即當(dāng)幼苗子葉展平時。每天早晚用0.25%或0.4％秋水仙滴浸生長點(diǎn)各一次，每次1—2滴，連續(xù)處水沖洗2—3次，然后將種子移到放有被0.025％秋水仙素溶液潤濕為避免蒸發(fā)，加上蓋放入20℃培養(yǎng)箱內(nèi)發(fā)芽，一浸過種的種子比幼芽慢的種子在出苗后處理效果更好。以西瓜為例：先將二倍體西胚根倒置于0.2％一0.4％秋水仙素溶液的培養(yǎng)皿中置處素溶液理4天，遮陰保持濕度。以上兩種方法如果成功可獲得四倍體西瓜，再用它和二倍體西瓜雜交就可育成三倍體無籽西瓜。(3)處理芽：選用葡萄植株或插條等果樹的頂芽或個蘸有0.5％一0.7％的秋水仙球(最好外罩一塑料袋防止蒸發(fā))連續(xù)處理2—3天后，掉棉球，反復(fù)用清水沖洗生長點(diǎn)。也可將蘸有秋水仙素的棉球涂抹生長點(diǎn)，待進(jìn)一步生長后，再進(jìn)行觀察和鑒定。3．多倍體的鑒定腋芽生長點(diǎn)進(jìn)行處理。將芽部固定一素棉去(1)細(xì)胞學(xué)鑒定：對已經(jīng)加倍和未加倍(對照)的植株根尖或莖尖制成臨時片，觀察有絲分裂中期的染色體數(shù)目。對收獲的可能為同源多倍體的大粒種子發(fā)芽制成根尖壓片，進(jìn)行檢查染色體數(shù)目。(2)形態(tài)鑒定：觀察植物多倍體植株，分別比較鑒定二倍體和多倍體在形態(tài)上的主要區(qū)別。(3)氣孔鑒定：在同源多倍體植物葉片背面中部劃一切口用尖頭鑷子夾住切口部分，撕下一薄層下表皮，放在載玻片上，加一滴蒸餾水鋪平，蓋上蓋玻片，制成表皮裝片，用同樣方法，制作一張二倍體植物的表皮裝片作為對照，鏡檢比較多倍體和二倍體氣孔和保衛(wèi)細(xì)胞的大小，各測定30個計算出平均值。統(tǒng)計氣孔數(shù)目，各觀察10個視野，計算氣孔密度。氣孔保衛(wèi)細(xì)胞的大小測定用測微尺測量：(m度)鏡臺測微尺格數(shù)10目鏡測微尺每格長目鏡測微尺格數(shù)氣孔密度測定方法：將葉片表皮制片于顯微鏡下檢查，計算每個視野氣孔數(shù)，移動制片重復(fù)Sr2求視野10次，求出平均值。視野面積的計算，用目鏡測微尺出量視野直徑，按公式面積。得每平方毫米葉面積的氣孔數(shù)。(4)保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)葉綠體數(shù)目測定：取葉下表皮于載玻片上，滴加0.1％一0.2％AgNO溶3液數(shù)秒后(5)花粉粒的鑒定：從同源多倍體和二倍體植株上采集花粉吸取一滴花粉粒懸浮液分別放到載玻片上，加上碘化鉀溶液，蓋上蓋玻片制成花粉粒制片，、有無畸形，若大小差異不明顯，加蓋玻片，在顯微鏡下觀察保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)的葉綠體數(shù)目。放入45％醋酸中，用滴管各然后鏡檢，觀察同源多倍體和二倍體花粉形態(tài)大小是否整齊時，可用測微尺各測定30個花粉粒大小，求平均值。六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果將鏡檢結(jié)果填入表26.1。七、實(shí)驗(yàn)作業(yè)(1)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。(2)繪制一多倍體植物中期染色體圖像。(3)交1—2張好的多倍體根尖制片。(4)簡述多倍體誘發(fā)的基本原理及意義。表26.1同源多倍體和二倍體性狀對照表項(xiàng)目染色體數(shù)氣孔大小保衛(wèi)細(xì)胞花粉粒大小花粉粒形態(tài)氣孔密度結(jié)目長×寬長×寬材料果同源多倍體二倍體實(shí)驗(yàn)十一植物細(xì)胞核高分子量DNA的快速提取一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)和掌握用苯酚法和鹽溶液法提取DNA的原理和技術(shù)。二、實(shí)驗(yàn)原理DNA是最重要的信息分子，是分子生物學(xué)研究工作的主要對象。因而DNA分子的純化是一項(xiàng)最基本的研究技術(shù)。由于DNA結(jié)構(gòu)較不穩(wěn)定，在較劇烈的物理、化學(xué)因素及酶的作用下很容易降解，在制備DNA時應(yīng)防止過酸、過堿及其它能引起核酸降解的因素的作用。在提取過程中為了防止組織中廣泛存在的核酸降解酶的作用，全部過程應(yīng)在低溫下(0℃左右)乙二胺四乙蛋白質(zhì)變性劑來分離核酸，它們同時也可以破壞核酸降解酶，因而常獲得較好的效果。動植物的DNA核蛋白能溶于水及高濃度的鹽溶液，但在O.14mol／L鹽溶液中溶解；而RNA核蛋白則溶于0.14mol／L鹽溶液中。利用這個特性即可把RNA核蛋白與DNA核蛋白分開。當(dāng)核蛋白在氯仿中透析或與氯仿一起震蕩時，蛋白質(zhì)變性并與DNA分開，而DNA則仍留于水相中。當(dāng)向含有核酸的水相中加入乙醇時，核酸即呈纖維狀析出。也可用苯酚法提取DNA。先用特定pH的苯酚溶液處理。然后離心分層，DNA或溶于上層水相中，或存在于中間殘留物中，蛋白質(zhì)變性后停留在苯酚層內(nèi)。由于苯酚能使蛋白質(zhì)迅速變性，因而抑制了核酸酶的活性。操作過程比較緩和，可以得到較好的DNA制品，所以現(xiàn)在一般都用苯酚法提取DNA。采用液氮冷凍后破碎植物細(xì)胞保護(hù)DNA不被破壞。破碎的細(xì)胞懸浮于裂解液中，其中的SDS使核膜破裂；EDTA螯合二價金屬離子，以抑制DNA酶的活性；蛋白酶K除抑制DNase外還使DNA與染色質(zhì)蛋白質(zhì)解離，以便分離較純的DNA；60℃保溫也可抑制DNase的活性，同時使溶液粘度下降。經(jīng)酚和氯仿／異戊醇抽提裂解物以除去蛋白質(zhì)。進(jìn)一步用氯化鋰沉淀大分子RNA。并用透析法除去低分子量雜質(zhì)．即可得到較純的DNA，其大小適于Southern分析和用入噬菌體構(gòu)操作。必要時還需要加入抑制劑以抑制酶的作用。檸檬酸鹽、氟化物、砷酸鹽、酸鈉、皂土均可抑制DNA酶的活性。如果采用十二烷基磺酸鈉或苯酚作度很低本實(shí)驗(yàn)壁。在冰凍條件下可部分抑制DNase的活性，以再建基因組DNA文庫。三、實(shí)驗(yàn)材料小麥葉片(或其它物種植物葉片)。四、實(shí)驗(yàn)器具和藥品1．器具高速冷凍離心機(jī)、恒溫水浴鍋、手提式高壓消毒器、研缽、普通離心機(jī)。2．藥品5mg／ml蛋白酶K，1mol／LTris，裂解緩沖液(500mmol／LTris—HCl、10mmol／LEDTA、5mmol／Lβ-巰基乙醇，pH8.0)，O.5％SDS，10mol／LLiCl，泡和酚，氯仿份(氯仿異戊醇=24：1)，無水乙醇，TE緩沖液。-異戊醇五、實(shí)驗(yàn)步驟(1)取新鮮幼葉5g，于液氮中速凍后．立即在液氮中研磨成粉末，做到盡可能研碎。將粉末放入小燒杯中。(2)待液氮蒸發(fā)后，向燒杯中加入20ml預(yù)冷的裂解緩沖液，輕輕攪勻，用1mol／LT