食品生物技術(shù)

木瓜蛋白酶的固定化技術(shù)

木瓜蛋白酶是利用未成熟的番木瓜果實(shí)中的乳汁，采用現(xiàn)代生物工程技術(shù)提煉而成的純天然生物酶制品。它是一種含疏基(-SH)肽鏈內(nèi)切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，有較廣泛的特異性，對(duì)動(dòng)植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有較強(qiáng)的水解能力，同時(shí)，還具有合成功能，能把蛋白水解物合成為類(lèi)蛋白質(zhì)。木瓜蛋白酶在醫(yī)藥食品日化品等行業(yè)方面有著廣泛的應(yīng)用。

固定化技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)：一、可以做成各種形狀，如顆粒狀、管狀、膜狀，裝在反應(yīng)槽中，便于取出，便于連續(xù)、反復(fù)使用。二、穩(wěn)定性提高，不易失去活性，使用壽命延長(zhǎng)。三、便于自動(dòng)化操作，實(shí)現(xiàn)用電腦控制的連續(xù)生產(chǎn)。采用固定化技術(shù)降低了生產(chǎn)成本，下面是對(duì)木瓜蛋白酶固定化的研究。查閱文章:Ⅰ.殼聚糖載體柔性固定化木瓜蛋白酶魏榮卿、沈斌等Ⅱ.微孔淀粉-海藻酸鈉固定化木瓜蛋白酶的研究金峰Ⅲ.金屬螯合載體定向固定化木瓜蛋白酶的研究劉琳琳、曾力希等一、殼聚糖載體柔性固定化木瓜蛋白酶采用酶柔性固定化模型（在固定化載體上連上有足夠長(zhǎng)度且親水的分子鏈，最后將酶結(jié)合到柔性鏈上），以殼聚糖為載體，雙醛淀粉為柔性鏈，對(duì)木瓜蛋白酶進(jìn)行柔性固定化。實(shí)驗(yàn)材料及儀器：殼聚糖可溶性淀粉戊二醛紅外光譜儀紫外分光光度計(jì)酸度計(jì)恒溫震蕩儀試劑：Tris-Hcl緩沖液酶液（以緩沖液配制）固定化條件的優(yōu)化：由試驗(yàn)結(jié)果分析知：固定化酶技術(shù)使木瓜蛋白酶的活性明顯提高。由上圖可知：固定化木瓜蛋白酶的最優(yōu)化條件是：固定化溫度為24℃，固定化PH是8.0由上圖的實(shí)驗(yàn)結(jié)果知：Chitosan-DAS的固定化效果比Chitosan-GA的效果好即柔性固定比手臂固定效果好。同時(shí)確定DAS的氧化度為50時(shí)最適。固定化酶使用次數(shù)7～8次活力仍為原活力的一半。二、微孔淀粉-海藻酸鈉固定化木瓜蛋白酶的研究采用微孔淀粉-海藻酸鈉包埋法固定化木瓜蛋白酶（海藻酸鈉與Ca+形成“蛋盒”模式，包埋木瓜蛋白酶）實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備：木瓜蛋白酶微孔淀粉海藻酸鈉WL500CY高剪切乳化機(jī)PHS-3B型PH計(jì)T-6紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)

固定化酶的制備流程：①將木瓜蛋白酶溶解于去離子水中，加一定量的微孔淀粉混合均勻，充分吸附后高速均質(zhì)，待用②海藻酸鈉+50ml水，加熱溶解+10ml木瓜蛋白酶微孔淀粉混合液，攪拌均勻用5號(hào)注射器加在一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的氯化鈣溶液中，拉成管狀凝固3min用蒸餾水洗滌數(shù)次，置于冰箱冷藏備用③測(cè)定游離酶和固定酶的酶活力結(jié)果與分析：由以上三個(gè)圖知：優(yōu)化條件為最適微孔淀粉濃度為4%，最適海藻酸鈉濃度為3%，最適氯化鈣濃度為5.5%三、金屬螯合載體定向固定化木瓜蛋白酶的研究以磁性金屬螯合瓊脂糖微球?yàn)檩d體，利用金屬螯合配體（IDA-Cu+)與蛋白質(zhì)表面供電子氨基酸相互作用的原理，定向固定了木瓜蛋白酶實(shí)驗(yàn)材料與儀器：木瓜蛋白酶鹽酸半胱氨酸亞氨基二乙酸EDTA四氧化三鐵磁流體瓊脂糖UV751GD型紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)GFU-202C原子吸收分光光度計(jì)85-2型恒溫磁力攪拌器AB204-E型電子分析天平PB-10型酸度計(jì)固定化酶流程：載體的制備（磁性瓊脂糖微球采用反相懸浮包埋法制備,然后加入IDA，最后加入氯化銅制的瓊脂糖-IDA-銅離子螯合載體）酶的固定化（螯合載體+木瓜蛋白酶室溫下震蕩4h，用磷酸緩沖液洗滌數(shù)次）測(cè)定酶活力載體的再生（再生載體可對(duì)酶再次固定化）結(jié)果與分析：隨著載體吸附銅離子的量的增加，載酶量逐漸增加，固定化酶活在1.5左右出現(xiàn)最高峰后逐漸下降。溫度、PH對(duì)酶活力的影響由試驗(yàn)結(jié)果知：酶的固定化技術(shù)使木瓜蛋白酶對(duì)PH的耐受力提高一個(gè)點(diǎn)，使酶對(duì)溫度的耐受力提高10℃三種固定化技術(shù)的比較：相同點(diǎn)：①三種研究均采用了固定化技術(shù)達(dá)到了共同的目的：提高了木瓜蛋白酶的穩(wěn)定性，是木瓜蛋白酶可以重復(fù)利用，降低了生產(chǎn)成本。②三種研究酶活的測(cè)定方法相同，均采用紫外分光光度法：加入激活劑和磷酸緩沖液以及酪蛋白，37℃反應(yīng)10min加入三氯乙酸終止酶反應(yīng)，測(cè)定其消光值。③三種固定化技術(shù)均造成酶對(duì)底物的親和力降低：第一篇由于柔性鏈的作用降低了酶的親和力；第二篇由于包埋技術(shù)，底物要走很長(zhǎng)的路徑才能與底物結(jié)合導(dǎo)致親和力下降；第三篇由于金屬螯合載體的電荷作用導(dǎo)致親和力下降。第一篇文章在研究階段主要關(guān)注的是Chitosan-DAS和Chitosan-GA的固定化條件的不同，所以下面來(lái)比較后兩篇文章的不同。第二篇文章固定化酶的最適PH值為5.7，與游離酶相比向酸性方向移動(dòng)；第三篇文章固定化酶的最適PH值為8.0，與游離酶相比向堿性方向移動(dòng)。后兩篇文章固定化酶的最適溫度較游離酶相比均提高一個(gè)點(diǎn)，大約80℃左右。