分光光度法優(yōu)秀課件

第八章吸光光度法1化學(xué)分析：常量組分(>1%),Er0.1%～0.2%

依據(jù)化學(xué)反應(yīng),使用玻璃儀器

化學(xué)分析與儀器分析方法比較儀器分析：微量組分(<1%),Er1%～5%

依據(jù)物理或物理化學(xué)性質(zhì),需要特殊的儀器例:含F(xiàn)e約0.05%的樣品,稱0.2g,則m(Fe)≈0.1mg重量法

m(Fe2O3)≈0.14mg,稱不準(zhǔn)容量法

V(K2Cr2O7)≈0.02mL,測不準(zhǔn)光度法結(jié)果0.048%～0.052%,滿足要求準(zhǔn)確度高靈敏度高26.1概述（1）定義：吸光光度法是基于物質(zhì)對光的選擇性吸收而建立起來的分析方法，包括比色法、可見及紫外吸光光度法及紅外光譜法等。我們重點討論可見光區(qū)的吸光光度法。3微粒性

h－普朗克(Planck)常數(shù)6.626×10-34J·s

－頻率

E－光量子具有的能量單位：J(焦耳)，eV(電子伏特)

光量子，具有能量。5波粒二象性結(jié)論:一定波長的光具有一定的能量，波長越長(頻率越低)，光量子的能量越低。真空中:6光學(xué)光譜區(qū)遠(yuǎn)紫外近紫外可見近紅外中紅外遠(yuǎn)紅外（真空紫外）10nm~200nm200nm

~380nm380nm

~780nm780nm~2.5m2.5m

~50m50m

~300m73.溶液中溶質(zhì)分子對光的吸收與吸收光譜/nm顏色互補光400-450紫黃綠450-480藍(lán)黃480-490綠藍(lán)橙490-500藍(lán)綠紅500-560綠紅紫560-580黃綠紫580-610黃藍(lán)610-650橙綠藍(lán)650-760紅藍(lán)綠不同顏色的可見光波長及其互補光物質(zhì)的顏色是因物質(zhì)對不同波長的光具有選擇性吸收作用而產(chǎn)生的。9*吸收光譜曲線或光吸收曲線（absorptioncurve）：以波長為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)作圖。*最大吸收波長（maximumabsorptionwavelengh）：光吸收程度最大處的波長，用λmax表示*吸光度（absorbance）

在可見光，KMnO4溶液對波長525nm附近綠色光的吸收最強(qiáng)，而對紫色和紅色的吸收很弱。λmax=525nm。濃度不同時，光吸收曲線形狀相同，λmax不變，吸光度不同。10苯和甲苯在環(huán)己烷中的吸收光譜苯(254nm)甲苯(262nm)A23025027011

（4）不同濃度的同一種物質(zhì)，在某一定波長下吸光度A有差異，在λmax處吸光度A的差異最大。此特性可作為物質(zhì)定量分析的依據(jù)。（5）在λmax處吸光度隨濃度變化的幅度最大，所以測定最靈敏。吸收曲線是定量分析中選擇入射光波長的重要依據(jù)。133.目視比色法和吸光光度法的特點

特點靈敏度高：測定下限可達(dá)10-5～10-6mol/L,10-4%～10-5%準(zhǔn)確度能夠滿足微量組分的測定要求：相對誤差2～5％（1～2％）操作簡便快速應(yīng)用廣泛c141.朗伯-比爾定律（Lambert-Beerlaw）

當(dāng)一束平行單色光通過任何均勻、非散射的固體、液體或氣體介質(zhì)時，一部分被吸收，一部分透過介質(zhì)，一部分被器皿的表面反射。如圖6-3所示，設(shè)人射光強(qiáng)度為I'0，吸收光強(qiáng)度為Ia，透過光強(qiáng)度為It，反射光強(qiáng)度為Ir。6.1.2光吸收的基本定律15透射比或透光度（Transmittance）

透過光強(qiáng)度It與人射光強(qiáng)度Io之比稱為透射比或透光度，用T表示。溶液的透射比愈大，表示它對光的吸收愈小;相反，透射比愈小，表示它對光的吸收愈大。17

朗伯(LambertJH)和比爾(BeerA)分別于1760和1852年研究了光的吸收與溶液層的厚度及溶液濃度的定量關(guān)系，二者結(jié)合稱為朗伯-比爾定律，也稱為光的吸收定律。

當(dāng)一束強(qiáng)度為I0的平行單色光垂直照射到長度為b的液層、濃度為c的溶液時，由于溶液中吸光質(zhì)點(分子或離子)的吸收，通過溶液后光的強(qiáng)度減弱為It：A=lg(I0/It)=kbc吸光度介質(zhì)厚度(cm)18吸光度與光程的關(guān)系A(chǔ)=bc

光源檢測器0.00吸光度檢測器b樣品光源0.22吸光度光源檢測器0.44吸光度b樣品b樣品19K吸光系數(shù)Absorptivity

a的單位:L·g-1·cm-1當(dāng)c的單位用g·L-1表示時，用a表示，

A＝abc的單位:L·mol-1·cm-1當(dāng)c的單位用mol·L-1表示時，用表示.

－摩爾吸光系數(shù)MolarAbsorptivity

A＝bc

越大,靈敏度越高:

104～5×104為中等靈敏度;>105為高靈敏度;<104為低靈敏度.212.摩爾吸光系數(shù)ε的討論（1）吸收物質(zhì)在一定波長和溶劑條件下的特征常數(shù)（2）不隨濃度c和光程長度b的改變而改變。在溫度和波長等條件一定時，ε僅與吸收物質(zhì)本身的性質(zhì)有關(guān)，與待測物濃度無關(guān)；（3）可作為定性鑒定的參數(shù)；（4）同一吸收物質(zhì)在不同波長下的ε值是不同的。在最大吸收波長λmax處的摩爾吸光系數(shù)，常以εmax表示。εmax表明了該吸收物質(zhì)最大限度的吸光能力，也反映了光度法測定該物質(zhì)可能達(dá)到的最大靈敏度。

22桑德爾靈敏度（S）：

定義：當(dāng)儀器的檢測極限為A=0.001時，單位截面積光程內(nèi)所檢出的吸光物質(zhì)的最低含量。定義式：S=Cminb（C:g/cm3;b:cm）推導(dǎo)式：S=M/（g/cm2）232.吸光光度法和分光光度計光源單色器吸收池檢測系統(tǒng)穩(wěn)壓電源分光光度法的基本部件通過棱鏡或光柵得到一束近似的單色光.波長可調(diào),故選擇性好,準(zhǔn)確度高.25722型分光光度計結(jié)構(gòu)方框圖《基礎(chǔ)分析化學(xué)實驗》p93光源吸收池檢測系統(tǒng)分光系統(tǒng)26棱鏡：依據(jù)不同波長光通過棱鏡時折射率不同單色器入射狹縫準(zhǔn)直透鏡棱鏡聚焦透鏡出射狹縫白光紅紫λ1λ280060050040029光柵：在鍍鋁的玻璃表面刻有數(shù)量很大的等寬度等間距條痕(600、1200、2400條/mm)。M1M2出射狹縫光屏透鏡平面透射光柵光柵衍射示意圖原理：利用光通過光柵時發(fā)生衍射和干涉現(xiàn)象而分光.30檢測器SeAu，Ag半導(dǎo)體h硒光電池Ag、Au31光電管紅敏管625-1000nm藍(lán)敏管200-625nmNi環(huán)（片）堿金屬光敏陰極h32光電倍增管待掃描160-700nm1個光電子可產(chǎn)生106～107個電子331.顯色反應(yīng)的選擇*靈敏度高，一般ε>104*選擇性好*顯色劑在測定波長處無明顯吸收。

對照性好,λmax>60nm.*反應(yīng)生成的有色化合物組成恒定，穩(wěn)定。*顯色條件易于控制，重現(xiàn)性好。6.2光度分析法的設(shè)計6.2.1顯色反應(yīng)34：：：：助色團(tuán)－NH2，－OH，－X（孤對電子）ne2.顯色劑O生色團(tuán)：－N＝N－，－N＝O，OC=S,－N（共軛雙鍵）πe無機(jī)顯色劑:SCN-

[Fe(SCN)]2+H2O2

[TiO·H2O2]2+有機(jī)顯色劑:35有機(jī)顯色劑

CH3－C－C－CH3HO－NN－OH＝＝NNOHCOOHSO3HOO型：NNNOH

OHON型：PARNHNHNSNS型：雙硫腙NN型：丁二酮肟鄰二氮菲磺基水楊酸36

實驗條件包括:溶液酸度，顯色劑用量，試劑加入順序，顯色時間，顯色溫度，有機(jī)絡(luò)合物的穩(wěn)定性及共存離子的干擾等。（1）溶液的酸度M+HR===MR+H+*影響顯色劑的平衡濃度和顏色*影響被測金屬離子的存在狀態(tài)*影響絡(luò)合物的組成

pH與吸光度關(guān)系曲線確定pH范圍。6.2.2顯色條件的選擇37（2）顯色劑的用量M(被測組分)+R(顯色劑)==MR(有色絡(luò)合物)為使顯色反應(yīng)進(jìn)行完全，需加入過量的顯色劑。但顯色劑不是越多越好。有些顯色反應(yīng)，顯色劑加人太多，反而會引起副反應(yīng)，對測定不利。在實際工作中根據(jù)實驗結(jié)果來確定顯色劑的用量。

c(R)c(R)c(R)38（3）顯色反應(yīng)時間

有些顯色反應(yīng)瞬間完成，溶液顏色很快達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，并在較長時間內(nèi)保持不變;有些顯色反應(yīng)雖能迅速完成，但有色絡(luò)合物的顏色很快開始褪色;有些顯色反應(yīng)進(jìn)行緩慢，溶液顏色需經(jīng)一段時間后才穩(wěn)定。制作吸光度-時間曲線確定適宜時間。（4）顯色反應(yīng)溫度：顯色反應(yīng)大多在室溫下進(jìn)行。但是，有些顯色反應(yīng)必需加熱至一定溫度完成。（5）溶劑：有機(jī)溶劑降低有色化合物的解離度，提高顯色反應(yīng)的靈敏度。如在Fe(SCN)3的溶液中加入丙酮顏色加深。還可能提高顯色反應(yīng)的速率，影響有色絡(luò)合物的溶解度和組成等。39鄰二氮菲－亞鐵反應(yīng)完全度與pH的關(guān)系Fe2++3RH＋H＋A檸檬酸c(R)≈[R′]=10-4mol·L-1β3＝1021.3β3FeR340pH3～8為適宜的酸度范圍41（6）干擾及其消除方法a.控制溶液酸度b.加入掩蔽劑選取的條件是掩蔽劑不與待測離子作用，掩蔽劑以及它與干擾物質(zhì)形成的絡(luò)合物的顏色應(yīng)不干擾待測離子的測定。c.利用氧化還原反應(yīng)，改變干擾離子的價態(tài)d.利用校正系數(shù)e.用參比溶液消除顯色劑和某些共存有色離子的干擾。f.選擇適當(dāng)?shù)牟ㄩLg.當(dāng)溶液中存在有消耗顯色劑的干擾離子時，可通過增加顯色劑的用量來消除干擾。h.分離以上方法均不奏效時，采用預(yù)先分離的方法。426.2.3測量波長和吸光度范圍的選擇（1）測量波長的選擇為了使測定結(jié)果有較高的靈敏度，應(yīng)選擇被測物質(zhì)的最大吸收波長的光作為入射光，這稱為“最大吸收原則”（maximumabsorption）。選用這種波長的光進(jìn)行分析，不僅靈敏度高，且能減少或消除由非單色光引起的對朗伯-比爾定律的偏離。但是，在最大吸收波長處有其他吸光物質(zhì)干擾測定時，則應(yīng)根據(jù)入射光波長吸收最大，干擾最小的原則。43例丁二酮肟光度法測鋼中鎳，絡(luò)合物丁二酮肟鎳的最大吸收波長為470nm，但試樣中的鐵用酒石酸鈉掩蔽后，在470nm處也有一定吸收，干擾鎳的測定。為避免鐵的干擾，可以選擇波長520nm進(jìn)行測定，雖然測鎳的靈敏度有所降低，但酒石酸鐵不干擾鎳的測定。44（2）吸光度范圍的選擇

從儀器測量誤差的角度來看，為使測量結(jié)果得到較高的準(zhǔn)確度，一般應(yīng)控制標(biāo)準(zhǔn)溶液和被測試液的吸光度在0.2~0.8范圍內(nèi)?？赏ㄟ^控制溶液的濃度或選擇不同厚度的吸收池來達(dá)到目的。456.2.4參比溶液的選擇利用參比溶液來調(diào)節(jié)儀器的零點，可消除由吸收池壁及溶劑對入射光的反射和吸收帶來的誤差，扣除干擾的影響。參比溶液選擇：a試液及顯色劑均無色，蒸餾水作參比溶液。b顯色劑為無色，被測試液中存在其他有色離子，用不加顯色劑的被測試液作參比溶液。c顯色劑有顏色，可選擇不加試樣溶液的試劑空白作參比溶液。46d顯色劑和試液均有顏色，可將一份試液加入適當(dāng)掩蔽劑，將被測組分掩蔽起來，使之不再與顯色劑作用，而顯色劑及其他試劑均按試液測定方法加入，以此作為參比溶液，這樣就可以消除顯色劑和一些共存組分的干擾。e改變加入試劑的順序，使被測組分不發(fā)生顯色反應(yīng)，可以此溶液作為參比溶液消除干擾。4701234mg/mlA。。。。*0.80.60.40.20溶液濃度的測定A＝bc工作曲線法(校準(zhǔn)曲線)6.2.5標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作(p229)486.3光度分析法的誤差1對朗伯-比爾定律的偏離

在吸光光度分析中，經(jīng)常出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不呈直線的情況，特別是當(dāng)吸光物質(zhì)濃度較高時，明顯地看到通過原點向濃度軸彎曲的現(xiàn)象(吸光度軸彎曲)。這種情況稱為偏離朗伯-比爾定律。若在曲線彎曲部分進(jìn)行定量，將會引起較大的誤差。偏離朗伯－比爾定律的原因主要是儀器或溶液的實際條件與朗伯-比爾定律所要求的理想條件不一致。49（1）非單色光引起的偏離*朗伯-比爾定律只適用于單色光，但由于單色器色散能力的限制和出口狹縫需要保持一定的寬度，所以目前各種分光光度計得到的入射光實際上都是具有某一波段的復(fù)合光。由于物質(zhì)對不同波長光的吸收程度的不同，因而導(dǎo)致對朗伯－比爾定律的偏離。

50*克服非單色光引起的偏離的措施◎使用比較好的單色器，從而獲得純度較高的“單色光”，使標(biāo)準(zhǔn)曲線有較寬的線性范圍?！蛉松涔獠ㄩL選擇在被測物質(zhì)的最大吸收處，保證測定有較高的靈敏度，此處的吸收曲線較為平坦，在此最大吸收波長附近各波長的光的ε值大體相等，由于非單色光引起的偏離要比在其他波長處小得多?！驕y定時應(yīng)選擇適當(dāng)?shù)臐舛确秶?，使吸光度讀數(shù)在標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍內(nèi)。51（2）介質(zhì)不均勻引起的偏離朗伯－比爾定律要求吸光物質(zhì)的溶液是均勻的。如果被測溶液不均勻，是膠體溶液、乳濁液或懸浮液時，入射光通過溶液后，除一部分被試液吸收外，還有一部分因散射現(xiàn)象而損失，使透射比減少，因而實測吸光度增加，便標(biāo)準(zhǔn)曲線偏離直線向吸光度軸彎曲。故在光度法中應(yīng)避免溶液產(chǎn)生膠體或混濁。52（3）由于溶液本身的化學(xué)反應(yīng)引起的偏離溶液中的吸光物質(zhì)常因解離、締合、形成新化合物或互變異構(gòu)等化學(xué)變化而改變其濃度，因而導(dǎo)致偏離朗伯—比爾定律。A解離大部分有機(jī)酸堿的酸式、堿式對光有不同的吸收性質(zhì)，溶液的酸度不同，酸(堿)解離程度不同，導(dǎo)致酸式與堿式的比例改變，使溶液的吸光度發(fā)生改變。53

B絡(luò)合顯色劑與金屬離子生成的是多級絡(luò)合物，且各級絡(luò)合物對光的吸收性質(zhì)不同，例如在Fe(Ⅲ)與SCN-的絡(luò)合物中，F(xiàn)e(SCN)3顏色最深，F(xiàn)e(SCN)2+顏色最淺，故SCN-濃度越大，溶液顏色越深，即吸光度越大。c締合例如在酸性條件下，CrO42-會締合生成Cr2O72-，而它們對光的吸收有很大的不同。在分析測定中，要控制溶液的條件，使被測組分以一種形式存在，以克服化學(xué)因素所引起的對朗伯－比爾定律的偏離。542吸光度測量的誤差在吸光光度分析中，儀器測量不準(zhǔn)確也是誤差的主要來源。任何光度計都有一定的測量誤差。這些誤差可能來源于光源不穩(wěn)定，實驗條件偶然變動，讀數(shù)不準(zhǔn)確等。

在光度計中，透射比的標(biāo)尺刻度均勻。吸光度標(biāo)尺刻度不均勻。對于同一儀器，讀數(shù)的波動對透射比為一定值；而對吸光度讀數(shù)波動則不再為定值。吸光度越大，讀數(shù)波動所引起的吸光度誤差也越大55

透射比很小或很大時，濃度測量誤差都較大，即光度測量最好選吸光度讀數(shù)在刻度尺的中間而不落兩端。待測溶液的透射比T在15%~65%之間，或使吸光度A在0.2~0.8之間，才能保證測量的相對誤差較小。當(dāng)A=0.434(或透射比T=36.8%)時，測量的相對誤差最小。

566.4其他吸光光度法及吸光光度法應(yīng)用1示差吸光光度法2雙波長吸光光度法3弱酸和弱堿解離常數(shù)的測定4絡(luò)合物組成的測定57（1）示差吸光光度法的原理

吸光光度法一般僅適用于微量組分的測定，當(dāng)待測定組分濃度過高或過低，會引起很大的測量誤差，導(dǎo)致準(zhǔn)確度降低。示差吸光光度法可克服這一缺點。目前，主要有高濃度示差吸光光度法、低濃度示差吸光光度法和使用兩個參比溶液的精密示差吸光光度法。它們的基本原理相同，且以高濃度示差吸光光度法應(yīng)用最多，僅介紹高濃度示差吸光光度法。6.4.1示差吸光光度法58

吸光度差與這兩種溶液的濃度差成正比。以把空白溶液作為參比的稀溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線作為ΔA和Δc的標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)測得的ΔA求出相應(yīng)的Δc值，從cx=co+c可求出待測試液的濃度，這就是示差吸光光度法定量的基本原理。59（2）示差吸光光度法的誤差Δc(即cx－co)，測量誤差為x%，結(jié)果為cx±(cx-co)×x%；普通光度法的結(jié)果為cx±cx·x%。因cx只是稍大于co，故cx總是遠(yuǎn)大于Δc，故示差吸光光度法的準(zhǔn)確度高。參比溶液的濃度越接近待測試液的濃度，測量誤差越小，最小誤差可達(dá)0.3%。60（1）雙波長吸光光度法的原理

使兩束不同波長的單色光以一定的時間間隔交替地照射同一吸收池，測量并記錄兩者吸光度的差值。這樣就可以從分析波長的信號中扣除來自參比波長的信號，消除各種干擾，得待測組分的含量。分析方法的靈敏度、選擇性及測量的精密度高。被廣泛用于環(huán)境試樣及生物試樣的分析。6.4.2雙波長吸光光度法61

ΔA與吸光物質(zhì)濃度成正比。這是定量的理論依據(jù)。只用一個吸收池，以試液本身對某一波長的光的吸光度為參比，消除了因試液與參比液及兩個吸收池之間的差異引起的測量誤差，提高測量的準(zhǔn)確度。62（2）雙波長吸光光度法的應(yīng)用*混濁試液中組分測定：一般選擇待測組分的最大吸收波長為測量波長(λl)，選擇與其相近而兩波長相差在40~60nm范圍內(nèi)且有較大的ΔA值的波長為參比波長。*單組分的測定：進(jìn)行單組分的測定，以絡(luò)合物吸收峰作測量波長，參比波長的選擇有：以等吸收點為參比波長;以有色絡(luò)合物吸收曲線下端的某一波長作為參比波長；以顯色劑的吸收峰為參比波長。63*兩組分共存時的分別測定：當(dāng)兩種組分的吸收光譜有重疊時，要測定其中一個組分就必須消除另一組分