流式細胞術在腫瘤學中應用

內(nèi)容流式細胞儀概念、原理及應用流式細胞術優(yōu)勢流式細胞術在腫瘤學中的應用第一頁，共36頁。

流式細胞術（FlowCytometry）是利用流式細胞儀檢測細胞或其它顆粒性物質(zhì)的物理、化學特性。同時利用熒光染料,激光技術,單抗技術以及計算機技術的發(fā)展,大大提高了檢測速度與統(tǒng)計精確性,而且從同一個細胞中可以同時測得多種參數(shù),為生物醫(yī)學與臨床檢驗學發(fā)展提供了一個全新的視角和強有力的手段。

流式細胞術第二頁，共36頁。流式細胞儀檢測流程第三頁，共36頁。流式細胞術優(yōu)勢（分析型）高速測定細胞，大樣本計數(shù)檢測稀有細胞多參數(shù)分析第四頁，共36頁。FC500流式細胞儀第五頁，共36頁。流式細胞術的應用檢測特性：大小、顆粒度、細胞受體/分子、核酸(DNA/RNA)、蛋白……第六頁，共36頁。腫瘤學中的應用腫瘤免疫腫瘤細胞周期和凋亡腫瘤干細胞的研究血液中循環(huán)腫瘤細胞的研究第七頁，共36頁。腫瘤免疫學

天然免疫中性粒細胞嗜酸性細胞嗜堿性細胞單核細胞/巨噬細胞樹突細胞:mDC-pDCNK細胞NKT細胞T淋巴細胞CD5+B細胞獲得性免疫B細胞輔助性T細胞 Th1 Th2細胞毒T細胞調(diào)節(jié)性T細胞第八頁，共36頁。淋巴細胞免疫分型

T細胞：CD3+CD4+(Th，Treg)CD8+(Tc)B細胞：CD19+NK細胞：CD3-CD56+第九頁，共36頁。腫瘤細胞免疫特點CD3CD4CD8CD4/CD8NKCIK正常正常正常正常正常正常正常正常正常正常正常第十頁，共36頁。Th1Th2細胞因子分泌細胞測定Th1細胞：介導細胞免疫、細胞毒性T細胞的生長和活化、巨噬細胞的活化、介導遲發(fā)型過敏反應。其功能亢進將導致炎癥慢性遷延，器官特異性自身免疫病，急性排異反應和接觸性皮炎等的發(fā)病和免疫病理損傷。Th2細胞：介導體液免疫，促進B細胞的生長、活化和分化，是IgG1和IgE類抗體的轉換因子，其功能亢進將導致特異性過敏反應，參與高IgE綜合癥和嗜酸性粒細胞增多癥。第十一頁，共36頁。Th1/Th2漂移與腫瘤免疫腫瘤可使Th1/Th2平衡向Th2偏移,而Th1/Th2偏移又會促進腫瘤的發(fā)展,故探討Th1/Th2功能狀況以判斷腫瘤患者的免疫狀態(tài)可為腫瘤生物治療提供有效的理論依據(jù)。第十二頁，共36頁。CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞調(diào)節(jié)性T細胞具有免疫抑制功能，在多種免疫性疾病中起重要的調(diào)節(jié)作用，成為近年來免疫學領域研究的重要內(nèi)容。第十三頁，共36頁。

許多研究表明：在實體腫瘤和血液惡性腫瘤患者中Treg數(shù)目增多。在乳腺癌、卵巢癌、肺癌以及肝癌等多種實體腫瘤患者外周血和腫瘤局部微環(huán)境中,Treg比例增高,且數(shù)目與患者腫瘤進展程度和預后、生存率呈負相關。血液惡性腫瘤患者中Treg數(shù)目呈腫瘤發(fā)展階段相關性增長。但是,Treg增高的機制尚不清楚。去除Treg或封閉其抑制功能，可以增強抗腫瘤免疫反應。第十四頁，共36頁。化療作為一種重要的治療腫瘤的方法,對腫瘤患者外周血中的Treg數(shù)目可產(chǎn)生一定影響。化療藥物可能通過抑制腫瘤微環(huán)境中血管生成,促進Treg凋亡,從而起到有效控制腫瘤的作用。但也有報道證明腫瘤患者接受化療后,外周血中Treg數(shù)目增多。第十五頁，共36頁?；熅烤箤reg會產(chǎn)生怎樣的影響,目前尚無定論,有待于進一步研究。因此,Treg在腫瘤治療方面的應用成為研究的熱點。如何清除或逆轉Treg的抑制作用是腫瘤免疫治療的一個關鍵問題。第十六頁，共36頁。樹突狀細胞(DC)

DC控制體內(nèi)免疫和耐受的平衡控制T,B細胞對可溶性抗原的反應影響產(chǎn)生免疫球蛋白的分類DC亞群分為MDC和PDCMDC誘導免疫應答PDC誘導免疫耐受第十七頁，共36頁。樹突狀細胞流式分析陰性表達抗原設門Lin(CD3,14,19,20,56)/HLADR組合DC:Lin-/HLADR+DC亞群分析骨髓DC:CD11c+外周血DC:CD123+(IL3Ra)陽性表達抗原設門CD85k(ILT3)陽性設門僅在單核巨噬細胞及DC細胞表達比HLADR表達更具特異性

避免陰性設門DifferentiationofDCsubsets:外周血DC:CD123+(IL3Ra)骨髓DC:CD33+第十八頁，共36頁。ILT3-PEILT3-PECD14+CD16-FITCCD33-PC5CD33-PC51234骨髓DC:CD14CD16/CD85K（ILT3）/CD33第十九頁，共36頁。ILT3-PEILT3-PECD14+CD16-FITCCD123-PC5CD123-PC5外周血DC:CD14CD16/CD85K（ILT3）/CD123第二十頁，共36頁。生物免疫治療

CIK細胞(cytokine-inducedkiller)是一群以CD3+T細胞為主的異質(zhì)性細胞群體，包括CD3+CD56-、CD3-CD56+及CD3+CD56+三種亞群,主要效應細胞為CD3+CD56+細胞。

CIK細胞來源于外周血中的CD4-CD8+及CD4-CD8-T細胞。因其同時表達CD3和CD56兩種膜蛋白分子，故兼有T淋巴細胞強大的抗瘤活性和NK細胞非MHC限制性殺瘤特點，是目前所知殺傷活性最強的一種免疫效應細胞。第二十一頁，共36頁。CIK細胞治療過程的評價治療前病人免疫狀況評價T亞群、NK、CIK、細胞因子是否適合做、能否能培養(yǎng)、值得做CIK采集MNCMNC數(shù)目、純度、T亞群、NK、CIK數(shù)目及比例是否達到培養(yǎng)要求、調(diào)節(jié)細胞數(shù)MNC數(shù)目、T亞群、NK、CIK數(shù)目及比例、CD3、CD8活化狀況培養(yǎng)培養(yǎng)是否達標、回輸時機回輸后T亞群、NK、CIK、細胞因子療效評價、監(jiān)測、下次治療的時機CIK治療程序FCM檢測項目意義第二十二頁，共36頁。CIK治療前患者的免疫功能評價評價的項目免疫功能六項：CD3、CD4、CD8、CD4/CD8、NK、CIKTh1/Th2細胞因子

第二十三頁，共36頁。FCM檢測的方法

免疫功能六項試劑：CD45/CD4/CD8/CD3、CD3/CD56/CD45

標本類型：外周抗凝血評價的指標：CD3%、CD4%、CD8%、NK%、CIK%（也可以做絕對計數(shù)）第二十四頁，共36頁。評價的意義1、CIK治療的適應癥：除外T細胞相關腫瘤、有可見包塊2、是否適合做3、能否培養(yǎng)4、值不值得做第二十五頁，共36頁。腫瘤細胞免疫特點CD3CD4CD8CD4/CD8NKCIK正常正常正常正常正常正常正常正常正常正常正常第二十六頁，共36頁。采集物評價（培養(yǎng)體系）評價的項目

MNC數(shù)目、純度、T亞群、NK、CIK數(shù)目及比例FCM方法評價評價的意義是否達到培養(yǎng)要求、調(diào)節(jié)細胞數(shù)第二十七頁，共36頁。培養(yǎng)中的監(jiān)測評價的項目1.MNC數(shù)目、T亞群、NK、CIK數(shù)目及比例、CD3、CD8活化狀況2.培養(yǎng)體系中的細胞因子水平3.CIK細胞質(zhì)量：壞死、凋亡狀況評價方法：FCM評價的意義：培養(yǎng)是否達標、回輸時機第二十八頁，共36頁。確定回輸時間及培養(yǎng)物是否達到要求:CIK細胞一般在7-9天要求:

CD3細胞大于90%

CD8細胞大于60%

CIK細胞0.5~1X