生物工程下游技術(shù)-緒論

生物工程技術(shù)20世紀(jì)70年代初開(kāi)始興起的一門(mén)新興的綜合性應(yīng)用學(xué)科；以生物學(xué)（分子生物學(xué)、微生物學(xué)、遺傳學(xué)、生物化學(xué)和細(xì)胞學(xué)）的理論和技術(shù)為基礎(chǔ)；結(jié)合化工、機(jī)械、電子計(jì)算機(jī)等現(xiàn)代工程技術(shù)；充分運(yùn)用分子生物學(xué)的最新成就，自覺(jué)地操縱遺傳物質(zhì)，定向地改造生物或其功能，創(chuàng)造出具有新物種，再通過(guò)合適的生物反應(yīng)器對(duì)這類“工程菌”或“工程細(xì)胞株”進(jìn)行大規(guī)模的培養(yǎng)。第一頁(yè)，共40頁(yè)。生物工程產(chǎn)業(yè)領(lǐng)域生物制藥（抗生素，基因重組蛋白，氨基酸，疫苗，菌苗，天然藥物，生化藥物，血液制品，抗體，多糖，多肽）生物化工（乳酸，檸檬酸，蘋(píng)果酸，丙烯酸，甘油，異丙醇，乙烯）生物能源（甲醇，乙醇，生物柴油，生物汽油）生物材料（明膠，膠原蛋白，人造皮膚，人造骨，人造臟器）生物醫(yī)學(xué)（診斷試劑，基因治療，人及生物克?。┉h(huán)境生物（環(huán)境治理，水污染，土壤污染，風(fēng)沙治理）生物食品（醋，啤酒業(yè)，釀酒，乳制品，奶制品）生物資源（動(dòng)物，植物，微生物）生物農(nóng)業(yè)（基因食品，基因植物）第二頁(yè)，共40頁(yè)。生物工程的上中下游技術(shù)上游：菌種，基因工程，分子生物學(xué)，遺傳學(xué)中游：微生物發(fā)酵工程，動(dòng)植物細(xì)胞，海洋生物培養(yǎng)下游：生物分離工程第三頁(yè)，共40頁(yè)?；蛑亟M蛋白

從實(shí)驗(yàn)室研究到中試生產(chǎn)第四頁(yè)，共40頁(yè)。重組人粒細(xì)胞集落刺激因子（granulocyte-colony-stimulatingfactor,G-CSF）1998年國(guó)家Ⅱ類新藥證書(shū)((98)衛(wèi)藥證字S-09)

2000年廣東省科技進(jìn)步二等獎(jiǎng)(2000-J-2-R02-X058)：《重組蛋白質(zhì)表達(dá)、復(fù)性、純化新工藝及人G-CSF新藥研制》（王小寧，方向東，寧云山，馬驪，張亞莉，賀海平，林來(lái)興妹，黃樹(shù)其，胡志明，陳澤洪）第五頁(yè)，共40頁(yè)。轉(zhuǎn)讓：江蘇吳中實(shí)業(yè)股份有限公司（1200萬(wàn)）商品名—潔欣第六頁(yè)，共40頁(yè)。生物工程下游技術(shù)的定義和階段定義：對(duì)于由生物界自然產(chǎn)生的或由微生物菌體發(fā)酵的、動(dòng)植物細(xì)胞組織培養(yǎng)的、酶反應(yīng)等各種生物工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程獲得的生物原料，經(jīng)提取分離、加工并精制目的成分，最終使其成為產(chǎn)品的技術(shù),又稱為生物分離工程。通常分為四個(gè)階段：培養(yǎng)液的預(yù)處理與固液分離初步純化（提純）高度純化（精制）成品加工第七頁(yè)，共40頁(yè)。時(shí)間短；溫度低；pH適中（選擇在生物物質(zhì)的溫度范圍內(nèi)）；嚴(yán)格清洗消毒（包括廠房、設(shè)備及管路，注意死角）;對(duì)基因工程產(chǎn)品還應(yīng)注意生物安全（biosafety）問(wèn)題，要防止菌體擴(kuò)散，一般要求在密封的環(huán)境下操作。下游加工過(guò)程應(yīng)遵循的原則第八頁(yè)，共40頁(yè)。生物工程下游技術(shù)特點(diǎn)依賴重要的獨(dú)立技術(shù)體系：生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程的經(jīng)濟(jì)環(huán)節(jié)和最重要的技術(shù)是“下游技術(shù)”，對(duì)生物工程工業(yè)制品的質(zhì)量和產(chǎn)量產(chǎn)生直接影響。占成本費(fèi)用的大部分：最重要的問(wèn)題是減少損耗成本，目前可占總成本的50％以上，因此愈來(lái)愈受到人們的關(guān)注。第九頁(yè)，共40頁(yè)。生物工程下游技術(shù)的發(fā)展歷程

古代釀造業(yè)包括釀酒、制醬（油）、醋、酸奶和干酪等。技術(shù)原始、家庭式作坊、產(chǎn)物基本不經(jīng)過(guò)后處理而直接使用，無(wú)下游技術(shù)。

釀泉為酒，泉香而酒洌?！ㄋ危W陽(yáng)修《醉翁亭記》張藝謀《紅高粱》第十頁(yè)，共40頁(yè)。生物工程下游技術(shù)的發(fā)展歷程

第一代：19世紀(jì)60年代20世紀(jì)40年代發(fā)現(xiàn)了發(fā)酵的本質(zhì)是微生物的作用，掌握了純種培養(yǎng)技術(shù)，生物技術(shù)進(jìn)入近代釀造產(chǎn)業(yè)的發(fā)展階段。到20世紀(jì)上半葉，逐漸開(kāi)發(fā)形成了發(fā)酵法生產(chǎn)酒精、丙酮、丁醇等微生物發(fā)酵工業(yè)（厭氧發(fā)酵），其產(chǎn)品相對(duì)簡(jiǎn)單，基本上是無(wú)活性的小分子。此時(shí)開(kāi)始引入過(guò)濾、蒸餾、精餾等近代分離技術(shù)。第十一頁(yè)，共40頁(yè)。生物工程下游技術(shù)的發(fā)展歷程

第二代：20世紀(jì)40年代以青霉素產(chǎn)品為代表；無(wú)菌空氣制備技術(shù)、大型好氧發(fā)酵裝置開(kāi)發(fā)；一大批通風(fēng)發(fā)酵技術(shù)產(chǎn)品相繼投入了工業(yè)生產(chǎn)，如抗生素（鏈霉素）、氨基酸（谷氨酸）、有機(jī)酸（核酸、檸檬酸）、酶制劑（淀粉酶）、微生物多糖和單細(xì)胞蛋白等。產(chǎn)品多樣性決定了分離方法的多樣性。借鑒和引進(jìn)吸收了大量的近代化學(xué)工業(yè)的分離技術(shù)，如沉淀、離子交換、萃取、結(jié)晶等。第十二頁(yè)，共40頁(yè)。生物工程下游技術(shù)的發(fā)展歷程

第三代：20世紀(jì)70年代末以崛起的DNA重組技術(shù)及細(xì)胞融合技術(shù)為代表。在主要領(lǐng)域：基因工程、酶工程、細(xì)胞工程和微生物發(fā)酵工程取得了長(zhǎng)足進(jìn)步，一批高附加值的產(chǎn)品開(kāi)始面世，如乙肝疫苗、干擾素等。80年代，發(fā)現(xiàn)了一大批生理功能性物質(zhì)，如活性糖質(zhì)、活性肽、高度不飽和脂肪酸等，在深度和廣度上都取得了很大的進(jìn)展。新技術(shù)有超臨界CO2萃取技術(shù)、膜過(guò)濾、滲透蒸發(fā)技術(shù)、各種色譜（層析）技術(shù)等。第十三頁(yè)，共40頁(yè)。生物分離技術(shù)-發(fā)展歷程現(xiàn)世界范圍內(nèi)生化分離的色譜介質(zhì)及電泳裝置技術(shù)大多來(lái)自Sweden,

Uppsala（烏普薩拉）大學(xué)20世紀(jì)20年代初：超高速離心技術(shù)1930年：采用移動(dòng)界面電泳分離血清蛋白與三種球蛋白（α、β、γ）20世紀(jì)40年代末：色譜分離技術(shù)

1959年：凝膠過(guò)濾層析技術(shù)(gelfiltrationchromatography)

1960年：等電聚焦凝膠電泳20世紀(jì)70年代：金屬親和色譜分離技術(shù)毛細(xì)管電泳技術(shù)

第十四頁(yè)，共40頁(yè)。1924年，Svedberg發(fā)明超高速離心機(jī)，并首次從血液中分離出血紅蛋白（Hb）。1926年，Svedberg獲得諾貝爾獎(jiǎng)。瑞典Uppsala大學(xué)第十五頁(yè)，共40頁(yè)。電泳（electrophoresis）電泳：帶電顆粒在電場(chǎng)作用下，向著與其電性相反的電極移動(dòng)。電泳技術(shù)：利用帶電粒子在電場(chǎng)中移動(dòng)速度不同而達(dá)到分離的技術(shù)。常見(jiàn)：區(qū)帶電泳、移動(dòng)界面電泳、等電聚焦電泳、等速電泳。第十六頁(yè)，共40頁(yè)。瓊脂糖(agarose)凝膠電泳(核酸電泳)凝膠的孔徑較大，可用于生物大分子（核酸）的分離，現(xiàn)分離核酸手段主要為瓊脂糖電泳。電泳的驅(qū)動(dòng)力靠DNA骨架本身負(fù)電荷。現(xiàn)常用1%的瓊脂糖?？蓞^(qū)分相差100bp的DNA片段，分辨率雖比聚丙烯酰胺凝膠低，但它制備容易，分離范圍廣，因此在核酸分離中得到廣泛應(yīng)用第十七頁(yè)，共40頁(yè)。聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）

凝膠孔徑較小，常用于蛋白質(zhì)與寡糖核苷酸的分離。驅(qū)動(dòng)力是與蛋白質(zhì)結(jié)合的SDS上所攜帶的負(fù)電荷。根據(jù)蛋白分子量亞基的不同而分離蛋白。蛋白質(zhì)亞基的電泳遷移率主要取決于亞基分子量的大小,電荷因素可以忽視。第十八頁(yè)，共40頁(yè)。聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）濃縮膠(stackinggel):起堆積作用，凝膠濃度較小，孔徑較大，把較稀的樣品加在濃縮膠上，經(jīng)過(guò)大孔徑凝膠的遷移作用而被濃縮至一個(gè)狹窄的區(qū)帶（同一起跑線）。分離膠(runninggel)：起分離作用，凝膠濃度較高，孔徑較小，在濃縮膠濃縮的區(qū)帶經(jīng)過(guò)分離膠的分離作用可根據(jù)蛋白分子量亞基的大小而被分離成多條區(qū)帶。第十九頁(yè)，共40頁(yè)。SDS-PAG配方意義丙烯酰胺:形成聚丙烯酰胺凝膠后作為網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)起分子篩作用。Tris-HCl：Tris形成緩沖體系，HCl為電泳環(huán)境提供離子環(huán)境。十二烷基硫酸鈉（SDS）：與蛋白質(zhì)結(jié)合，令蛋白所帶負(fù)電荷大大超過(guò)蛋白原有電荷量，從而消除了不同蛋白質(zhì)的電荷對(duì)電泳條帶的影響。過(guò)硫酸銨（AP）：催化丙烯酰胺單體聚合成聚丙烯酰胺。四甲基二乙胺（TEMED）:促進(jìn)AP產(chǎn)生自由基而促進(jìn)聚丙烯酰胺凝膠的形成。第二十頁(yè)，共40頁(yè)。等電聚焦電泳Uppsala大學(xué)于1941年提出;建立pH值梯度，蛋白質(zhì)在該pH值梯度中移動(dòng)到和其等電點(diǎn)一致的pH值點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)會(huì)停止移動(dòng)而該點(diǎn)產(chǎn)生聚焦作用。用途：生物分子分離與分析。第二十一頁(yè)，共40頁(yè)。雙向電泳

（two-dimensionalelectrophoresis，2-DE）雙向電泳是等電聚焦電泳和SDS的組合，即先進(jìn)行等電聚焦電泳(按照pI分離),然后再進(jìn)行SDS(按照分子大小)經(jīng)染色得到的電泳圖是個(gè)二維分布的蛋白質(zhì)圖。應(yīng)用：蛋白質(zhì)組研究的核心技術(shù)。第二十二頁(yè)，共40頁(yè)。凝膠過(guò)濾層析

(gelfiltrationchromatography)又稱排阻層析或分子篩方法；層析柱中的填料是交聯(lián)的聚糖，如葡聚糖（Sephndex）或瓊脂糖（Sepharose），使蛋白質(zhì)混合物中的物質(zhì)按分子大小的不同進(jìn)行分離。第二十三頁(yè)，共40頁(yè)。親和色譜將一對(duì)能可逆結(jié)合和解離生物分子的一方作為配基（也稱為配體），與具有大孔徑、親水性的固相載體相偶聯(lián)、制成專一的親和吸附劑；當(dāng)含有被分離物質(zhì)的混合物隨著流動(dòng)相流經(jīng)色譜柱時(shí)，親和吸附劑上的配基就有選擇地吸附能與其結(jié)合的物質(zhì)，而其他的蛋白質(zhì)及雜質(zhì)不被吸附，從色譜柱中流出，使用適當(dāng)?shù)木彌_液使被分離物質(zhì)與配基解吸附，即可獲得純化的目的產(chǎn)物。

配體實(shí)例染料親和色譜：染料活性藍(lán)染料-丙酮酸激酶金屬離子親和色譜：金屬離子鎳柱-組氨酸標(biāo)簽第二十四頁(yè)，共40頁(yè)。生物分離過(guò)程的一般流程第二十五頁(yè)，共40頁(yè)。

發(fā)酵液的特點(diǎn)

粘度(viscosity)大；目標(biāo)產(chǎn)物含量低，分布在液相；含高價(jià)無(wú)機(jī)離子（Ca2+、Mg2+、Fe3+）；菌體自溶產(chǎn)生核酸、蛋白質(zhì)及有機(jī)粘性物質(zhì)；相當(dāng)多的副產(chǎn)物和色素（pigment）。第二十六頁(yè)，共40頁(yè)。預(yù)處理的目的改變發(fā)酵液的物理性質(zhì)，促進(jìn)從懸浮液中分離固形物的速度，便于后期進(jìn)行固液分離；盡可能使產(chǎn)物轉(zhuǎn)入便于后處理的相中（多數(shù)是液相）；去除發(fā)酵液中的部分雜質(zhì)，以利于后續(xù)各步操作。第二十七頁(yè)，共40頁(yè)。發(fā)酵液預(yù)處理的方法去除雜質(zhì)(雜蛋白、無(wú)機(jī)離子、色素、熱原、毒性物質(zhì)等):鹽析法(saltfractionation)等電點(diǎn)沉淀法(isoelectricprecipitation，IP)加熱法(heating)有機(jī)溶劑法(organicagents)吸附法（adsorption）改善發(fā)酵液的性能：降低發(fā)酵液的黏度；調(diào)節(jié)pH值和溫度;絮凝與凝聚;第二十八頁(yè)，共40頁(yè)。方法原理優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)離心離心力作用下使顆粒沉降常用于小顆粒、熱穩(wěn)性差的分子回收，適用于實(shí)驗(yàn)室操作容量有限產(chǎn)量小，連續(xù)性操作差，設(shè)備成本高過(guò)濾根據(jù)過(guò)濾介質(zhì)空隙大小進(jìn)行分離常用于大顆粒固體過(guò)濾，可大規(guī)模進(jìn)行工業(yè)應(yīng)用分離速度慢，效果受物料性質(zhì)變化的影響，勞動(dòng)強(qiáng)度大膜分離依據(jù)被分離分子和膜孔大小進(jìn)行分離操作簡(jiǎn)單，常用于細(xì)胞的分離膜易污染，效果與個(gè)人操作技巧和物料性質(zhì)密切，需精心保養(yǎng)固液分離技術(shù)生物產(chǎn)品分離純化過(guò)程中重要單元；常見(jiàn)技術(shù)第二十九頁(yè)，共40頁(yè)。細(xì)胞破碎許多生物產(chǎn)物都是胞內(nèi)物質(zhì)，此時(shí)需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行收集以及破碎，使細(xì)胞壁和細(xì)胞膜受到不同程度的破壞，進(jìn)而釋放其中的目標(biāo)產(chǎn)物。第三十頁(yè)，共40頁(yè)。包涵體（inclusion

bodies,IB)在E.coli中表達(dá)的重組蛋白質(zhì),往往形成不溶解的無(wú)活性重組蛋白質(zhì)的細(xì)胞內(nèi)聚集物即包涵體。包涵體蛋白質(zhì)的溶解、復(fù)性和純化過(guò)程需要變性劑(如尿素、鹽酸胍、SDS等)的幫助。

由于包涵體蛋白質(zhì)分子中Cys的側(cè)鏈巰基常為還原態(tài),有時(shí)會(huì)形成錯(cuò)配的S一S鍵,因此溶解包涵體時(shí)加入還原劑(如DTT、巰基乙醇等),可使目標(biāo)蛋白質(zhì)錯(cuò)配的S一S鍵打開(kāi)。經(jīng)變性劑和還原劑處理的處于變性狀態(tài)的蛋白質(zhì),需經(jīng)過(guò)再氧化和再折疊(refolding)過(guò)程使其復(fù)性。第三十一頁(yè)，共40頁(yè)。

復(fù)性(refolding)方法

稀釋法(dilution)透析法(dialysis)超濾法(ultrafiltration)寧云山，李妍，王小寧.包含體蛋白質(zhì)的復(fù)性研究進(jìn)展,《生物技術(shù)通訊》，2001，12（3），237-240李妍，寧云山，郝文波，李莉，李明.

惡性瘧原蟲(chóng)谷氨酸脫氫酶融合蛋白復(fù)性及純化的研究.第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，23（12）：1273-1276.第三十二頁(yè)，共40頁(yè)。生物產(chǎn)品萃取技術(shù)(extraction)今化學(xué)工業(yè)普遍采用的分離方法，具有傳質(zhì)速率快、生產(chǎn)周期短、便于連續(xù)操作、容易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)控制、分離效率高、生產(chǎn)能力大等一系列優(yōu)點(diǎn)。分類：雙水相萃取(aqueoustwo-phaseextraction,ATPE)反膠團(tuán)萃?。?reversedmicellarextraction)親和萃取(affinityextraction)超臨界萃?。╯upercriticalfluidextraction，SFE）

第三十三頁(yè)，