第十二章機(jī)體免疫功能的檢測(cè)技術(shù)詳解演示文稿

第十二章機(jī)體免疫功能的檢測(cè)技術(shù)詳解演示文稿現(xiàn)在是1頁\一共有88頁\編輯于星期五優(yōu)選第十二章機(jī)體免疫功能的檢測(cè)技術(shù)現(xiàn)在是2頁\一共有88頁\編輯于星期五第一節(jié)免疫細(xì)胞的分離與純化一、白細(xì)胞的分離二、外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離三、淋巴細(xì)胞及其亞群的分離四、其他細(xì)胞的分離和收集

返回現(xiàn)在是3頁\一共有88頁\編輯于星期五1．自然沉降分離法2．聚合物加速沉淀法返回一、白細(xì)胞的分離血液中紅細(xì)胞與白細(xì)胞比例約600~1000:1現(xiàn)在是4頁\一共有88頁\編輯于星期五上層：淡黃色血漿灰白層：白細(xì)胞底層：紅細(xì)胞返回1．自然沉降分離法室溫靜置30-60min現(xiàn)在是5頁\一共有88頁\編輯于星期五2．聚合物加速沉淀法返回某些高分子聚合物（如明膠、右旋糖酐、甲基纖維素和聚乙烯吡咯烷酮等）可使紅細(xì)胞凝聚成串，加速紅細(xì)胞沉降，使之更易與白細(xì)胞分離。現(xiàn)在是6頁\一共有88頁\編輯于星期五1.Ficoll分層液法2.Percoll分層液法二、外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離返回人外周血細(xì)胞的密度為：紅細(xì)胞1.093，粒細(xì)胞1.092，單個(gè)核細(xì)胞1.075～1.090，血小板1.030～1.035?，F(xiàn)在是7頁\一共有88頁\編輯于星期五1.Ficoll分層液法◆Ficoll分層液法即聚蔗糖－泛影葡胺密度梯度離心分離法（ficoll-hypaquedensitygradientcentrifugation)◆聚蔗糖密度：1.020泛影葡胺密度：1.200◆外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）密度：人：1.077小鼠：1.088馬：1.090現(xiàn)在是8頁\一共有88頁\編輯于星期五用Ficoll分離外周血單個(gè)核細(xì)胞返回95%2000rpm20min現(xiàn)在是9頁\一共有88頁\編輯于星期五2.Percoll分層液法◆Percoll是聚乙烯吡咯烷酮包被的硅膠混懸液的商品名，為一種無細(xì)胞毒無刺激的新型密度梯度分層液。◆Percoll原液（密度1.135）+8.5%NaCl或1.5MPBS(9:1)Percoll濃度（%）706050403020比重（g/ml)1.0901.0771.0671.0561.0431.031現(xiàn)在是10頁\一共有88頁\編輯于星期五用Percoll分離外周血單個(gè)核細(xì)胞返回75%98%血小板現(xiàn)在是11頁\一共有88頁\編輯于星期五三、淋巴細(xì)胞及其亞群的分離1.紅細(xì)胞的去除2.血小板的去除3.單核細(xì)胞的去除4.淋巴細(xì)胞亞群的分離返回現(xiàn)在是12頁\一共有88頁\編輯于星期五1.紅細(xì)胞的去除（1）低滲裂解法：蒸餾水（2）氯化銨處理法：0.83%氯化銨返回PBMC+1mlH2O輕輕振搖不超過1min加入等量1.8%生理鹽水去除紅細(xì)胞碎片現(xiàn)在是13頁\一共有88頁\編輯于星期五3.單核細(xì)胞的去除（1）粘附貼壁法：在玻璃或塑料平皿中于37℃溫箱靜置1h現(xiàn)在是14頁\一共有88頁\編輯于星期五玻璃纖維或葡聚糖凝膠吸附單核細(xì)胞，收集未吸附的淋巴細(xì)胞（2）吸附柱過濾法：?jiǎn)魏思?xì)胞37℃1-2h淋巴細(xì)胞現(xiàn)在是15頁\一共有88頁\編輯于星期五（3）磁鐵吸引法：加入直徑為3um的羰基鐵顆粒，待單核細(xì)胞充分吞噬顆粒后，再用磁鐵將單核細(xì)胞吸至管底，上層液中則含有較純的淋巴細(xì)胞。返回現(xiàn)在是16頁\一共有88頁\編輯于星期五4.淋巴細(xì)胞亞群的分離（1）E-玫瑰花環(huán)沉降法（2）尼龍棉纖維分離法（3）親和分離法（4）抗體/補(bǔ)體介導(dǎo)的特異性細(xì)胞毒作用分離法（5）免疫磁珠分離法（6）流式細(xì)胞儀分離法返回現(xiàn)在是17頁\一共有88頁\編輯于星期五（1）E-玫瑰花環(huán)沉降法返回現(xiàn)在是18頁\一共有88頁\編輯于星期五（2）尼龍棉纖維分離法T細(xì)胞：不吸附B細(xì)胞：吸附T細(xì)胞(90%)B細(xì)胞(80%)37℃1-2h返回10-20%小牛血清培養(yǎng)液現(xiàn)在是19頁\一共有88頁\編輯于星期五（3）親和分離法返回現(xiàn)在是20頁\一共有88頁\編輯于星期五（4）抗體/補(bǔ)體介導(dǎo)的特異性細(xì)胞毒作用分離法返回在補(bǔ)體的作用下裂解與抗體結(jié)合的細(xì)胞，從而分離出不能與此抗體結(jié)合的細(xì)胞亞群。這是一種負(fù)選性分離法，簡(jiǎn)稱細(xì)胞毒法。現(xiàn)在是21頁\一共有88頁\編輯于星期五（5）免疫磁珠分離法PBMC+生物素標(biāo)記抗體+親和素標(biāo)記磁珠現(xiàn)在是22頁\一共有88頁\編輯于星期五CD56MicroBeads:positiveselectionNKCellIsolationKit:negativeselection分離前分離后現(xiàn)在是23頁\一共有88頁\編輯于星期五BrdUPBMCNK-depletedPBMC17.6%41%現(xiàn)在是24頁\一共有88頁\編輯于星期五返回現(xiàn)在是25頁\一共有88頁\編輯于星期五返回（6）流式細(xì)胞儀分離法現(xiàn)在是26頁\一共有88頁\編輯于星期五四、其他細(xì)胞的分離和收集（一）巨噬細(xì)胞的分離和收集（二）NK細(xì)胞細(xì)胞的分離返回現(xiàn)在是27頁\一共有88頁\編輯于星期五（一）吞噬細(xì)胞的分離和收集人：組織液（斑蝥敷貼法）濾紙蘸取10%中藥斑蝥酒精浸出液臂內(nèi)側(cè)皮膚48小時(shí)后局部形成水皰吸取皰中的組織液,內(nèi)含巨噬細(xì)胞現(xiàn)在是28頁\一共有88頁\編輯于星期五返回小動(dòng)物：腹腔巨噬細(xì)胞小鼠腹腔內(nèi)注入石蠟油３~４天后吸出腹腔浸出液70~80%為巨噬細(xì)胞現(xiàn)在是29頁\一共有88頁\編輯于星期五（二）NK細(xì)胞的分離單核細(xì)胞:粘附法B細(xì)胞:尼侖棉纖維T細(xì)胞:E-玫瑰花環(huán)沉降法返回PBMCNK現(xiàn)在是30頁\一共有88頁\編輯于星期五第二節(jié)體液免疫功能的檢測(cè)一、免疫球蛋白的定量檢測(cè)二、B細(xì)胞數(shù)目及功能的檢測(cè)返回現(xiàn)在是31頁\一共有88頁\編輯于星期五一、免疫球蛋白的定量檢測(cè)返回（1）單相免疫擴(kuò)散試驗(yàn)（2）雙相免疫擴(kuò)散試驗(yàn)（3）火箭電泳（4）中和反應(yīng)（5）ELISA現(xiàn)在是32頁\一共有88頁\編輯于星期五單相免疫擴(kuò)散試驗(yàn)返回FLASH現(xiàn)在是33頁\一共有88頁\編輯于星期五雙相免疫擴(kuò)散試驗(yàn)現(xiàn)在是34頁\一共有88頁\編輯于星期五雙相免疫擴(kuò)散試驗(yàn)返回FLASH現(xiàn)在是35頁\一共有88頁\編輯于星期五（3）火箭電泳現(xiàn)在是36頁\一共有88頁\編輯于星期五返回現(xiàn)在是37頁\一共有88頁\編輯于星期五血清抗體病毒接種細(xì)胞或雞胚計(jì)算半數(shù)保護(hù)率（PD50）（4）中和反應(yīng)返回現(xiàn)在是38頁\一共有88頁\編輯于星期五返回現(xiàn)在是39頁\一共有88頁\編輯于星期五二、B細(xì)胞數(shù)目及功能的檢測(cè)1.外周血B細(xì)胞數(shù)目的檢測(cè)2.外周血B細(xì)胞功能的檢測(cè)返回現(xiàn)在是40頁\一共有88頁\編輯于星期五1.外周血B細(xì)胞數(shù)目的檢測(cè)◆免疫熒光技術(shù)◆花環(huán)試驗(yàn)返回現(xiàn)在是41頁\一共有88頁\編輯于星期五熒光顯微鏡現(xiàn)在是42頁\一共有88頁\編輯于星期五返回CD19CD3流式細(xì)胞儀現(xiàn)在是43頁\一共有88頁\編輯于星期五

B細(xì)胞EA、EAC玫瑰花環(huán)形成示意圖

返回現(xiàn)在是44頁\一共有88頁\編輯于星期五2.外周血B細(xì)胞功能的檢測(cè)◆B細(xì)胞非特異性增殖◆抗體產(chǎn)生能力返回現(xiàn)在是45頁\一共有88頁\編輯于星期五返回B細(xì)胞+刺激物（PWM，LPS）現(xiàn)在是46頁\一共有88頁\編輯于星期五溶血空斑試驗(yàn)現(xiàn)在是47頁\一共有88頁\編輯于星期五酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)返回現(xiàn)在是48頁\一共有88頁\編輯于星期五第三節(jié)細(xì)胞免疫功能的檢測(cè)一、T細(xì)胞亞群和數(shù)目的檢測(cè)二、T細(xì)胞功能的檢測(cè)三、其他免疫細(xì)胞功能的檢測(cè)返回現(xiàn)在是49頁\一共有88頁\編輯于星期五一、T細(xì)胞亞群和數(shù)目的檢測(cè)2.免疫熒光技術(shù)1.花環(huán)試驗(yàn)3.免疫酶細(xì)胞技術(shù)返回現(xiàn)在是50頁\一共有88頁\編輯于星期五返回玫瑰花環(huán)試驗(yàn)正常范圍:60-80%E-花環(huán)形成率=形成花環(huán)的淋巴細(xì)胞數(shù)淋巴細(xì)胞總數(shù)(形成和未形成花環(huán)的細(xì)胞總數(shù))現(xiàn)在是51頁\一共有88頁\編輯于星期五熒光顯微鏡現(xiàn)在是52頁\一共有88頁\編輯于星期五返回流式細(xì)胞儀現(xiàn)在是53頁\一共有88頁\編輯于星期五二、T細(xì)胞功能的檢測(cè)（一）體外功能實(shí)驗(yàn)（二）體內(nèi)功能實(shí)驗(yàn)返回現(xiàn)在是54頁\一共有88頁\編輯于星期五（一）體外功能實(shí)驗(yàn)1.淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)2.細(xì)胞毒試驗(yàn)返回

51Cr釋放法

乳酸脫氫酶釋放法

細(xì)胞凋亡檢測(cè)法現(xiàn)在是55頁\一共有88頁\編輯于星期五1.淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)非特異性刺激物（PHA、ConA）特異性刺激物（抗原）3H-TdR摻入法MTT法形態(tài)學(xué)計(jì)數(shù)法現(xiàn)在是56頁\一共有88頁\編輯于星期五形態(tài)學(xué)計(jì)數(shù)法轉(zhuǎn)化細(xì)胞：體積大，染色質(zhì)疏松呈細(xì)網(wǎng)狀，核/細(xì)胞比例變小未轉(zhuǎn)化細(xì)胞：體積小，核染色體致密，核/細(xì)胞比例大現(xiàn)在是57頁\一共有88頁\編輯于星期五轉(zhuǎn)化率=轉(zhuǎn)化細(xì)胞數(shù)/淋巴細(xì)胞總數(shù)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：60-80%為正常，50-59%為偏低，<50%為降低現(xiàn)在是58頁\一共有88頁\編輯于星期五淋巴細(xì)胞+刺激物培養(yǎng)56h加入3H-TdR24h后收集細(xì)胞于玻璃纖維濾膜液閃儀測(cè)定放射性(cpm)刺激指數(shù)(SI)=刺激孔cpm/對(duì)照孔cpm3H-TdR摻入法正常值SI>2現(xiàn)在是59頁\一共有88頁\編輯于星期五現(xiàn)在是60頁\一共有88頁\編輯于星期五MTT法[3-4,4-二甲基噻唑－2]，5－二苯基四氮唑溴鹽，簡(jiǎn)稱MTT；線粒體的琥珀酸脫氫酶將MTT還原為難溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶物，經(jīng)鹽酸—異丙醇溶解后為藍(lán)色溶液；比色測(cè)定間接反映活細(xì)胞數(shù)量。返回刺激指數(shù)(SI)=刺激孔OD值/對(duì)照孔OD值現(xiàn)在是61頁\一共有88頁\編輯于星期五51Cr釋放法殺傷率（%）=實(shí)驗(yàn)孔cpm-自發(fā)釋放孔cpm最大釋放孔cpm-自發(fā)釋放孔cpm×100現(xiàn)在是62頁\一共有88頁\編輯于星期五返回現(xiàn)在是63頁\一共有88頁\編輯于星期五返回乳酸脫氫酶（LDH）釋放法CTL+靶細(xì)胞釋放LDH碘硝基氯化四氮唑（INT）紅色甲臜（farmazan）比活性測(cè)定（OD值）殺傷率（%）=實(shí)驗(yàn)孔OD值-自發(fā)釋放孔OD值最大釋放孔OD值-自發(fā)釋放孔OD值×100現(xiàn)在是64頁\一共有88頁\編輯于星期五靶細(xì)胞細(xì)胞凋亡檢測(cè)殺傷率%=（靶細(xì)胞對(duì)照孔細(xì)胞數(shù)-共培養(yǎng)孔靶細(xì)胞數(shù)）/靶細(xì)胞對(duì)照孔細(xì)胞數(shù)×100%效應(yīng)細(xì)胞+靶細(xì)胞細(xì)胞凋亡檢測(cè)法返回現(xiàn)在是65頁\一共有88頁\編輯于星期五三、其他免疫細(xì)胞功能的檢測(cè)1.巨噬細(xì)胞功能的檢測(cè)3.NK細(xì)胞和LAK細(xì)胞功能的檢測(cè)返回2.嗜中性粒細(xì)胞功能的檢測(cè)現(xiàn)在是66頁\一共有88頁\編輯于星期五1.巨噬細(xì)胞功能的檢測(cè)炭粒廓清試驗(yàn)吞噬功能的檢測(cè)巨噬細(xì)胞表面受體的檢測(cè)現(xiàn)在是67頁\一共有88頁\編輯于星期五炭粒廓清試驗(yàn)小鼠靜脈注射炭粒懸液測(cè)定血中炭粒的濃度血液中炭粒被廓清的速度現(xiàn)在是68頁\一共有88頁\編輯于星期五巨噬細(xì)胞功能的檢測(cè)吞噬率=吞噬指數(shù)=吞噬紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)計(jì)數(shù)的巨噬細(xì)胞數(shù)×100%吞噬紅細(xì)胞的總數(shù)

計(jì)數(shù)的巨噬細(xì)胞數(shù)37℃保溫0.5～1h現(xiàn)在是69頁\一共有88頁\編輯于星期五返回

巨噬細(xì)胞EA、EAC玫瑰花環(huán)形成示意圖

MΦMΦ現(xiàn)在是70頁\一共有88頁\編輯于星期五現(xiàn)在是71頁\一共有88頁\編輯于星期五

炎癥反應(yīng)的過程紅、腫、熱、痛現(xiàn)在是72頁\一共有88頁\編輯于星期五嗜中性粒細(xì)胞趨化功能檢測(cè)返回現(xiàn)在是73頁\一共有88頁\編輯于星期五現(xiàn)在是74頁\一共有88頁\編輯于星期五外周血淋巴細(xì)胞在體外經(jīng)過IL-2培養(yǎng)后，誘導(dǎo)產(chǎn)生的一類新型殺傷細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞不需抗原致敏不受MHC限制性，無特異性LAK（lymphokineactivatedkillercells）現(xiàn)在是75頁\一共有88頁\編輯于星期五NK細(xì)胞和LAK細(xì)胞功能的檢測(cè)NK細(xì)胞的靶細(xì)胞：K562LAK細(xì)胞的靶細(xì)胞：LiBr返回現(xiàn)在是76頁\一共有88頁