第十二章機體免疫功能的檢測技術詳解演示文稿

第十二章機體免疫功能的檢測技術詳解演示文稿現(xiàn)在是1頁\一共有88頁\編輯于星期五優(yōu)選第十二章機體免疫功能的檢測技術現(xiàn)在是2頁\一共有88頁\編輯于星期五第一節(jié)免疫細胞的分離與純化一、白細胞的分離二、外周血單個核細胞的分離三、淋巴細胞及其亞群的分離四、其他細胞的分離和收集

返回現(xiàn)在是3頁\一共有88頁\編輯于星期五1．自然沉降分離法2．聚合物加速沉淀法返回一、白細胞的分離血液中紅細胞與白細胞比例約600~1000:1現(xiàn)在是4頁\一共有88頁\編輯于星期五上層：淡黃色血漿灰白層：白細胞底層：紅細胞返回1．自然沉降分離法室溫靜置30-60min現(xiàn)在是5頁\一共有88頁\編輯于星期五2．聚合物加速沉淀法返回某些高分子聚合物（如明膠、右旋糖酐、甲基纖維素和聚乙烯吡咯烷酮等）可使紅細胞凝聚成串，加速紅細胞沉降，使之更易與白細胞分離?，F(xiàn)在是6頁\一共有88頁\編輯于星期五1.Ficoll分層液法2.Percoll分層液法二、外周血單個核細胞的分離返回人外周血細胞的密度為：紅細胞1.093，粒細胞1.092，單個核細胞1.075～1.090，血小板1.030～1.035?，F(xiàn)在是7頁\一共有88頁\編輯于星期五1.Ficoll分層液法◆Ficoll分層液法即聚蔗糖－泛影葡胺密度梯度離心分離法（ficoll-hypaquedensitygradientcentrifugation)◆聚蔗糖密度：1.020泛影葡胺密度：1.200◆外周血單個核細胞（PBMC）密度：人：1.077小鼠：1.088馬：1.090現(xiàn)在是8頁\一共有88頁\編輯于星期五用Ficoll分離外周血單個核細胞返回95%2000rpm20min現(xiàn)在是9頁\一共有88頁\編輯于星期五2.Percoll分層液法◆Percoll是聚乙烯吡咯烷酮包被的硅膠混懸液的商品名，為一種無細胞毒無刺激的新型密度梯度分層液?！鬚ercoll原液（密度1.135）+8.5%NaCl或1.5MPBS(9:1)Percoll濃度（%）706050403020比重（g/ml)1.0901.0771.0671.0561.0431.031現(xiàn)在是10頁\一共有88頁\編輯于星期五用Percoll分離外周血單個核細胞返回75%98%血小板現(xiàn)在是11頁\一共有88頁\編輯于星期五三、淋巴細胞及其亞群的分離1.紅細胞的去除2.血小板的去除3.單核細胞的去除4.淋巴細胞亞群的分離返回現(xiàn)在是12頁\一共有88頁\編輯于星期五1.紅細胞的去除（1）低滲裂解法：蒸餾水（2）氯化銨處理法：0.83%氯化銨返回PBMC+1mlH2O輕輕振搖不超過1min加入等量1.8%生理鹽水去除紅細胞碎片現(xiàn)在是13頁\一共有88頁\編輯于星期五3.單核細胞的去除（1）粘附貼壁法：在玻璃或塑料平皿中于37℃溫箱靜置1h現(xiàn)在是14頁\一共有88頁\編輯于星期五玻璃纖維或葡聚糖凝膠吸附單核細胞，收集未吸附的淋巴細胞（2）吸附柱過濾法：單核細胞37℃1-2h淋巴細胞現(xiàn)在是15頁\一共有88頁\編輯于星期五（3）磁鐵吸引法：加入直徑為3um的羰基鐵顆粒，待單核細胞充分吞噬顆粒后，再用磁鐵將單核細胞吸至管底，上層液中則含有較純的淋巴細胞。返回現(xiàn)在是16頁\一共有88頁\編輯于星期五4.淋巴細胞亞群的分離（1）E-玫瑰花環(huán)沉降法（2）尼龍棉纖維分離法（3）親和分離法（4）抗體/補體介導的特異性細胞毒作用分離法（5）免疫磁珠分離法（6）流式細胞儀分離法返回現(xiàn)在是17頁\一共有88頁\編輯于星期五（1）E-玫瑰花環(huán)沉降法返回現(xiàn)在是18頁\一共有88頁\編輯于星期五（2）尼龍棉纖維分離法T細胞：不吸附B細胞：吸附T細胞(90%)B細胞(80%)37℃1-2h返回10-20%小牛血清培養(yǎng)液現(xiàn)在是19頁\一共有88頁\編輯于星期五（3）親和分離法返回現(xiàn)在是20頁\一共有88頁\編輯于星期五（4）抗體/補體介導的特異性細胞毒作用分離法返回在補體的作用下裂解與抗體結合的細胞，從而分離出不能與此抗體結合的細胞亞群。這是一種負選性分離法，簡稱細胞毒法?，F(xiàn)在是21頁\一共有88頁\編輯于星期五（5）免疫磁珠分離法PBMC+生物素標記抗體+親和素標記磁珠現(xiàn)在是22頁\一共有88頁\編輯于星期五CD56MicroBeads:positiveselectionNKCellIsolationKit:negativeselection分離前分離后現(xiàn)在是23頁\一共有88頁\編輯于星期五BrdUPBMCNK-depletedPBMC17.6%41%現(xiàn)在是24頁\一共有88頁\編輯于星期五返回現(xiàn)在是25頁\一共有88頁\編輯于星期五返回（6）流式細胞儀分離法現(xiàn)在是26頁\一共有88頁\編輯于星期五四、其他細胞的分離和收集（一）巨噬細胞的分離和收集（二）NK細胞細胞的分離返回現(xiàn)在是27頁\一共有88頁\編輯于星期五（一）吞噬細胞的分離和收集人：組織液（斑蝥敷貼法）濾紙蘸取10%中藥斑蝥酒精浸出液臂內(nèi)側皮膚48小時后局部形成水皰吸取皰中的組織液,內(nèi)含巨噬細胞現(xiàn)在是28頁\一共有88頁\編輯于星期五返回小動物：腹腔巨噬細胞小鼠腹腔內(nèi)注入石蠟油３~４天后吸出腹腔浸出液70~80%為巨噬細胞現(xiàn)在是29頁\一共有88頁\編輯于星期五（二）NK細胞的分離單核細胞:粘附法B細胞:尼侖棉纖維T細胞:E-玫瑰花環(huán)沉降法返回PBMCNK現(xiàn)在是30頁\一共有88頁\編輯于星期五第二節(jié)體液免疫功能的檢測一、免疫球蛋白的定量檢測二、B細胞數(shù)目及功能的檢測返回現(xiàn)在是31頁\一共有88頁\編輯于星期五一、免疫球蛋白的定量檢測返回（1）單相免疫擴散試驗（2）雙相免疫擴散試驗（3）火箭電泳（4）中和反應（5）ELISA現(xiàn)在是32頁\一共有88頁\編輯于星期五單相免疫擴散試驗返回FLASH現(xiàn)在是33頁\一共有88頁\編輯于星期五雙相免疫擴散試驗現(xiàn)在是34頁\一共有88頁\編輯于星期五雙相免疫擴散試驗返回FLASH現(xiàn)在是35頁\一共有88頁\編輯于星期五（3）火箭電泳現(xiàn)在是36頁\一共有88頁\編輯于星期五返回現(xiàn)在是37頁\一共有88頁\編輯于星期五血清抗體病毒接種細胞或雞胚計算半數(shù)保護率（PD50）（4）中和反應返回現(xiàn)在是38頁\一共有88頁\編輯于星期五返回現(xiàn)在是39頁\一共有88頁\編輯于星期五二、B細胞數(shù)目及功能的檢測1.外周血B細胞數(shù)目的檢測2.外周血B細胞功能的檢測返回現(xiàn)在是40頁\一共有88頁\編輯于星期五1.外周血B細胞數(shù)目的檢測◆免疫熒光技術◆花環(huán)試驗返回現(xiàn)在是41頁\一共有88頁\編輯于星期五熒光顯微鏡現(xiàn)在是42頁\一共有88頁\編輯于星期五返回CD19CD3流式細胞儀現(xiàn)在是43頁\一共有88頁\編輯于星期五

B細胞EA、EAC玫瑰花環(huán)形成示意圖

返回現(xiàn)在是44頁\一共有88頁\編輯于星期五2.外周血B細胞功能的檢測◆B細胞非特異性增殖◆抗體產(chǎn)生能力返回現(xiàn)在是45頁\一共有88頁\編輯于星期五返回B細胞+刺激物（PWM，LPS）現(xiàn)在是46頁\一共有88頁\編輯于星期五溶血空斑試驗現(xiàn)在是47頁\一共有88頁\編輯于星期五酶聯(lián)免疫斑點試驗返回現(xiàn)在是48頁\一共有88頁\編輯于星期五第三節(jié)細胞免疫功能的檢測一、T細胞亞群和數(shù)目的檢測二、T細胞功能的檢測三、其他免疫細胞功能的檢測返回現(xiàn)在是49頁\一共有88頁\編輯于星期五一、T細胞亞群和數(shù)目的檢測2.免疫熒光技術1.花環(huán)試驗3.免疫酶細胞技術返回現(xiàn)在是50頁\一共有88頁\編輯于星期五返回玫瑰花環(huán)試驗正常范圍:60-80%E-花環(huán)形成率=形成花環(huán)的淋巴細胞數(shù)淋巴細胞總數(shù)(形成和未形成花環(huán)的細胞總數(shù))現(xiàn)在是51頁\一共有88頁\編輯于星期五熒光顯微鏡現(xiàn)在是52頁\一共有88頁\編輯于星期五返回流式細胞儀現(xiàn)在是53頁\一共有88頁\編輯于星期五二、T細胞功能的檢測（一）體外功能實驗（二）體內(nèi)功能實驗返回現(xiàn)在是54頁\一共有88頁\編輯于星期五（一）體外功能實驗1.淋巴細胞增殖試驗2.細胞毒試驗返回

51Cr釋放法

乳酸脫氫酶釋放法

細胞凋亡檢測法現(xiàn)在是55頁\一共有88頁\編輯于星期五1.淋巴細胞增殖試驗非特異性刺激物（PHA、ConA）特異性刺激物（抗原）3H-TdR摻入法MTT法形態(tài)學計數(shù)法現(xiàn)在是56頁\一共有88頁\編輯于星期五形態(tài)學計數(shù)法轉化細胞：體積大，染色質疏松呈細網(wǎng)狀，核/細胞比例變小未轉化細胞：體積小，核染色體致密，核/細胞比例大現(xiàn)在是57頁\一共有88頁\編輯于星期五轉化率=轉化細胞數(shù)/淋巴細胞總數(shù)評價標準：60-80%為正常，50-59%為偏低，<50%為降低現(xiàn)在是58頁\一共有88頁\編輯于星期五淋巴細胞+刺激物培養(yǎng)56h加入3H-TdR24h后收集細胞于玻璃纖維濾膜液閃儀測定放射性(cpm)刺激指數(shù)(SI)=刺激孔cpm/對照孔cpm3H-TdR摻入法正常值SI>2現(xiàn)在是59頁\一共有88頁\編輯于星期五現(xiàn)在是60頁\一共有88頁\編輯于星期五MTT法[3-4,4-二甲基噻唑－2]，5－二苯基四氮唑溴鹽，簡稱MTT；線粒體的琥珀酸脫氫酶將MTT還原為難溶性的藍紫色結晶物，經(jīng)鹽酸—異丙醇溶解后為藍色溶液；比色測定間接反映活細胞數(shù)量。返回刺激指數(shù)(SI)=刺激孔OD值/對照孔OD值現(xiàn)在是61頁\一共有88頁\編輯于星期五51Cr釋放法殺傷率（%）=實驗孔cpm-自發(fā)釋放孔cpm最大釋放孔cpm-自發(fā)釋放孔cpm×100現(xiàn)在是62頁\一共有88頁\編輯于星期五返回現(xiàn)在是63頁\一共有88頁\編輯于星期五返回乳酸脫氫酶（LDH）釋放法CTL+靶細胞釋放LDH碘硝基氯化四氮唑（INT）紅色甲臜（farmazan）比活性測定（OD值）殺傷率（%）=實驗孔OD值-自發(fā)釋放孔OD值最大釋放孔OD值-自發(fā)釋放孔OD值×100現(xiàn)在是64頁\一共有88頁\編輯于星期五靶細胞細胞凋亡檢測殺傷率%=（靶細胞對照孔細胞數(shù)-共培養(yǎng)孔靶細胞數(shù)）/靶細胞對照孔細胞數(shù)×100%效應細胞+靶細胞細胞凋亡檢測法返回現(xiàn)在是65頁\一共有88頁\編輯于星期五三、其他免疫細胞功能的檢測1.巨噬細胞功能的檢測3.NK細胞和LAK細胞功能的檢測返回2.嗜中性粒細胞功能的檢測現(xiàn)在是66頁\一共有88頁\編輯于星期五1.巨噬細胞功能的檢測炭粒廓清試驗吞噬功能的檢測巨噬細胞表面受體的檢測現(xiàn)在是67頁\一共有88頁\編輯于星期五炭粒廓清試驗小鼠靜脈注射炭粒懸液測定血中炭粒的濃度血液中炭粒被廓清的速度現(xiàn)在是68頁\一共有88頁\編輯于星期五巨噬細胞功能的檢測吞噬率=吞噬指數(shù)=吞噬紅細胞的巨噬細胞數(shù)計數(shù)的巨噬細胞數(shù)×100%吞噬紅細胞的總數(shù)

計數(shù)的巨噬細胞數(shù)37℃保溫0.5～1h現(xiàn)在是69頁\一共有88頁\編輯于星期五返回

巨噬細胞EA、EAC玫瑰花環(huán)形成示意圖

MΦMΦ現(xiàn)在是70頁\一共有88頁\編輯于星期五現(xiàn)在是71頁\一共有88頁\編輯于星期五

炎癥反應的過程紅、腫、熱、痛現(xiàn)在是72頁\一共有88頁\編輯于星期五嗜中性粒細胞趨化功能檢測返回現(xiàn)在是73頁\一共有88頁\編輯于星期五現(xiàn)在是74頁\一共有88頁\編輯于星期五外周血淋巴細胞在體外經(jīng)過IL-2培養(yǎng)后，誘導產(chǎn)生的一類新型殺傷細胞殺傷腫瘤細胞不需抗原致敏不受MHC限制性，無特異性LAK（lymphokineactivatedkillercells）現(xiàn)在是75頁\一共有88頁\編輯于星期五NK細胞和LAK細胞功能的檢測NK細胞的靶細胞：K562LAK細胞的靶細胞：LiBr返回現(xiàn)在是76頁\一共有88頁