保健品檢測(cè)衛(wèi)生檢驗(yàn)優(yōu)秀課件

保健品檢測(cè)衛(wèi)生檢驗(yàn)第1頁，共82頁，2023年，2月20日，星期三第二十章健康相關(guān)產(chǎn)品的免疫學(xué)檢驗(yàn)第2頁，共82頁，2023年，2月20日，星期三前言

健康相關(guān)產(chǎn)品：

是指保健食品、化妝品、涉及飲用水衛(wèi)生安全產(chǎn)品、消毒產(chǎn)品等與人體健康密切相關(guān)的產(chǎn)品。第3頁，共82頁，2023年，2月20日，星期三第一節(jié)有毒有害物質(zhì)的免疫學(xué)檢驗(yàn)一、免疫學(xué)技術(shù)在環(huán)境中有毒有害物質(zhì)檢測(cè)中的應(yīng)用檢測(cè)奶、肉、蛋、肝、蔬菜水果等食品中殘留的農(nóng)藥（殺蟲劑、除草劑）、殘留的抗生素。檢測(cè)水和土壤中殘留的農(nóng)藥。水中藻毒素。谷物及其制品中的霉菌毒素。保健功能食品中的激素、毒品、興奮劑等。

國外已有多種檢測(cè)試劑盒應(yīng)用，抗體多為單克隆抗體，而且把免疫學(xué)技術(shù)與自動(dòng)化分析儀器相結(jié)合，如免疫親和柱、高效液相色譜法、免疫親和柱－熒光分光光度法。第4頁，共82頁，2023年，2月20日，星期三二、有毒有害物質(zhì)免疫學(xué)檢測(cè)方法（一）RIA法（放射免疫分析）應(yīng)用：環(huán)境樣品中的殺蟲劑、除草劑、激素的測(cè)定。缺點(diǎn)：放射元素的污染，特殊的分析儀器。第5頁，共82頁，2023年，2月20日，星期三二、有毒有害物質(zhì)免疫學(xué)檢測(cè)方法（二）ELISA法應(yīng)用最多的技術(shù)類型，是競(jìng)爭(zhēng)抑制法。ELISA主要用于食品中殘留農(nóng)藥、抗生素、激素的檢測(cè)。谷物中真菌毒素的檢測(cè)和水中藻毒素的檢測(cè)。第6頁，共82頁，2023年，2月20日，星期三二、有毒有害物質(zhì)免疫學(xué)檢測(cè)方法（三）酶增強(qiáng)免疫測(cè)定技術(shù)（enzyme-multipliedimmunoassaytechnique，EMIT）用途：用于半抗原或小分子抗原的檢測(cè)。原理：將這類抗原接合在酶分子活性點(diǎn)附近，如與相應(yīng)抗體結(jié)合則封閉了該活性點(diǎn)位，使酶失活，測(cè)定時(shí)將待測(cè)樣品、酶標(biāo)抗原（半抗原）、特異性抗體一起混合，加酶底物，測(cè)定反應(yīng)體系中酶的活性。由于樣品中待測(cè)抗原與酶標(biāo)記抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合反應(yīng)體系中限量的抗體，從而使游離酶標(biāo)抗原量增多，最終測(cè)得的酶活性隨著反應(yīng)體系中未標(biāo)記待測(cè)抗原的濃度升高而增強(qiáng)。第7頁，共82頁，2023年，2月20日，星期三二、有毒有害物質(zhì)免疫學(xué)檢測(cè)方法（四）斑點(diǎn)金免疫層析試驗(yàn)（dotimmunogoldchromatographicassay,DICA）是膠體金標(biāo)記技術(shù)和蛋白質(zhì)層析技術(shù)相結(jié)合的以微孔濾膜為載體的快速定性或半定量篩查試驗(yàn)。應(yīng)用：毒品、霉菌毒素的檢測(cè)等。

第8頁，共82頁，2023年，2月20日，星期三二、有毒有害物質(zhì)免疫學(xué)檢測(cè)方法

（五）免疫磁珠用于定量、半定量檢測(cè)環(huán)境中殘留的農(nóng)藥。第9頁，共82頁，2023年，2月20日，星期三三、有毒有害物質(zhì)免疫學(xué)檢測(cè)的應(yīng)用(一)殘留農(nóng)藥的檢測(cè)1.ELISA法應(yīng)用：檢測(cè)食品、土壤、水中殘留的有機(jī)氯、有機(jī)磷、甲苯胺、滴滅威、多菌靈、百草枯、擬除蟲菊酯，三嗪類等殺蟲劑、除草劑等。優(yōu)點(diǎn)：比用氣相色譜或高效液相色譜方法所用的試劑費(fèi)要低20倍，對(duì)樣品的處理方法也比較簡單，且兩者的最低檢出限及回收率均吻合。

第10頁，共82頁，2023年，2月20日，星期三三、有毒有害物質(zhì)免疫學(xué)檢測(cè)的應(yīng)用(一)殘留農(nóng)藥的檢測(cè)

2.金免疫層析法已有對(duì)有機(jī)磷（甲基對(duì)硫磷、乙基對(duì)硫磷）、殺螟硫磷、毒死蜱、呋喃丹等農(nóng)藥檢測(cè)的商品膠體金試劑盒。第11頁，共82頁，2023年，2月20日，星期三(二)真菌毒素的檢測(cè)1．黃曲霉毒素的檢測(cè)（1）ELISA法主要適用于大批量樣品的定性、定量分析，與常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)方法符合率較高。缺點(diǎn)是只能檢測(cè)一種毒素。（2）金標(biāo)記試紙法非常適于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和大量樣品初篩。

第12頁，共82頁，2023年，2月20日，星期三(二)真菌毒素的檢測(cè)1．黃曲霉毒素的檢測(cè)（3）免疫親和柱的應(yīng)用黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1單克隆抗體免疫親和柱均已商品化，用于各種食品、飼料和體液樣品純化、濃縮，為進(jìn)一步的儀器定量檢測(cè)奠定了基礎(chǔ)。

第13頁，共82頁，2023年，2月20日，星期三(二)真菌毒素的檢測(cè)2．玉米赤霉烯酮（ZEN）小麥中玉米赤霉烯酮ELISA檢測(cè)已納入國家標(biāo)準(zhǔn)方法（GT/T14933-94）。有高靈敏度的ELISA試劑盒商品提供。商品玉米赤霉烯酮免疫親和柱，與熒光計(jì)相連接可檢測(cè)飼料中的玉米赤霉烯酮檢測(cè)范圍為10－200ng/g。檢出限為4ng/g，總回收率為94％，檢測(cè)結(jié)果與HPLC法吻合。第14頁，共82頁，2023年，2月20日，星期三(二)真菌毒素的檢測(cè)3．脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）我國已把小麥、面粉、玉米粉中DON的ELISA檢測(cè)和TCL納入限量標(biāo)準(zhǔn)制定的檢測(cè)方法?，F(xiàn)有高靈敏度的ELISA檢測(cè)DON試劑盒商品。DONtest免疫親和柱已有商品供應(yīng)，可與色譜法結(jié)合應(yīng)用。第15頁，共82頁，2023年，2月20日，星期三（三）人工合成有毒污染物的檢測(cè)1．二噁英的檢測(cè)雙抗體放射免疫分析ELISA法定量檢測(cè)2．多氯聯(lián)苯的檢測(cè)

ELISA試劑盒用PCB3多克隆抗體包被磁珠，用于定性、半定量、定量檢測(cè)土壤、水、沉淀物、魚漿中的PCB3，檢測(cè)范圍為0.25～25.0ppb。第16頁，共82頁，2023年，2月20日，星期三第二節(jié)化妝品的免疫學(xué)檢驗(yàn)第17頁，共82頁，2023年，2月20日，星期三第18頁，共82頁，2023年，2月20日，星期三第19頁，共82頁，2023年，2月20日，星期三第三節(jié)保健食品免疫學(xué)檢驗(yàn)和評(píng)價(jià)第20頁，共82頁，2023年，2月20日，星期三前言

為了規(guī)定評(píng)價(jià)保健食品功能的統(tǒng)一程序和試驗(yàn)規(guī)程，衛(wèi)生部于2003年2月頒發(fā)了保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范，在確定的檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)對(duì)其功能學(xué)評(píng)價(jià)方法和試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證后，方能向SFDA（StateFoodandDrugAdministration）申報(bào)，批準(zhǔn)后才可進(jìn)入市場(chǎng)。第21頁，共82頁，2023年，2月20日，星期三前言

保健食品功能的試驗(yàn)和評(píng)價(jià)的項(xiàng)目從原來的22項(xiàng)增加到27項(xiàng)，主要有增強(qiáng)免疫功能，輔助降血脂功能，輔助降血糖功能，抗氧化功能，輔助改善記憶功能，緩解疲勞功能，促進(jìn)排鉛功能等等，保健食品的免疫學(xué)檢驗(yàn)，主要用于對(duì)其增強(qiáng)免疫力功能的驗(yàn)證與評(píng)價(jià)。第22頁，共82頁，2023年，2月20日，星期三一、增強(qiáng)免疫力功能檢驗(yàn)項(xiàng)目

（MethodfortheAssessmentofEnhancingImmuneFunction）（一）細(xì)胞免疫功能的檢測(cè)（二）體液免疫功能的檢測(cè)（三）單核巨噬細(xì)胞功能的檢測(cè)（四）NK細(xì)胞功能的檢測(cè)ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)抗體生成細(xì)胞檢測(cè)血清溶血素的測(cè)定小鼠碳廓清實(shí)驗(yàn)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn)乳酸脫氫酶（LDH）測(cè)定法第23頁，共82頁，2023年，2月20日，星期三一、增強(qiáng)免疫力功能檢驗(yàn)項(xiàng)目實(shí)驗(yàn)動(dòng)物推薦用近交系小鼠，18-22g，單一性別，每組10-15只。劑量分組及受試樣品給予時(shí)間實(shí)驗(yàn)至少應(yīng)設(shè)三個(gè)劑量組和一個(gè)陰性對(duì)照組，必要時(shí)設(shè)陽性對(duì)照組或空白對(duì)照組。劑量選擇應(yīng)合理，盡可能找出最低有效劑量。以人體推薦量的10倍為其中的一個(gè)劑量組，另設(shè)兩個(gè)劑量組，受試樣品給予時(shí)間30天，必要時(shí)可延長至45天。第24頁，共82頁，2023年，2月20日，星期三對(duì)受試樣品處理的要求受試樣品推薦量較大，超過灌胃量，可以適當(dāng)減少樣品中非功效成分的含量，或濃縮。如：60-70℃減壓濃縮。對(duì)合理設(shè)置對(duì)照組的要求以載體和功效成分組成的受試樣品，當(dāng)載體本身可能具有相同功能時(shí)，應(yīng)將該載體作為對(duì)照。第25頁，共82頁，2023年，2月20日，星期三二、免疫學(xué)檢驗(yàn)方法（一）ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)（MTT法）

1．原理：當(dāng)T淋巴細(xì)胞受ConA刺激后發(fā)生母細(xì)胞轉(zhuǎn)化，活細(xì)胞特別是增殖細(xì)胞通過線粒體水解酶將MTT（一種淡黃色的唑氮鹽）分解為蘭紫色結(jié)晶而顯色，其光密度值能反映細(xì)胞的增殖情況。

ConA刺激48~72小時(shí)第26頁，共82頁，2023年，2月20日，星期三（一）ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)（MTT法）

2.儀器和材料RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液、小牛血清、2-巰基乙醇（2-ME）、青霉素、鏈霉素、刀豆蛋白A(ConA)、鹽酸、異丙醇、MTT、Hank's液、PBS緩沖液（pH7.2-7.4)紗布或200目篩網(wǎng)、24孔培養(yǎng)板，96孔培養(yǎng)板(平底),手術(shù)器械、二氧化碳培養(yǎng)箱、酶標(biāo)儀、721分光光度計(jì)、超凈工作臺(tái)、高壓滅菌器、無菌濾器。第27頁，共82頁，2023年，2月20日，星期三（一）ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)（MTT法）3.試劑配制完全培養(yǎng)液：RPMI1640培養(yǎng)液過濾菌，用前加入10%小牛血清，1%谷氨酰胺（20mmol/L)，青霉素（100U/mL),鏈霉素（100g/L)及5×10mol/L的2-巰基乙醇，用無菌的1mol/L的HC1或1mol/L的NaOH調(diào)pH至7.0-7.2,即完全培養(yǎng)液。ConA液：用雙蒸水配制成100g/mL的溶液，過濾除菌，在低溫冰箱(-20)保存。無菌Hank‘s液：用前以3.5%的無菌NaHCO3調(diào)pH7.2-7.4。MTT液：將5mgMTT溶于1mLpH7.2的PBS中，現(xiàn)配現(xiàn)用。酸性異丙醇溶液：96mL異丙醇中加入4mL1mol/L的HC1，臨用前配制。第28頁，共82頁，2023年，2月20日，星期三4.技術(shù)要點(diǎn)：

（1）脾細(xì)胞懸液制備無菌取脾，置于盛有適量無菌Hank’s液平皿中。用4層紗布將脾磨碎，制成單個(gè)細(xì)胞懸液。用Hank’s液洗2次，每次離心10min（1000r/min）。然后將細(xì)胞懸浮于1ml的完全培養(yǎng)液中。用臺(tái)盼蘭染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)（應(yīng)在95%以上），調(diào)整細(xì)胞濃度為3×106個(gè)/ml。（一）ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)（MTT法）第29頁，共82頁，2023年，2月20日，星期三（一）ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)（MTT法）（2）淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)將脾細(xì)胞懸液分兩孔加入24孔培養(yǎng)板中，每孔1ml。一孔加75μlConA液（相當(dāng)于7.5μg/ml），另一孔作為對(duì)照，置5％CO2，37℃CO2孵箱中培養(yǎng)72h。培養(yǎng)結(jié)束前4h，每孔輕輕吸去上清液0.7ml，加入0.7ml不含小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，同時(shí)加入MTT（5mg/ml）50μl/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4h。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入1ml酸性異丙醇，吹打混勻，使紫色結(jié)晶完全溶解。然后分裝到96孔培養(yǎng)板中，每個(gè)孔分裝3～6孔作為平行樣，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀，以570nm波長測(cè)定光密度值。第30頁，共82頁，2023年，2月20日，星期三（一）ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)（MTT法）（3）實(shí)驗(yàn)中ConA的濃度的確定選擇有絲分裂原時(shí)ConA的濃度很重要，ConA的濃度過高會(huì)產(chǎn)生抑制作用，不同批號(hào)的ConA在實(shí)驗(yàn)前要預(yù)試，以找到最佳刺激分裂濃度。第31頁，共82頁，2023年，2月20日，星期三（一）ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)（MTT法）5．結(jié)果判定：淋巴細(xì)胞的增殖能力=加ConA孔的光密度值–不加ConA孔的光密度值

受試樣品組的光密度差值顯著高于對(duì)照組的光密度差值，可判定該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽性。第32頁，共82頁，2023年，2月20日，星期三（一）ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)（MTT法）6.數(shù)據(jù)處理

一般用方差分析，先檢驗(yàn)方差齊性，方差齊，計(jì)算F值，F(xiàn)值<F0.05，結(jié)論：各組均數(shù)間差異無顯著性；F值≥F0.05，P≤0.05，用多個(gè)實(shí)驗(yàn)組和一個(gè)對(duì)照組間均數(shù)的兩兩比較方法統(tǒng)計(jì)；對(duì)非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換；若變量轉(zhuǎn)換仍達(dá)不到要求，改用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。第33頁，共82頁，2023年，2月20日，星期三（二）二硝基氟苯誘導(dǎo)的小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)（耳腫脹法）1．原理二硝基氟苯（DNFB）是一種半抗原，將其稀釋液涂抹小鼠腹壁皮膚后，與皮膚蛋白結(jié)合成完全抗原，由此刺激T淋巴細(xì)胞增殖成致敏淋巴細(xì)胞。4d～7d后再將其涂抹于耳部，使局部產(chǎn)生遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)。一般在抗原攻擊后24h～48h達(dá)高峰，故于此時(shí)測(cè)定其腫脹程度。第34頁，共82頁，2023年，2月20日，星期三（二）二硝基氟苯誘導(dǎo)的小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)（耳腫脹法）2.材料DNFB、丙酮、麻油、硫化鋇、打孔器3.試劑配制DNFB溶液：應(yīng)新鮮配制，稱取DNFB50mg，置清潔干燥小瓶中，將預(yù)先配制好的5ml丙酮麻油溶液（v/v=1:1），倒入小瓶，蓋好瓶塞并用膠布密封。混勻后，用250μl注射器通過瓶蓋取用。第35頁，共82頁，2023年，2月20日，星期三（二）二硝基氟苯誘導(dǎo)的小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)（耳腫脹法）4.技術(shù)要點(diǎn)（1）致敏小鼠腹部皮膚用硫化鋇脫毛，范圍約3cm×3cm，用DNFB溶液50μl均勻涂抹致敏。（2）遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)的產(chǎn)生與測(cè)定5天后，用DNFB溶液10μl均勻涂抹于小鼠右耳（兩面）進(jìn)行攻擊。攻擊后24h頸椎脫臼處死小鼠，剪下左右耳殼。用打孔器取下直徑8mm的耳片，稱重。第36頁，共82頁，2023年，2月20日，星期三（二）二硝基氟苯誘導(dǎo)的小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)（耳腫脹法）5.結(jié)果判定

用左右耳重量之差表示遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的程度。受試樣品組的重量差值顯著高于與對(duì)照組的重量差值，可判定該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽性。6.注意事項(xiàng)操作時(shí)避免DNFB與皮膚接觸。第37頁，共82頁，2023年，2月20日，星期三（三）抗體生成細(xì)胞檢測(cè)（Jerne改良法）1．原理

用綿羊紅細(xì)胞（SRBC）免疫的小鼠脾細(xì)胞懸液與一定量的SRBC混合，在補(bǔ)體參與下，使分泌抗體的脾細(xì)胞周圍的SRBC溶解，形成肉眼可見的空斑。溶血空斑數(shù)大體可反映抗體分泌細(xì)胞數(shù)。第38頁，共82頁，2023年，2月20日，星期三（三）抗體生成細(xì)胞檢測(cè)（Jerne改良法）2.儀器和材料二氧化碳培養(yǎng)箱、恒溫水浴箱、離心機(jī)、手術(shù)器械、玻片架、200目篩網(wǎng)、SRBC、補(bǔ)體（豚鼠血清）、Hank's液、RPMI1640培養(yǎng)液、SA緩沖液、瓊脂糖。第39頁，共82頁，2023年，2月20日，星期三（三）抗體生成細(xì)胞檢測(cè)（Jerne改良法）3.技術(shù)要點(diǎn)（1）SRBC綿羊紅細(xì)胞的制備綿羊頸靜脈取血。將羊血放入有玻璃珠的滅菌錐形瓶中，朝一個(gè)方向搖動(dòng)，以脫纖維。放入4℃冰箱保存?zhèn)溆?，可保?周。第40頁，共82頁，2023年，2月20日，星期三（三）抗體生成細(xì)胞檢測(cè)（Jerne改良法）（2）制備補(bǔ)體采集豚鼠血，分離出血清（至少5只豚鼠的混合血清）。將1ml壓積SRBC加入到5ml豚鼠血清中。4℃冰箱放置30min，經(jīng)常振蕩。離心取上清，分裝，－70℃保存。用時(shí)以SA緩沖液按1∶8～15稀釋。第41頁，共82頁，2023年，2月20日，星期三（三）抗體生成細(xì)胞檢測(cè)（Jerne改良法）（3）玻片涂膜在清潔玻片上刷上一薄層瓊脂（0.5%），干后可長期保存?zhèn)溆?。?2頁，共82頁，2023年，2月20日，星期三（三）抗體生成細(xì)胞檢測(cè)（Jerne改良法）（4）免疫動(dòng)物取脫纖維羊血，用生理鹽水洗滌3次，每次離心（2000r/min）10min，計(jì)數(shù)細(xì)胞。每只鼠經(jīng)腹腔或靜脈注射SRBC5×107～2×108個(gè)。也可將壓積SRBC用生理鹽水配成2%（v/v）的細(xì)胞懸液，每只鼠腹腔注射0.2ml。第43頁，共82頁，2023年，2月20日，星期三（三）抗體生成細(xì)胞檢測(cè)（Jerne改良法）（5）脾細(xì)胞懸液制備將SRBC免疫4～5d后的小鼠頸椎脫臼處死。取出脾臟，放在盛有Hank‘s液的小平皿內(nèi)，用4層紗布將脾磨碎，制成細(xì)胞懸液，離心10min（1000r/min），用Hank’s液洗2遍。最后將細(xì)胞懸浮在5mlRPMI1640培養(yǎng)液中，計(jì)數(shù)細(xì)胞，并將細(xì)胞濃度調(diào)整為5×106個(gè)/ml。第44頁，共82頁，2023年，2月20日，星期三（三）抗體生成細(xì)胞檢測(cè)（Jerne改良法）（6）空斑的測(cè)定將表層培養(yǎng)基（1%瓊脂糖）加熱溶解后，放45℃水浴保溫，與等量pH7.2～7.4、2倍濃度的Hank‘s液混合，分裝小試管，每管0.5ml。再向管內(nèi)加50μl10%SRBC(v/v，用SA液配制)，20μl脾細(xì)胞懸液（5×106個(gè)/ml），迅速混勻，傾倒于已刷瓊脂糖薄層的玻片上，做平行片。待瓊脂凝固后，將玻片水平扣放在片架上，放入二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育1～1.5h。然后用SA緩沖液稀釋的補(bǔ)體（1：8）加入到玻片架凹槽內(nèi)。繼續(xù)孵育1～1.5h后，計(jì)數(shù)溶血空斑數(shù)。第45頁，共82頁，2023年，2月20日，星期三（三）抗體生成細(xì)胞檢測(cè)（Jerne改良法）4.結(jié)果判定用空斑數(shù)/106脾細(xì)胞表示。

受試樣品組的空斑數(shù)顯著高于對(duì)照組的空斑數(shù)，可判定該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽性。第46頁，共82頁，2023年，2月20日，星期三（四）血清溶血素的測(cè)定

半數(shù)溶血值（HC50）的測(cè)定

1.原理用SRBC免疫動(dòng)物后，血清中出現(xiàn)SRBC抗體（溶血素），在補(bǔ)體參與下，與SRBC一起孵育，可發(fā)生溶血反應(yīng)，釋放血紅蛋白，通過測(cè)定血紅蛋白含量反映動(dòng)物血清中溶血素的含量。第47頁，共82頁，2023年，2月20日，星期三（四）血清溶血素的測(cè)定

半數(shù)溶血值（HC50）的測(cè)定

2.儀器和材料分光光度計(jì)、離心機(jī)、恒溫水浴、SRBC、補(bǔ)體（豚鼠血清）、SA緩沖液、都氏試劑（碳酸氫鈉1.0g、高鐵氰化鉀0.2g、氰化鉀0.05g,加蒸餾水至1000mL）第48頁，共82頁，2023年，2月20日，星期三（四）血清溶血素的測(cè)定

半數(shù)溶血值（HC50）的測(cè)定3.技術(shù)要點(diǎn)（1）SRBC制備（2）制備補(bǔ)體

第49頁，共82頁，2023年，2月20日，星期三（四）血清溶血素的測(cè)定

半數(shù)溶血值（HC50）的測(cè)定（3）免疫動(dòng)物及血清分離取羊血，用生理鹽水洗滌3次，每次離心（2000r/min）10min。將壓積SRBC用生理鹽水配成2%（v/v）的細(xì)胞懸液，每只鼠腹腔注射0.2mL進(jìn)行免疫。4-5天后，摘除眼球取血于離心管內(nèi)，放置約1h，使血清充分析出，2000r/min離心10min,或6000r/min,4min,收集血清。第50頁，共82頁，2023年，2月20日，星期三（四）血清溶血素的測(cè)定

半數(shù)溶血值（HC50）的測(cè)定（4）溶血反應(yīng)取血清用SA緩沖液稀釋（一般為200-500倍）。將稀釋后的血清1mL置試管內(nèi)，依次加入2%(v/v)SRBC0.5mL,補(bǔ)體1mL（用SA液按1：8稀釋），另設(shè)不加血清的對(duì)照管（以SA緩沖液代替）。置37℃恒溫水浴中保溫15-30min后，冰浴終止反應(yīng)。2000r/min。取上清液1mL，加都氏試劑3mL,同時(shí)取2%(v/v)SRBC0.25mL加都氏試劑至4mL,充分混勻。放置10min后，于540nm處以對(duì)照管作空白，分別測(cè)定各管光密度值。第51頁，共82頁，2023年，2月20日，星期三（四）血清溶血素的測(cè)定

半數(shù)溶血值（HC50）的測(cè)定（5）結(jié)果判定溶血素的量以半數(shù)溶血值（HC50）表示，按下列公式計(jì)算。

樣品光密度值

HC50=×稀釋倍數(shù)

SRBC半數(shù)溶血時(shí)的光密度值受試樣品組的HC50顯著高于對(duì)照組的HC50，可判定該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽性。第52頁，共82頁，2023年，2月20日，星期三（五）小鼠碳廓清實(shí)驗(yàn)1．原理在一定范圍內(nèi)，體內(nèi)碳顆粒的清除速率與其劑量呈指函數(shù)關(guān)系。以血碳濃度對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)，時(shí)間為橫坐標(biāo)，兩者成直線關(guān)系。此直線斜率（K）可表示吞噬速率。動(dòng)物肝、脾重量影響吞噬速率，一般以校正吞噬指數(shù)a表示。第53頁，共82頁，2023年，2月20日，星期三（五）小鼠碳廓清實(shí)驗(yàn)2.儀器和試劑

721分光光度計(jì)、計(jì)時(shí)器、血色素吸管、印度墨汁、Na2CO3第54頁，共82頁，2023年，2月20日，星期三（五）小鼠碳廓清實(shí)驗(yàn)3．技術(shù)要點(diǎn)（1）注射用墨汁配制將印度墨汁原液用生理鹽水稀釋3～4倍。（2）注射墨汁稱小鼠體重，從小鼠尾靜脈注入稀釋的印度墨汁，按每10g體重0.1ml計(jì)算。待墨汁注入，立即計(jì)時(shí)。第55頁，共82頁，2023年，2月20日，星期三（五）小鼠碳廓清實(shí)驗(yàn)（3）測(cè)定注入墨汁后2、10min，分別從內(nèi)眥靜脈叢取血20μl，并立即將其加到2ml0.1%Na2CO3溶液中。用721分光光度計(jì)在600nm波長處測(cè)光密度值（OD）。以Na2CO3溶液作空白對(duì)照。第56頁，共82頁，2023年，2月20日，星期三（五）小鼠碳廓清實(shí)驗(yàn)（4）肝脾稱重

將小鼠處死，取肝臟和脾臟，用濾紙吸干臟器表面血污，稱重。第57頁，共82頁，2023年，2月20日，星期三（五）小鼠碳廓清實(shí)驗(yàn)4．結(jié)果判定

以吞噬指數(shù)表示小鼠碳廓清的能力。按下式計(jì)算吞噬指數(shù)a。

lgOD1-lgOD2K＝───────

t2－t1

體重吞噬指數(shù)a＝───────×3√K

肝重＋脾重

受試樣品組的吞噬指數(shù)顯著高于對(duì)照組的吞噬指數(shù)，可判定該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽性。第58頁，共82頁，2023年，2月20日，星期三（五）小鼠碳廓清實(shí)驗(yàn)5.注意事項(xiàng)靜脈注入碳粒的量、取血時(shí)間、取血量一定要準(zhǔn)確。墨汁放置中，碳?？沙劣谄康?，臨用前應(yīng)搖勻。使用新的墨汁時(shí)，應(yīng)在實(shí)驗(yàn)前摸索一個(gè)最適墨汁注入量，即正常小鼠在20min內(nèi)不容易廓清。第59頁，共82頁，2023年，2月20日，星期三（六）小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn)（滴片法）

1.原理：是利用巨噬細(xì)胞對(duì)光滑表面如玻璃表面具有粘附的特性，將含有巨噬細(xì)胞的腹腔液滴于載玻片上，加入雞紅細(xì)胞，孵育一定時(shí)間后，沖洗掉無粘附力或粘附力差的細(xì)胞，固定染色，，獲得以巨噬細(xì)胞為主的標(biāo)本，在顯微鏡下計(jì)數(shù)吞噬雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞的百分比和吞噬指數(shù)，據(jù)此判定巨噬細(xì)胞的吞噬能力。第60頁，共82頁，2023年，2月20日，星期三（六）小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn)（滴片法）2.儀器和材料顯微鏡、37℃孵箱、計(jì)數(shù)器、手術(shù)器械一套、注射器、滴管、膠頭吸管、吸耳球、載玻片、染色槽、試管第61頁，共82頁，2023年，2月20日，星期三（六）小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn)（滴片法）3．技術(shù)要點(diǎn)（1）1％雞紅細(xì)胞懸液：實(shí)驗(yàn)前取雞頸靜脈或動(dòng)脈血，置于盛有玻璃珠（20個(gè)左右）的三角瓶內(nèi)，連續(xù)順一個(gè)方向充分搖動(dòng)5min～10min，除去纖維蛋白，4℃冰箱保存。實(shí)驗(yàn)前用生理鹽水洗滌3次，每次1500r/min，離心10min，棄去上清。按血球壓積用Hank’s液配制成1％的紅細(xì)胞懸液。第62頁，共82頁，2023年，2月20日，星期三去纖維蛋白第63頁，共82頁，2023年，2月20日，星期三（六）小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn)（滴片法）（2）小鼠巨噬細(xì)胞的激活:實(shí)驗(yàn)前4d給每只小鼠腹腔注射2%壓積羊血紅細(xì)胞0.2ml。用頸椎脫臼法處死小鼠，腹腔注射加小牛血清的Hank‘s液4ml/只，輕輕按揉腹部數(shù)次。然后將腹壁剪開一個(gè)小口，用膠頭吸管吸取腹腔洗液2ml于試管內(nèi)（或用注射器）。用1ml加樣器吸取腹腔洗液0.5ml加入盛有0.5ml1％雞血紅細(xì)胞懸液的試管內(nèi)，混勻。用注射器（裝大針頭）吸取0.5ml混合液，加入玻片。放置孵箱內(nèi)37℃孵育15～20分鐘。孵育結(jié)束后迅速用生理鹽水將未貼壁細(xì)胞沖掉，于甲醇液中固定1分鐘，Giemsa液染色15分鐘。用蒸餾水沖洗干凈，晾干。第64頁，共82頁，2023年，2月20日，星期三（六）小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn)（滴片法）（3）實(shí)驗(yàn)操作過程中應(yīng)嚴(yán)格掌握時(shí)間。

怎樣解決各實(shí)驗(yàn)組玻片作用時(shí)間不一致的誤差？？第65頁，共82頁，2023年，2月20日，星期三（六）小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn)（滴片法）（4）計(jì)數(shù)

用40×顯微鏡計(jì)算吞噬率和吞噬指數(shù)。每張片計(jì)數(shù)100個(gè)巨噬細(xì)胞，按下式計(jì)算吞噬百分率和吞噬指數(shù)。

吞噬雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)吞噬百分率（%）=───────────────×100

計(jì)數(shù)的巨噬細(xì)胞數(shù)

被吞噬的雞紅細(xì)胞總數(shù)吞噬指數(shù)=─────────────

計(jì)數(shù)的巨噬細(xì)胞數(shù)第66頁，共82頁，2023年，2月20日，星期三小鼠腹腔中分離巨噬細(xì)胞第67頁，共82頁，2023年，2月20日，星期三腹水中巨噬細(xì)胞第68頁，共82頁，2023年，2月20日，星期三巨噬細(xì)胞第69頁，共82頁，2023年，2月20日，星期三（六）小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn)（滴片法）4．結(jié)果判定

以吞噬百分率或吞噬指數(shù)表示小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬能力。

受試樣品組的吞噬百分率、吞噬指數(shù)與對(duì)照組吞噬百分率、吞噬指數(shù)比較，差異均有顯著性，方可判定該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽性。第70頁，共82頁，2023年，2月20日，星期三（六）小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn)（滴片法）5.注意事項(xiàng)頸椎脫臼處死小鼠勿用力過大，防止腹腔內(nèi)血管和內(nèi)臟破裂出血影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。放滴片的搪瓷盤內(nèi)應(yīng)保持一定的濕度，以防液體干燥。孵育后的標(biāo)本沖洗次數(shù)的差別不宜太大，更不要直接沖在有細(xì)胞的部分。在鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞時(shí)要數(shù)完一個(gè)視野后再換另一個(gè)視野。第71頁，共82頁，2023年，2月20日，星期三（七）NK細(xì)胞活性測(cè)定－乳酸脫氫酶（LDH）測(cè)定法1．原理活細(xì)胞的胞漿內(nèi)含有LDH。正常情況下，LDH不能透過細(xì)胞膜，當(dāng)細(xì)胞受到NK細(xì)胞的殺傷后，LDH釋放到細(xì)胞外。LDH可使乳酸鋰脫氫，進(jìn)而使NAD還原成NADH，后者再經(jīng)遞氫體吩嗪二甲酯硫酸鹽（PMS）還原碘硝基氯化四氮唑（INT），INT接受H＋被還原成紫紅色甲臢類化合物。在酶標(biāo)儀上用490nm比色測(cè)定。第72頁，共82頁，2023年，2月20日，星期三（七）NK細(xì)胞活性測(cè)定－乳酸脫氫酶（LDH）測(cè)定法2.儀器和材料酶標(biāo)儀、YAC-1細(xì)胞、Hank’s液（PH7.2-7.4）、RPMI1640完全培養(yǎng)液、乳酸鋰、硝酸氯化四氮唑（INT）、吩嗪二甲酯硫酸鹽（PMS）、NAD、0.2mol/L的Tris-HCl緩沖液（PH8.2）、1%NP40或2.5%Triton第73頁，共82頁，2023年，2月20日，星期三（七）NK細(xì)胞活性測(cè)定－乳酸脫氫酶（LDH）測(cè)定法3.試劑配制LDH基質(zhì)液的配制乳酸鋰5×10-2mol/L硝酸氯化四氮唑（INT）6.6×10-4mol/L吩嗪二甲酯硫酸鹽（PMS）2.8×10-4mol/L氧化型輔酶I（NAD）1.3×10-3mol/L將上述試劑溶于0.2mol/L的Tris-HCl緩沖液（PH8.2）中。第74頁，共82頁，2023年，2月20日，星期三（七）NK細(xì)胞活性測(cè)定－乳酸脫氫酶（LDH）測(cè)定法4．技術(shù)要點(diǎn)（1）靶細(xì)胞的傳代（YAC-1細(xì)胞）實(shí)驗(yàn)前24h將靶細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)。用前以Hank‘s液洗3次。用RPMI1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為4×105個(gè)/ml。第75頁，共82頁，2023年，2月20日，星期三（七）NK細(xì)胞活性測(cè)定－乳酸脫氫酶（LDH）測(cè)定法（2）脾細(xì)胞懸液的制備（效應(yīng)細(xì)胞）無菌取脾，置于盛有適量無