催化反應動力學多底物

催化反應動力學多底物第1頁，共43頁，2023年，2月20日，星期三第一節(jié)單底物反應動力學第三節(jié)多底物反應動力學第四節(jié)別構酶動力學第五節(jié)pH和溫度對酶催化反應速度的影響主要內容第四章酶催化反應動力學第2頁，共43頁，2023年，2月20日，星期三第三節(jié)多底物動力學大多數(shù)酶促反應是多底物反應,其動力學機理復雜。第3頁，共43頁，2023年，2月20日，星期三一、酶促反應分類底物數(shù)目酶分類催化反應比例（%）單底物單向單底物假單底物雙底物三底物異構酶裂合酶水解酶氧化還原酶基團轉移酶連接酶

略5122627246第4頁，共43頁，2023年，2月20日，星期三大多數(shù)酶催化反應是兩個或多個底物參與的反應(以雙底物反應物系統(tǒng)為例討論),以轉移反應為主,占總酶促反應的50%左右；真正的單底物反應只有異構反應(異構酶催化的反應),只占總酶促反應的5%,將單向的單底物反應(裂合酶反應)計算在內,也不超20%；第5頁，共43頁，2023年，2月20日，星期三二、多底物的命名、表示方法以雙底物雙產物例:（1）底物按與酶結合次序分A、B、C、D；（2）產物按脫離次序分P、Q、R、S；（3）抑制劑I；（4）中間產物分穩(wěn)態(tài)和過渡態(tài)（非/中心過渡態(tài)）；穩(wěn)態(tài):酶與底物共價結合,可與另一底物發(fā)生雙分子反應;過渡態(tài):(1)酶活中心未完全占據;(2)酶活中心已完全占據.（5）穩(wěn)態(tài)中間物用E、F、G表示，過渡態(tài)用EA、EB、EAB表示，通常只假定存在著一種中心過渡態(tài)中間物（EAEP）表示其異構化（一）Cleland命名和表示方法第6頁，共43頁，2023年，2月20日，星期三Cleland命名和表示方法（6）單（Uni),雙（Bi),三（Tri),四（Quad)等表示如，BiBi:雙底物雙產物；UniBi:單底物雙產物。按反應動力學分：有序：指所有底物與酶結合必須在任何產物釋放之前?。?）序列有序：酶與底物結合嚴格按一定順序進行；（2）序列隨機：底物與酶結合順序隨意；乒乓：一部分底物與酶結合后即釋放一部分產物再結合另一部分底物再釋放一部分產物?。?）酶促反應歷程用直線表示（除隨機）（8）隨機機制用菱形表示；（9）Km表示米氏常數(shù)，Ki表示抑制常數(shù)。第7頁，共43頁，2023年，2月20日，星期三（二）多底物反應動力學分類本節(jié)主要討論BiBi反應；按反應方式歷程(是否形成三元絡合物)分為兩大類:（序列與乒乓）1、形成三元絡合物（1）序列有序機制（2）序列隨機機制第8頁，共43頁，2023年，2月20日，星期三底物與酶結合有一定嚴格順序，先A后B,產物釋放也有同樣規(guī)定次序，先P（B產物）后Q（A產物）.以NAD+、NADP+為輔酶的脫氫酶為此類機制；例：NAD++CH3CH2OHCH3CHO+NADH+H+（A）（B）（P）（Q）（1）序列有序反應cleland表示法第9頁，共43頁，2023年，2月20日，星期三說明（1）中心過渡態(tài)EAB可轉變?yōu)镋PQ，也可直接分解為產物，或此中間物有一系列推導出的方程一樣；（2）若酶本身發(fā)生異構化，則為異型序列BiBi，推導出的方程與（1）有所不同;（3）特殊序列有序機制：EAB形成很慢分解極快在動力學上可忽略。為Theorell-Chance機制EEEAEQABPQ第10頁，共43頁，2023年，2月20日，星期三（2）序列隨機機制底物與酶結合的先后是隨機的，產物釋放也是隨機的。少數(shù)脫氫酶和一些轉磷酸基團的激酶屬于這一類。如肌酸激酶反應,Cleland表示法肌酸+ATP磷酸肌酸+ADP(A)(B)(P)(Q)第11頁，共43頁，2023年，2月20日，星期三2、反應過程不形成三元絡合物即乒乓機制；雙置換反應(double-displacementreactions)；特征:酶E與底物A生成復合體，產物P的脫離在另一底物B加入之前。E+AEAEPFEQE+QFBPB第12頁，共43頁，2023年，2月20日，星期三乒乓機制圖解A和Q競爭自由酶E形式,B和P競爭修飾酶E’即第13頁，共43頁，2023年，2月20日，星期三屬于乒乓機制的酶大多數(shù)是具有輔酶的，如轉氨酶等(催化從氨基酸轉移氨基到酮酸)，一些糖苷轉移酶也是；如轉氨酶先與氨基酸（A）作用產生EA釋放酮酸（產物P），期間輔酶結構轉變酶E變成酶F，F(xiàn)再與底物B（另一酮酸）作用釋放產物（相應氨基酸）第14頁，共43頁，2023年，2月20日，星期三三、雙底物反應恒態(tài)動力學對特定反應歷程要得到其穩(wěn)態(tài)動力學一般步驟:(1)寫出反應歷程的方程式(2)再寫出包含各種酶形式的微分方程,建立穩(wěn)態(tài)后各種酶存在的形式濃度變化可做等于0(3)根據質量守恒條件去尋找各種酶存在形式的濃度代數(shù)解,最終得到酶促反應的速度方程1956年King和Altman在矩陣理論基礎上提出了一個簡便方法后經Wong和Hanes加以規(guī)則化1、King-Altman方法推導速度方程第15頁，共43頁，2023年，2月20日，星期三King-Altman方法大體步驟(1)寫出反應歷程,安排成封閉的幾何圖形圖1式1的K-A圖式1第16頁，共43頁，2023年，2月20日，星期三(2)寫出n-1線的所有可能的圖形n代表角數(shù)(即酶的存在形式!),m為完整圖形的線數(shù),則它的n-1線圖形總數(shù)為圖2：圖1的n-1線圖形第17頁，共43頁，2023年，2月20日，星期三封閉圈問題！當反應歷程構成的基本圖形不止一個封閉圈時,在寫n-1線圖時,應把含有封團圈的圖形扣除!第18頁，共43頁，2023年，2月20日，星期三(3)按K-A圖形寫出各種酶存在的濃度和總酶濃度的比例,基本表達式:爭對每種酶形式,按圖2表示的n-1線圖中3個形式分別寫出其形成過程,可得到:[E0]為總酶濃度,有(1)(2)第19頁，共43頁，2023年，2月20日，星期三(4)可方便寫出速度方程(3)將(1)、（2）式代入（3）可得式，簡化之得第20頁，共43頁，2023年，2月20日，星期三這個方程式和用數(shù)學法推導出的單底物單產物速度方程形式相同。兩例中酶的形式數(shù)不同，結果相同，這是因為反應歷程中EAEP為中心復合物。圖解法推導時中心復合物是可以當作一個酶形式來處理的，雖然此處它們被當作兩個酶形式來處理的，但導出的公式和做為一個酶形式來處理是完全相同的。說明:第21頁，共43頁，2023年，2月20日，星期三初速度方程所得到的速度方程的一般形式及初速度方程和以前數(shù)學推導的結果完全相同。第22頁，共43頁，2023年，2月20日，星期三2.Alberty表達式許多雙底物酶促反應在固原定一個底物濃度而改變另一個底物濃度時服從米氏方程式；對許多雙底物酶促反應，在總酶濃度固定并遠小于兩個底物濃度時，Alberty根據K-A圖形法推導出其方程一般形式為：goback第23頁，共43頁，2023年，2月20日，星期三討論1、[B0]濃度很高時，簡化為：與米氏方程一樣！水解酶類的酶促反應就如此；2、[B0]固定但未飽和:

這也是米氏方程一種形式！3、序列有序機制時,混合常數(shù)為KASKBm,非KAmKBm;4、序列隨機機制中則都適用;5、乒乓機制初速度內P極低,逆過程忽略,KAS=0,簡化為:第24頁，共43頁，2023年，2月20日，星期三雙倒數(shù)圖討論由上分析,當固定一底物濃度改變另一底物濃度時遵守米氏方程;相應雙倒數(shù)圖為線性,分酶完全飽和和半飽和。1/[A0]1/v0斜率=KAm/vmax1/vmax1/[A0]1/v0斜率=(KAm+KAsKBm/[B0])/vmax(1+KBm/B0)/vmax[B0]飽和時1/v0~1/[A0]B0固定≈KBm時1/v0~1/[A0](b)(a)[A0]固定或飽和亦然！第25頁，共43頁，2023年，2月20日，星期三附1：Alberty方程系數(shù)求解（不飽和）用二次作圖法！1、先雙倒數(shù)作圖：1/v~1/[A0],此時固定不同的[B0]例：甘油脫氫酶催化甘油的反應是依賴NAD+的有序BiBi反應：1/v1/[A0][B0]NAD+

+GlyNADH+DHAGDHAB第26頁，共43頁，2023年，2月20日，星期三2、再分別以截矩對1/[B0]作圖：1/[B0]1/[B0]~1/[B0]其二次作圖的豎軸截矩為1/Vm，斜率為KmB/Vm，橫軸截矩為KmB1/VmKmB/Vm以斜率對1/[B0]作圖：亦然?。?！KmB第27頁，共43頁，2023年，2月20日，星期三附2：穩(wěn)態(tài)法推導多底物反應方程例用穩(wěn)態(tài)法推導，可獲得穩(wěn)態(tài)法方程:①序列機制的底物動力學的推導第28頁，共43頁，2023年，2月20日，星期三序列隨機機制穩(wěn)態(tài)推導kA[E][A]=k-A[EA]k1A[EB][A]=k-1A[EBA]k1B[EA][B]=k-1B[EBA]設第29頁，共43頁，2023年，2月20日，星期三[E0]=[E]+[EA]+[EB]+[EAB]V=k[EAB]Vm=k[E0]各項代入約去[EAB]，上下同乘[A][B]（I）與Alberty表達式完全相同!第30頁，共43頁，2023年，2月20日，星期三酶對底物A的米氏常數(shù)(B飽和時)酶對底物B的米氏常數(shù)(A飽和時)[A][B]都達飽和時最大反應速度為底物A與E結合的解離常數(shù)

當

則得式（II），與米氏方程相同:Vm（II）（I）第31頁，共43頁，2023年，2月20日，星期三②乒乓機制推導由于產物P濃度極低,逆過程可忽略,式（I）中KsA=0故其速度方程為:第32頁，共43頁，2023年，2月20日，星期三3.Dalziel表達式Dalziel關于雙底物的一般表達式：第33頁，共43頁，2023年，2月20日，星期三動力學系數(shù)Φ求解①一次作圖原方程變換如下式：固定不同[B0]，作[E0]/v0~1/[A0]得一系列直線：[B0]1/[A0][E0]/v0斜率第34頁，共43頁，2023年，2月20日，星期三②再二次作圖：分別用一次作圖截矩、一次作圖斜率對1/[B0]作圖：1/[B0]一次作圖截矩截矩=

Ф0斜率=ФB1/[B0]一次作圖斜率截矩=ΦA斜率=ΦAB第35頁，共43頁，2023年，2月20日，星期三實例甲醛脫氫酶FADH催化甲酸轉化為甲醛.此反應為雙底物酶促反應,式中Ф為動力學系數(shù);[E0]為酶濃度;[A0]、[B0]為底物A、B濃度.將方程寫成以下形式根據Dalziel提出的雙底物酶促反應動力學方程式,采用兩步法作圖即可求得反應過程的動力學常數(shù).截距Y1,斜率Y2AB第36頁，共43頁，2023年，2月20日，星期三先固定B(甲酸)的濃度,以[E0]/V~1/[A]作圖,得到截距Y1和斜率Y2;在不同B的濃度下可得到不同的Y1和Y2(圖1A;再以Y1~1/[B]和Y2~1/[B]進行二次作圖(圖1B),即可求得Ф0,ФA,ФB,Ф

AB。圖1A37℃,pH7.0下游離甲醛脫氫酶酶促反應圖圖1B圖1A截距Y1～1/[HCOOH]、斜率Y2～1/[HCOOH]關系圖最后通過Dalziel方程和Alberty方程之間的常數(shù)轉換關系求得反應的米氏常數(shù).第37頁，共43頁，2023年，2月20日，星期三Dalziel與Alberty比較比較兩方程雙倒數(shù)形式,有:vmax=[E0]/Ф,得:[E0]=vmaxФ,將其代入Dalziel方程雙倒數(shù)形式中可得：再與Alberty雙倒數(shù)方程比較有：KAm=ФA/ФKBm=ФB/Ф,KAs=ФAB/ФB

1,

Dalziel方程可轉化為Alberty方程，并可求得相應常數(shù)之間關系:第38頁，共43頁，2023年，2月20日，星期三2,Dalziel表達式比Alberty表達式中常數(shù)形式更直觀Dalziel形式（4-61）Alberty形式（4-62）EEA[P]FEB[Q]k1[A0]k3[B0]k-1k-3k2k4穩(wěn)態(tài)乒乓BiBiKing-Altman圖