植物生物學(xué)實驗?zāi)婢趁{迫水稻幼苗與其生理指標(biāo)分析

《植物生學(xué)實驗》逆境脅迫稻幼苗及生理指標(biāo)析

實一水稻苗鹽迫的反實二用氮四法NBT)測定物SOD力

實驗一：稻幼苗對脅迫的反一、實驗的?解植物如何對逆境脅迫產(chǎn)生應(yīng)。?察分析水稻幼苗鹽脅迫后發(fā)生的形態(tài)生理指標(biāo)變化，用于指導(dǎo)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。

二、實驗理逆境或脅迫（：對植物產(chǎn)生傷害的環(huán)境。逆境脅迫

生物因素非生物因素

病害蟲害雜草溫度：低溫(害、凍害高溫?zé)岷λ郑焊?，濕害、害鹽害酸雨紫外線（UV營養(yǎng)虧缺重金屬

逆境脅迫植物傷害表現(xiàn)形變化：生長停滯，葉片萎蔫、卷曲、變黃、枯死等。生生化：葉綠素含量減少，光合速率下降，呼吸速率下降或升高，細(xì)胞膜系統(tǒng)破壞，酶活性紊亂等。

植物對逆脅迫的適適應(yīng)方式：避逆性（）：物會在時空上躲避不良環(huán)境，如沙漠植物只在雨季生長、陰生植物在樹蔭下生長等。耐逆性（）植能忍逆的作用。形態(tài)生理變化：

形態(tài)變化：如干旱條件下葉小、根系發(fā)達(dá)；淹水時擴(kuò)大根部通氣組織；冬季低溫來臨前生長停止、進(jìn)入休眠等。

生理變化：1.物膜構(gòu)改變，成脅迫蛋如熱激蛋白、抗凍蛋白等。2.

保護(hù)酶系統(tǒng)受破壞由超氧化物歧化酶(、過化氫酶、過氧化物酶(POD)等組成的保護(hù)酶系統(tǒng)會降低或消除活性氧的危害。正情況下，細(xì)胞內(nèi)自由基的產(chǎn)生和清除處于動態(tài)平衡狀態(tài)，自由基水平很低，不會傷害細(xì)胞。遭受逆境脅迫時，細(xì)內(nèi)自由基積累過多，保護(hù)酶系統(tǒng)被破壞，產(chǎn)生許多有害的過氧化產(chǎn)物如丙二醛，會傷害細(xì)胞。由基會破壞膜結(jié)構(gòu)，損傷大分子生命物質(zhì)，引起一系列生理生化紊亂，導(dǎo)致植物死亡。

活性氧：離子自由基、羥基自由基-OH)、過氧化氫(HO)單態(tài)氧(1)具很的化力對多物22功能分子有破壞作用、引起膜的過氧化作用。自由基：有未配對價電子的原子或原子團(tuán)。天然的非自由基清劑有維生素E、谷胱甘肽、抗壞血酸、類胡蘿卜素等。增加滲透節(jié)物質(zhì)，有利吸水糖、有機(jī)酸、一些無機(jī)離子如K+

，其中最有效的是脯酸。

增加脫落(ABA)量

植物

鹽脅迫鹽脅迫（害）：土壤鹽分過多對植物造成危害。通常土壤含鹽量達(dá)0就不利于植物生長，主要鹽分：氯化鈉、硫酸鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉等。鹽土：化鈉和硫酸鈉較多的土壤。堿土：酸鈉和碳酸氫鈉較多的土壤。鹽堿土：含量.6-10%。若鹽脅迫強(qiáng)度較小，除鹽后，植物生長可以恢復(fù)；若鹽脅迫強(qiáng)度較大，除鹽后，植物生長不可恢復(fù)

鹽害

植物對鹽迫的適應(yīng)根據(jù)植物抗鹽能力大小分為：鹽植物：鹽范圍如堿蓬、蘆葦、紅樹植物等。甜植物（非鹽生植物）：耐范圍，甜菜、高粱等大多數(shù)農(nóng)作物。

鹽生植物避鹽機(jī)制避鹽：物通過某方式細(xì)胞內(nèi)鹽控制在傷閾值之下，以避免鹽分過多對細(xì)胞傷害。泌鹽：物通過莖、葉上專門分泌鹽分的鹽腺或鹽囊泡)鹽分分泌到體外，減少或避免鹽分對植物的傷害，如紅樹植物。

鹽生植物避鹽機(jī)制泌鹽：物通過莖葉上專門泌鹽分鹽腺或鹽泡)將鹽分分泌到體外，減少或避免鹽分對植物的傷害，如紅樹植物。稀鹽：物通過吸收大量水分和加速生長，稀細(xì)胞內(nèi)鹽分濃度，并將鹽分積累在莖葉的肉質(zhì)化組織，維持體內(nèi)鹽分濃度的恒定，如堿蓬。

鹽生植物避鹽機(jī)制泌鹽：植通過莖、葉上專門分泌鹽分的腺或鹽囊泡)鹽分分泌到體外，減少或避免鹽分對植物的傷害，如紅樹植物。稀鹽：物通過吸大量水分加速生長稀釋細(xì)胞鹽分濃度并將鹽分積累在莖葉的肉質(zhì)化組織，維持體內(nèi)鹽分濃度的恒定，如堿蓬。拒鹽：植對鹽有一定的選擇性吸收，并能鹽分重新分配植物的安全部位，從而降低鹽分對地上部的傷害，如蘆葦、燈芯草。

拒鹽的鹽植物蘆葦——上部分拒

燈芯草——地上部分拒鹽

植物鹽脅傷害的表生理干旱土壤中鹽分過多使土壤溶液水勢下降，導(dǎo)致植物吸水困難，甚至體內(nèi)水分有外滲的危險，造成生理干旱。離子失調(diào)植物由于過多吸收某種鹽類而排斥對另一些礦質(zhì)鹽的吸收，導(dǎo)致營養(yǎng)缺乏或產(chǎn)生毒害作用。代謝壞葉體體光速下；白合受制分解加強(qiáng)，產(chǎn)生有毒物質(zhì)，對細(xì)胞產(chǎn)生毒害。膜透性改：高濃度可置換細(xì)胞膜結(jié)合a2、K，膜結(jié)構(gòu)破壞、功能改變，細(xì)胞內(nèi)K+、有機(jī)質(zhì)等外滲。

三、實驗劑與材料?：氯化鈉?儀器與器皿：電子天平，低溫冰箱，燒杯，容量瓶，量筒，PE套等。?：水稻幼苗?方式：鹽脅迫，配制濃度0~0.3mol/L。

四、實驗驟1.自己設(shè)計配制2不同鹽濃度的aCl溶液并設(shè)置對照CK)。2.挑選生長整齊一致的水稻秧苗，然后隨機(jī)取1于燒中觀記描述鹽迫理前杯稻苗農(nóng)藝形態(tài)性狀(苗高、葉片顏色、葉片數(shù)等3.各杯分別加入不同濃度NaCl溶液0ml左右（原則：根系要浸入溶液中），然后放置在實驗架上進(jìn)行鹽脅迫處理12-24。4.當(dāng)高鹽度處理的秧苗葉片開始出現(xiàn)卷曲時，觀測記載各杯秧苗藝態(tài)狀變，后各的苗葉片分別剪下，各杯隨機(jī)稱取少量葉片放入P手套中并做好標(biāo)記，置于冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

五、實驗組個人組成一個小組進(jìn)行水稻幼苗鹽脅迫反應(yīng)實驗。小設(shè)置處：對和不鹽度，每處理2重復(fù)，共6樣品。意每杯要做好自己的標(biāo)記、寫上組別或姓名。下周：應(yīng)（定植物超化物歧化（SOD的活力。

《植物生學(xué)實驗》逆境脅迫稻幼苗及生理指標(biāo)析實驗二：氮藍(lán)四唑）法測定植物氧物化（SOD）活力

氮藍(lán)氮藍(lán)四唑（習(xí)掌握

NBT法來測植物超化物歧化酶（superoxide）的活力。解不同鹽濃度脅迫對水稻幼苗葉片的影響。

二、實驗理發(fā)現(xiàn)：1938年M人首次從牛紅血中離得到OD。分布：廣泛分布在各種生物體內(nèi)，其活性高低可為抗衰老指標(biāo)。類型：是含Cu、Zn、、Fe屬元素、能清除超氧陰離子自由基的酶，其類型有u/Zn-SOD、、Fe-SOD。

SOD定法直接法：沖輻射分解法、電子順磁共振波法、核磁共振法。間接法（化法）：苯三酚自氧化法、細(xì)胞色還原法、羥胺法、黃嘌呤氧化酶-NBT法、腎上腺素法等。免疫法：射免疫法、化學(xué)發(fā)光免疫分析法、ELISA等。超氧陰離子自由基壽命短，不穩(wěn)定，不易直接測定SOD活，因而采用間接法測定。常用有3種：藍(lán)四唑化還原法、鄰苯三酚自氧化法、化學(xué)發(fā)光法。

NBT測定SOD活性的原理在有氧化物質(zhì)存在下，核黃素被光還原，還原的核黃素易氧而生氧自基，可將氮藍(lán)四唑還原為色的甲腙，甲腙在560nm有最大吸收。而SOD可清除氧自由基，從而抑制了甲腙的形成。光還原反應(yīng)后，應(yīng)液藍(lán)色愈深，說明酶活性低反之酶活性愈高。據(jù)此可以計算出酶活性大小。酶單位/樣品量

核素：在氧質(zhì)存在下，還原的核黃素與氧反應(yīng)產(chǎn)生氧。氮四(NBT)：氧自由基將無色(或微黃的NBT還原為藍(lán)色甲腙甲氨：提核黃素的還原反應(yīng)所需的，使得核黃素的光激還原反應(yīng)得以進(jìn)行。SOD酶：SOD通過化氧歧化，生成O2

與HO2

，從而抑制藍(lán)色腙形成。催化反應(yīng)如下：??222

鹽脅對物片OD酶的影響（1）在一定鹽度的脅迫下，植物葉片中OD活性隨鹽濃度的升高而增強(qiáng)。（2）SOD酶能有效抑制膜脂過氧化作用，具有一定的保護(hù)作用。因此，鹽脅迫的損傷在一定范圍內(nèi)是可以修復(fù)。然而，膜系統(tǒng)的修復(fù)與OD、CAT、POD等抗氧化酶的活性和抗壞血酸(ASA)、谷胱甘肽GSH)等抗氧化物含量的變化密切相關(guān)。

二、實驗料、儀器試劑材料：水稻幼苗鹽脅迫處理后的葉片。儀器設(shè)備電子天平，高速臺式離心機(jī)，分光光度計，移液器，熒光燈（反應(yīng)試管處照度為000Lx），試管數(shù)支，研缽，燒杯，離心管，量筒等。試劑：SOD提：50mmol/L磷緩液（pH7.8）14.5mmol/L硫氨酸（Met溶液：現(xiàn)配現(xiàn)用。2.25mmol/L藍(lán)四唑溶液（NBT：避光保存，現(xiàn)配現(xiàn)用。60μmol/L核黃素溶液：避光保存，現(xiàn)配現(xiàn)用。3μmol/L－

溶液

22主要試劑制22（1）50mmol/L磷酸鈉緩液（pH7.8：A液：NaHPO·2HO分子量56.01）：3.12g溶于蒸餾水，定溶至00ml。B液：·12H（子：于餾，定溶至00ml。取A液8與B液9混合，定容至，。（2）SOD提取液：50mmol/L磷酸緩沖液[含0.1mmol/LEDTA；0.3%(w/v)Triton；w/v）聚乙烯聚吡咯烷酮（PVP,。即升酸沖中加，2000.5mol/L的EDTA母液，3mlTriton。

（3）甲硫氨（分子量49.21）：稱2于蒸餾水，定溶至000ml(較難溶，需稍微加熱）。（4）NBT分子量817.7：稱92mg溶于50ml50mM磷酸磷酸緩沖液（），現(xiàn)配現(xiàn)用，避光保存。（5）60μmol/L黃素（子量76.36：稱2.25mg溶于0ml50mM磷酸磷酸緩沖液（pH7.8），現(xiàn)配現(xiàn)用，避光保存。（6）3μmol/LEDTA-Na（分子量3）Amol/L：稱.306g溶于蒸餾水，定容至。（注意：攪拌時用調(diào)p至.0才能完全溶解）。B、0.5mmol/L：取A液1用蒸餾水稀釋定容至1。、3：取B3ml用磷酸緩沖液稀釋定容至00ml。

三、實驗驟酶提：將經(jīng)鹽脅迫處理、稱好保存的水稻葉片0置于預(yù)冷的研缽中，加-2ml預(yù)的SOD提液在冰浴上研磨成漿，并轉(zhuǎn)移到離心管中，再用提取液清研缽，每次1ml，轉(zhuǎn)移到同離管中，終積不超過ml；于000-8000rpm下離心5min，上液即為OD酶粗提液置冰箱保存用。

2.反應(yīng)體系試劑mMSOD提取液mM硫氨酸NBTμMEDTA-Na2M核黃素蒸餾水

用量（ml/）1.50.30.30.30.3酶液

（支照管以取液代替液）總體積

3.0

做預(yù)實驗：

在正式測OD活性之前，要進(jìn)行酶液加入量的預(yù)實驗，

以確最酶液度。酶?。喝∑渲幸还苊赴?倍10倍、100稀釋。合液配制：計4支試管的用量，按反應(yīng)體系表中各溶外配制1份混合(用配)。加液在每支管加混液2，再分加入相對的酶液量中2支白對照取液代替酶，混勻，馬上用黑色塑料袋罩住。照反：取支對管于暗處其余的置試管架上4000Lx日光燈下應(yīng)20min（求管受情一致，照間視體況而，光照強(qiáng)、溫度高則時間縮短，反之則延長，時今實的照時左右終反：照光完畢上用黑色料袋罩住管架，以止應(yīng)。SOD活測定以不照光的對照管做空白，分別測定各管O值。確酶加入：抑制率在35%-65%為佳。

式實驗準(zhǔn)備6支同型號試管：4樣品、2支對照。合液配制：按-8支管用配（預(yù)驗）。加酶液：各管加入混合液，4支分別加入相對應(yīng)的酶液量，2支對照管用提取液代替混勻，遮光。照光反應(yīng)：1支對照管置暗處，其余各管進(jìn)行照光反應(yīng)，時間根據(jù)預(yù)實驗進(jìn)行調(diào)整。止反應(yīng)：照光完成后，迅速用黑色垃圾袋罩住試管架，終止反應(yīng)?；钚詼y：以不照光的對照管做空白調(diào)零，逐一迅速測定各管在60處的OD值。

四、結(jié)果算一個S活性單位的確定：按最初測定SOD活性時的設(shè)計，能抑制反應(yīng)的酶量為一個S酶活性單位。如N在光照下被還原為色腙，檢測D但反系統(tǒng)中入，催化歧化為HO22

和O，與NBT競爭部分抑制了2NBT還原成藍(lán)甲腙的反應(yīng)，檢測D，NBT光化還原剛被抑制，則時加入的酶量為一個酶位

計算SOD活性SOD總活性：以每克鮮重酶單位表示。SOD活：酶位／mg蛋表。A

：照光對照管的吸光度；A：樣品管的吸光度；V：樣品液總體積（ml）；Vt

：測定時樣品用量（ml）；W：樣品鮮重（）。蛋白質(zhì)濃度單位