原位雜交技術(shù)的檢測

原位雜交技術(shù)的檢測第1頁，共27頁，2023年，2月20日，星期四HER2及其檢測的臨床意義HER2檢測相關(guān)指南及指南關(guān)于ISH的內(nèi)容更新Her2檢測常用的原位雜交方法內(nèi)容提要第2頁，共27頁，2023年，2月20日，星期四HER2介紹及其檢測的臨床意義第3頁，共27頁，2023年，2月20日，星期四HER2基因人類表皮生長因子受體-2基因HumanEpidermalgrowthFactorReceptor-2(HER2)Gene定位于染色體17q21編碼跨膜受體樣蛋白（HER2蛋白）,具有酪氨酸激酶活性HER2蛋白分子量185kDa的糖蛋白:細(xì)胞外區(qū)（配體結(jié)合區(qū)）跨膜區(qū)（傳導(dǎo)信號）細(xì)胞內(nèi)區(qū)（激酶活性）HER2細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞外細(xì)胞膜HER2第4頁，共27頁，2023年，2月20日，星期四HER2過表達(dá)的結(jié)果正常HER2表達(dá)HER2基因擴(kuò)增導(dǎo)致HER2過表達(dá)HER2過表達(dá)導(dǎo)致腫瘤增殖促進(jìn)細(xì)胞的生長和增殖------腫瘤發(fā)生抑制細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)血管新生提高細(xì)胞運(yùn)動能力,增強(qiáng)腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移作用MoasserMM.Oncogene,2007.26(46):6577FreudenberyJA,WangQ,Katsumata,etal.ExpMolPathol.2009.87(1):1第5頁，共27頁，2023年，2月20日，星期四HER2陽性的定義蛋白水平(過表達(dá)):細(xì)胞表面HER2蛋白受體表達(dá)大量增加基因水平(擴(kuò)增):

HER2編碼基因于細(xì)胞核內(nèi)拷貝增加IHCFISH第6頁，共27頁，2023年，2月20日，星期四HER2狀態(tài)對乳腺癌的臨床重要性乳腺癌的HER2陽性率約為15–25%對于乳腺癌患者，HER2過表達(dá)對早期乳腺癌預(yù)后不利；HER2過表達(dá)會降低乳腺癌轉(zhuǎn)移/復(fù)發(fā)患者的存活率HER2狀態(tài)也可預(yù)測乳腺癌的藥物治療效果，包括對曲妥珠單抗治療的反應(yīng)對紫杉醇及蒽環(huán)類藥物治療的反應(yīng)對三苯氧胺的耐藥性CarlsonRW,etal.JNCCN2006:4(Suppl.3):S1–S22.

HER2狀態(tài)評估對于確定患者是否接受抗HER2靶向治療至關(guān)重要第7頁，共27頁，2023年，2月20日，星期四HER2狀態(tài)對胃癌的臨床意義所有的胃或胃食管結(jié)合部癌患者都應(yīng)在初次診斷時檢測腫瘤的HER2狀態(tài)。HER2在胃癌中過表達(dá)預(yù)示更差的疾病結(jié)局以及進(jìn)展性更強(qiáng)的疾病類型準(zhǔn)確的胃癌HER2表達(dá)和基因擴(kuò)增檢測結(jié)果是進(jìn)展期胃癌HER2靶向治療患者篩選和療效預(yù)測的前提2010年，歐洲和美國先后批準(zhǔn)化療聯(lián)合使用曲妥珠單抗治療HER2陽性胃及胃食管交界癌患者KelleyJRandDugganJM.JClinEpidemiol2003;56:1–9.BangYJ,etal.Lancet2010;376:687–697.BangYJ,etal.JClinOncol2008;26:Abstract4526.GravalosCandJimenoA.AnnOncol2008;19:1523–1529.第8頁，共27頁，2023年，2月20日，星期四HER2檢測指南中對于ISH檢測的內(nèi)容介紹第9頁，共27頁，2023年，2月20日，星期四國內(nèi)外相關(guān)指南國外指南：ASCO/CAP乳腺癌HER2檢測指南（2013）NCCN乳腺癌臨床實踐指南（2012）NCCN胃癌臨床實踐指南（2011）歐洲胃癌HER2檢測指南（2011）國內(nèi)指南：乳腺癌HER2檢測指南（2014版）胃癌HER2檢測指南(2011)10第10頁，共27頁，2023年，2月20日，星期四BilousMetal.ModPathol2003;16:173─182.WolffAC,etal.JClinOncol2007;25:118–145.AlbarelloL,etal.AdvAnatPathol

2011;18(1):53–59IHC為2+的HER2乳腺癌和胃癌患者均應(yīng)進(jìn)行ISH復(fù)查！第11頁，共27頁，2023年，2月20日，星期四ISH檢測流程和判讀標(biāo)準(zhǔn)（ASCO-CAP2007版）2007版ArchPatholLabMed.2007;131(1):18-43第12頁，共27頁，2023年，2月20日，星期四ISH檢測流程和判讀標(biāo)準(zhǔn)（ASCO-CAP2013版）2013版–雙探針ArchPatholLabMed.2013Oct7.[Epubaheadofprint]第13頁，共27頁，2023年，2月20日，星期四14中國乳腺癌HER2檢測指南（2014版）第14頁，共27頁，2023年，2月20日，星期四HER2檢測常用檢測的ISH方法第15頁，共27頁，2023年，2月20日，星期四HER2常用檢測方法免疫組織化學(xué)(IHC):應(yīng)用抗體檢測蛋白過表達(dá)是乳腺及胃組織檢測HER2狀態(tài)的首要方式1原位雜交

技術(shù)(ISH):利用核酸探針檢測HER2基因擴(kuò)增，可用于復(fù)檢經(jīng)IHC檢測難以確定結(jié)果的病例及疑難病例11.WolffACetal.JClinOncol2007;25:118–145.IHC：顯示組織細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)狀態(tài)ISH：顯示組織細(xì)胞基因的擴(kuò)增狀態(tài)第16頁，共27頁，2023年，2月20日，星期四實驗室HER2檢測的ISH方法總結(jié)IHC通過抗體檢測HER2蛋白表達(dá)FISH通過熒光標(biāo)記的DNA探針檢測HER2基因擴(kuò)增SISH通過DNP標(biāo)記之DNA探針并通過后續(xù)顯色反應(yīng)(銀染)來檢測HER2基因擴(kuò)增通過地高辛標(biāo)記之DNA探針并通過后續(xù)顯色反應(yīng)(DAB信號)來檢測HER2基因擴(kuò)增CISH通過DNP標(biāo)記之DNA和染色體著絲粒探針并通過后續(xù)顯色反應(yīng)(HER2銀染及17號染色體堿性磷酸酶紅染)檢測HER2DualSISH第17頁，共27頁，2023年，2月20日，星期四18原位雜交技術(shù)原理第18頁，共27頁，2023年，2月20日，星期四使探針與熒光素標(biāo)記的特異親和素之間發(fā)生免疫化學(xué)反應(yīng),最后用熒光顯微鏡對待測DNA進(jìn)行定性、定量或相對定位分析。FISH技術(shù)介紹第19頁，共27頁，2023年，2月20日，星期四變性和雜交FISH操作流程組織固定和處理組織切片和處理探針制備洗脫雜交液的配制信號放大或鏡檢第20頁，共27頁，2023年，2月20日，星期四PathVysion探針試劑盒INFORM探針試劑盒BMCCancer2009,9:1HER2(–)HER2(+)HER2(+)FISH探針第21頁，共27頁，2023年，2月20日，星期四22CISH技術(shù)介紹使用生物素或者地高辛標(biāo)記的探針進(jìn)行雜交反應(yīng)，再用鼠抗生物素－抗體和辣根過氧化物酶－抗鼠抗體進(jìn)行免疫結(jié)合，最后DAB顯色第22頁，共27頁，2023年，2月20日，星期四CISH操作流程：Ⅰ預(yù)處理Ⅱ變性和雜交Ⅲ嚴(yán)格洗滌Ⅳ免疫顯色Ⅴ襯染和封片Ⅵ鏡下觀察和結(jié)果判讀第23頁，共27頁，2023年，2月20日，星期四HER2基因未擴(kuò)增HER2基因擴(kuò)增CISH探針第24頁，共27頁，2023年，2月20日，星期四雙色銀染原位雜交技術(shù)（DSISH）第25頁，共27頁，2023年，2月20日，星期四DSISH探針第26頁，共27頁，2023年，2月20日，星期四HER2的ISH檢測方法之優(yōu)缺點檢測方法優(yōu)點缺點FISH檢測結(jié)果相對免疫組化更加定量化穩(wěn)定性好可自動化操作檢測價格昂貴，信號強(qiáng)度隨時間衰減較難鑒定乳腺癌侵微小浸潤灶不能同時觀察細(xì)胞形態(tài)病理醫(yī)生及技術(shù)員接受相關(guān)技術(shù)操作及檢測結(jié)果分析的訓(xùn)練較少CISH與免疫組化相比較少受實驗前分析及處理步驟影響操作較快，普通光鏡觀察即可染色長期穩(wěn)定可同時觀察細(xì)胞形態(tài)與熒光原位雜交相比技術(shù)較新，操作欠相關(guān)經(jīng)驗缺乏經(jīng)驗之人員較難分析檢測結(jié)果檢測HER2及CEP17拷貝數(shù)需制備不同切片SISH全自動顯色原位雜交(自動圖像分析)其他優(yōu)點與顯色原位雜交相同