細胞培養(yǎng)和離心技術(shù)2014年.10

應用實例：誘導性多能干細胞（iPS）Cell.2006;126(4):663-76.Inductionofpluripotentstemcellsfrommouseembryonicandadultfibroblastculturesbydefinedfactors.TakahashiK,YamanakaS.DepartmentofStemCellBiology,InstituteforFrontierMedicalSciences,KyotoUniversity,Kyoto606-8507,Japan.ThesedatademonstratethatiPScellscanbeinducedfromMEFculturebytheintroductionoffourtranscriptionfactors,Oct3/4,Sox2,c-Myc,andKlf4.第一頁，共102頁。分化潛能（組織分化潛能（個體）第二頁，共102頁。研究的層次細胞組織動物第三頁，共102頁。培養(yǎng)的宮頸癌細胞掃描電鏡第四頁，共102頁。培養(yǎng)的人骨肉瘤細胞細胞周期研究-U2OS細胞流式細胞技術(shù)免疫熒光技術(shù)第五頁，共102頁。細胞培養(yǎng)技術(shù)一.基本知識二.基本技術(shù)三.常見問題四.應用舉例第六頁，共102頁。一、細胞培養(yǎng)的基本知識1.細胞培養(yǎng)的基本概念2.培養(yǎng)細胞的生存條件3.培養(yǎng)細胞的類型及其特點4.培養(yǎng)細胞的增殖過程√第七頁，共102頁。1.細胞培養(yǎng)(cellculture)

從生物體內(nèi)取出細胞或組織，在體外模擬體內(nèi)生理環(huán)境，在無菌、適當溫度和一定營養(yǎng)條件下進行孵育培養(yǎng)，使之生存和生長，并維持其結(jié)構(gòu)和功能的技術(shù)。*大量*遺傳性狀等條件相同的細胞；*可操控性；*動態(tài)、可觀察性等第八頁，共102頁。體內(nèi)、外細胞的差異體內(nèi)細胞

機體神經(jīng)體液調(diào)節(jié)多種類型細胞相互影響基因表達受到外來信號調(diào)節(jié)增殖過程中不斷發(fā)生著分化（由一般到特殊） 高度特化的結(jié)構(gòu)和功能特征：高度特化；

體外細胞無神經(jīng)體液調(diào)節(jié)無其他類型細胞影響細胞的許多外來信號被切斷1.特定分化基因表達減弱或停止

2.增殖活動維持（由特殊到一般）與體內(nèi)細胞結(jié)構(gòu)和功能的差異特征：失去原有形態(tài);分化特性減弱

第九頁，共102頁。特點對環(huán)境適應差；容易污染；對營養(yǎng)要求高；大部分需要附著載體生長；可能失去原有的形態(tài)功能特征。第十頁，共102頁。2.培養(yǎng)細胞的生存條件

高要求的營養(yǎng)物質(zhì)嚴格的環(huán)境條件第十一頁，共102頁。營養(yǎng)物質(zhì)培養(yǎng)基(culturemedium)，合成培養(yǎng)基：提供基本的、與體內(nèi)相同的小分子營養(yǎng)物質(zhì)：葡萄糖、氨基酸、無機離子、維生素、微量元素。血清（serum),

天然培養(yǎng)基：提供多種生長因子等活性物質(zhì)（大分子物質(zhì)）。第十二頁，共102頁。常用培養(yǎng)基：DMEM,RPMI1640,MEM,HAMF-10,HAMF-12,McCoy’s5A等注意營養(yǎng)物質(zhì)的種類和濃度第十三頁，共102頁。環(huán)境條件溫度 35~37℃氣體 95%空氣/5%CO2酸堿度 pH7.2~7.4（酚紅指示）支持物 玻璃、塑料、飼養(yǎng)層、微載體

培養(yǎng)細胞浸浴于無菌培養(yǎng)液，生長在無菌的玻璃或塑料容器中，置于恒溫、恒濕的二氧化碳孵育箱中。CO2孵育箱培養(yǎng)基培養(yǎng)容器嚴格無菌第十四頁，共102頁。培養(yǎng)皿(dish)培養(yǎng)板(6-,24-,96-wellplate)支持物(Substrates)，培養(yǎng)容器(Vessels)培養(yǎng)瓶(flask)第十五頁，共102頁。培養(yǎng)容器的容積、細胞數(shù)第十六頁，共102頁。二氧化碳培養(yǎng)箱超凈工作臺（生物安全柜):無菌的保證第十七頁，共102頁。成功的細胞培養(yǎng)：1.Well-established,properlyequipedcellculturefacility;2.Practiceofsteriletechniques;3.Appropriate,qualitycontrolledreagentsandsupplies;4.Theknowledgeandpracticeofthefundamentaltechniquesinvolvedinthegrowthofthecelltypeofinterest.第十八頁，共102頁。

1.貼附型(adhensivecell)

貼附于支持物表面，單層生長；失去在體內(nèi)原有形態(tài)，

反映胚層起源情況；有接觸抑制和密度依賴特征。大多數(shù)細胞屬此型；

2.懸浮型(suspensorycell)不貼附在支持物表面，以懸浮狀態(tài)生長；，單個分散或成團。各種源自血液的細胞、骨髓、脾細胞。

成纖維細胞型、上皮細胞型、游走型、多形型

懸浮型

3.培養(yǎng)細胞的類型及其特點第十九頁，共102頁。MRC-5人肺成纖維細胞U-937細胞，人血液病細胞PC-3，人前列腺癌細胞A549，肺癌細胞體外培養(yǎng)的細胞株倒置顯微鏡第二十頁，共102頁。體外培養(yǎng)的細胞,應注意：形態(tài)：貼壁、懸浮來源：人、鼠、其他分化程度：腫瘤細胞、正常細胞、胚胎干細胞第二十一頁，共102頁。4.培養(yǎng)細胞的增殖過程細胞增殖細胞分裂形成子代細胞的過程。增殖周期（細胞周期）：間期（G1-S-G2

期）和分裂期（M期）第二十二頁，共102頁。群體中1.多數(shù)細胞處于間期，少數(shù)處于分裂期。2.間期較長，分裂期較短。HNSCCcellG1:56.42%S:14.85%G2:22.33%M:2.65%HeLacellMphase:20-40min;Interphase:around17hs第二十三頁，共102頁。培養(yǎng)細胞一代的增殖過程傳代(passage,subculture)：

當細胞在培養(yǎng)容器中增殖到一定密度，生存空間及營養(yǎng)物質(zhì)缺乏，需按一定比例分離，接種至新的培養(yǎng)容器并更新培養(yǎng)液，這個過程稱為細胞傳代。一代:

細胞接種后到下一次傳代的一段時間；可增殖幾次。

培養(yǎng)細胞一代的三個階段：潛伏期、指數(shù)增生期、平臺期

實驗研究多在指數(shù)增長期進行第二十四頁，共102頁。一定密度“匯片”接種

平臺期有活力，無增殖貼壁鋪展體積變大、數(shù)目增多

潛伏期有活力，無增殖傳代

指數(shù)增長期

快速增殖，增殖幾次012345（培養(yǎng)天數(shù)）細胞數(shù)量培養(yǎng)細胞一代的增殖過程第二十五頁，共102頁。培養(yǎng)細胞的生命期

Lifespan:細胞在體外培養(yǎng)中持續(xù)增殖和存活的時間。一般可分為原代培養(yǎng)期、傳代期和衰退期。

1.原代培養(yǎng)：從體內(nèi)取出細胞接種后到第一次傳代。一般維持1－4周。

2.傳代期：原代細胞一經(jīng)傳代就成為細胞系（cellline），進入傳代期。持續(xù)時間最長.

一般傳10－50代(Hayflick極限)。

3.衰退期：細胞增殖緩慢、停止至死亡。

腫瘤細胞：無限細胞系，永久增殖第二十六頁，共102頁。LifespanPhase衰退期培養(yǎng)細胞的整個生命期傳代期，每代細胞的增殖時相一代第二十七頁，共102頁。Hayflick極限*體外培養(yǎng)細胞的增殖能力不是無限的，傳代次數(shù)有一定的界限。*傳代次數(shù)與物種壽命有關(guān)：小鼠壽命3年，傳代12次；龜壽命200年，傳代140次。*傳代次數(shù)與個體年齡成反比：人胚胎，40-60代；幼年，20-40代；成年，10-30代；早老病兒童，2-10代。

第二十八頁，共102頁。Hayflick極限提示的意義細胞不是不死的，細胞會由于內(nèi)在的因素出現(xiàn)增殖衰退而衰老死亡。衰老機制的研究：“衰老鐘”等增殖和衰老的秘密第二十九頁，共102頁。細胞培養(yǎng)四大要素1.Aseptictechniques；2.Facilities；3.Reagentsandsupplies；4.Cells.第三十頁，共102頁。二、細胞培養(yǎng)的基本技術(shù)1、細胞分離和原代培養(yǎng)2、培養(yǎng)細胞的傳代3、細胞計數(shù)4、細胞觀察5、細胞的凍存、復蘇和運輸6、污染的檢測和對策第三十一頁，共102頁。細胞培養(yǎng)的基本技術(shù)1、細胞分離和原代培養(yǎng)2、觀察3、傳代4、污染的檢測和對策5、凍存、復蘇6、計數(shù)常規(guī)維持實驗前準備第三十二頁，共102頁。1.細胞分離細胞懸液：離心收集組織塊：

1.機械分散

2.剪切分離

3.消化分離

胰蛋白酶法 膠原酶法第三十三頁，共102頁。2.細胞傳代（subculture)消化傳代過程當細胞在培養(yǎng)容器中增殖到一定密度，生存空間及營養(yǎng)物質(zhì)缺乏，需按一定比例分離，接種至新的培養(yǎng)容器并更新培養(yǎng)液，這個過程稱為細胞傳代。第三十四頁，共102頁。腫瘤細胞株的傳代消化液的濃度和使用時間、細胞傳代的頻率和總的次數(shù)懸浮細胞的傳代：離心或更新培養(yǎng)液貼壁細胞的傳代：消化（0.25%胰酶+0.66mMEDTA)PassageNumberEffectsInCellLinesWhytheyhappenandwhatyoucandoaboutit?ATCCTechnicalBulletinno.7注意：腫瘤細胞的傳代次數(shù)第三十五頁，共102頁。應用計數(shù)板或活力檢測儀3.細胞計數(shù)（Counting)細胞活力檢測（0.4%trypanblue拒染）第三十六頁，共102頁。4.細胞觀察

(Observation)培養(yǎng)液*顏色*透明度細胞*生長概況*細胞形態(tài)變化微生物污染第三十七頁，共102頁。

5.細胞凍存（Cryopreservation)目的：1.保存細胞株

2.保持盡量少的傳代次數(shù)和較均一的細胞狀態(tài)方法：低溫保存法（Cryogenicstorage)：-130℃裝置：液氮罐（liquidnitrogenfreezer）

第三十八頁，共102頁。

在不加保護條件下直接凍存細胞時，細胞內(nèi)和外環(huán)境中的水會形成結(jié)晶，影響細胞功能甚至死亡，凍存失敗。

*培養(yǎng)基中加入保護劑:甘油或二甲基亞砜（DMSO）；*緩慢地凍結(jié)；*貯存在－130℃以下低溫。減少細胞內(nèi)水分，減少細胞內(nèi)冰晶形成低溫保存原理LiquidphaseVaporphaseCryopreservation_Technical_Manual.pdf第三十九頁，共102頁。細胞復蘇(Thawing,Reconstitution)將凍存于液氮中的凍存管取出，迅速放入37～40℃水浴1min內(nèi)融化，去除凍存保護液，更換正常培養(yǎng)基

“慢凍速融”胞外結(jié)晶很快融化，減少水分滲入細胞第四十頁，共102頁。6.細胞污染的防治微生物（常見）：細菌、真菌、化學物質(zhì)：DMSO、EDTA等細胞交叉污染污染的種類

支原體第四十一頁，共102頁。微生物污染的途徑

空氣器材操作血清組織樣本第四十二頁，共102頁。微生物污染對細胞的影響致死、增殖減慢、基因轉(zhuǎn)錄改變、功能改變微生物污染的檢測培養(yǎng)基顏色、性狀；細胞形態(tài)、功能；支原體的檢測微生物污染的防治

抗生素、加溫等以預防為主，一旦感染較難救治第四十三頁，共102頁。三.常見問題1.支原體污染2.細胞認證（authentication)3.遺傳背景（genetic)第四十四頁，共102頁。1.支原體感染細胞救治抗生素：四環(huán)素大環(huán)內(nèi)酯類喹諾酮類第四十五頁，共102頁。常用支原體感染救治第四十六頁，共102頁。Reputablecellsuppliers：1.AmericanTissueTypeCollection(ATCC)2.GermanCollectionofMicroorganismsandCellCulture(DSMZ)3.中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫（中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心）2.細胞株來源：認證細胞的獲得第四十七頁，共102頁。p53，Ras等癌基因、抑癌基因的狀態(tài)：缺失、突變或野生；2.人種、年齡等3.病史等等，如病毒感染史3.遺傳背景第四十八頁，共102頁。成功的細胞培養(yǎng)：1.Well-established,properlyequipedcellculturefacility;2.Practiceofsteriletechniques;3.Appropriate,qualitycontrolledreagentsandsupplies;4.Theknowledgeandpracticeofthefundamentaltechniquesinvolvedinthegrowthofthecelltypeofinterest.總結(jié)Highstandardsincellculture第四十九頁，共102頁。細胞培養(yǎng)和離心技術(shù)第五十頁，共102頁。細胞結(jié)構(gòu)成分分離的離心技術(shù)離心技術(shù)原理離心設備離心方法細胞結(jié)構(gòu)成分的分離（略）Subcellularfractionation第五十一頁，共102頁。一.離心技術(shù)原理（Centrifuge)利用溶液中顆粒密度、大小等特性，用旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生的離心力使不同特性顆粒從溶液中分離并沉降，從而達到分離、濃縮、提純和鑒定的目的，稱為離心技術(shù)。*分離細胞或其他的懸浮顆粒，從混有多種細胞的懸液中分離某一細胞；*從組織或細胞勻漿中分離細胞器，包括細胞核、線粒體、高爾基體、溶酶體、過氧化物酶體、質(zhì)膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等；*分離病毒和大分子，包括DNA、RNA、蛋白質(zhì)和脂類。第五十二頁，共102頁。什么是離心力？勻速圓周運動的物體，在合外力消失或不足以維持向心力時，產(chǎn)生的背向旋轉(zhuǎn)軸的運動力。第五十三頁，共102頁。3個因素：沉降系數(shù)相對離心力離心時間設備：離心機、離心介質(zhì)溶液（細胞結(jié)構(gòu)成分）：顆粒溶液、大小、密度特性第五十四頁，共102頁。1.沉降系數(shù)（S）：重要指標

顆粒在單位離心力的作用下的移動速度

dx/dtw2xdx:顆粒與轉(zhuǎn)軸中心的距離dt：顆粒沉降所需時間W:角速度X:轉(zhuǎn)子半徑s(秒）=2r2(p-

m)=9r:顆粒直徑p

:顆粒密度m

:溶液介質(zhì)密度：溶液介質(zhì)粘度1S=1×10-13s第五十五頁，共102頁。決定沉降速度的因素：與顆粒大小有關(guān)；與顆粒密度有關(guān)；與溶液介質(zhì)密度和粘度有關(guān)。沉降系數(shù)密度第五十六頁，共102頁。離心分離時，作用在懸浮顆粒上的力常用RCF數(shù)值表示，即同一顆粒在離心時的離心力同地球重力相比較后得到的值。RCF(g)=離心力/重力＝mw2x/mg=w2x/g=1.12r(RPM/1000)2r:

旋轉(zhuǎn)中心軸至轉(zhuǎn)頭內(nèi)離心管某一部位的半徑

RPM（roundsperminute，轉(zhuǎn)速):

轉(zhuǎn)頭每分鐘旋轉(zhuǎn)的次數(shù)RCF與轉(zhuǎn)速及旋轉(zhuǎn)半徑正相關(guān)2.相對離心力（RCF）：重要指標第五十七頁，共102頁。性能指標：(1)離心力：能達到的RCF；(2)離心效力：K因子：k值越小，離心時間越短，轉(zhuǎn)頭的效力越高。離心機轉(zhuǎn)頭:離心技術(shù)的核心決定離心力第五十八頁，共102頁。3.離心時間

顆粒經(jīng)過溶液形成沉淀所需要的時間

t=K/SK:表示轉(zhuǎn)頭離心效力的指標，與轉(zhuǎn)速平方成反比。

離心機公司提供最高轉(zhuǎn)速時的K值。

K值越小越好，效力越高。

S：沉降系數(shù)離心時間由離心效力和沉降系數(shù)決定第五十九頁，共102頁。RCF1×t1=RCF2×t2沉降離心中的兩個因素RCF,t例：沉降某顆粒需10000g.min10000g1min2000g5min第六十頁，共102頁。顆粒的沉降系數(shù)加在顆粒上的相對離心力離心時間離心分離首先需要知道的3要素第六十一頁，共102頁。二.離心設備：離心機及離心管4.溫度控制（冷卻設備）1.轉(zhuǎn)頭（馬達）3.離心腔（真空設備）2.控制系統(tǒng)第六十二頁，共102頁。離心機分類制備型、分析型；常溫、低溫；臺式、立式；低速、高速、超速低速：6800g(細胞級）分離>10000S的細胞及細胞器如：Beckman公司的J6，GS-6高速：17,700－50,400g（亞細胞級）分離>100S的顆粒，包括部分細胞器及病毒,

如：Beckman公司的J2超速：90,400－694,000g（分子級）離<100S的顆粒,如：Beckman公司的L,XL第六十三頁，共102頁。OptimaTML-XP（BeckmanCoulter)制備型超速離心機MaxRPM

100000MaxForce(xg)

802400第六十四頁，共102頁。性能指標：(1)離心力：能達到的RCF；(2)離心效力：K因子：k值越小，離心時間越短，轉(zhuǎn)頭的效力越高。1.離心機轉(zhuǎn)頭:離心技術(shù)的核心第六十五頁，共102頁。轉(zhuǎn)頭類別：轉(zhuǎn)頭與旋轉(zhuǎn)軸的角度垂直轉(zhuǎn)頭verticalrotor近垂直轉(zhuǎn)頭<10°水平轉(zhuǎn)頭swing-outrotor90°0°固定角轉(zhuǎn)頭fixed-anglerotor24°沉淀的位置和沉淀形成的時間不同，決定得率和純度第六十六頁，共102頁。短垂直轉(zhuǎn)頭近垂直轉(zhuǎn)頭固定角轉(zhuǎn)頭水平轉(zhuǎn)頭分離純度分離時間低高長第六十七頁，共102頁。Beckman公司轉(zhuǎn)頭的標記SW:水平轉(zhuǎn)頭,如SW50.1；V：垂直轉(zhuǎn)頭,如VTi80；NVT:近垂直轉(zhuǎn)頭；Type:固定角轉(zhuǎn)頭,如Type80TiJA:使用在J系列的固定角轉(zhuǎn)頭，如JA.2JS:使用在J系列的水平轉(zhuǎn)頭，如數(shù)字：最高安全轉(zhuǎn)速（×1000）；Ti:鈦合金，未標記為鋁合金第六十八頁，共102頁。

金屬疲勞

轉(zhuǎn)子內(nèi)部的應力改變導致裂紋注意：安全系數(shù)>2；鈦合金；轉(zhuǎn)頭壽命超速

測速盤（超速花盤）化學腐蝕

離心管破裂、樣品滲漏

轉(zhuǎn)頭不平衡離心管平衡誤差0.01g；離心管放置不對稱；水平轉(zhuǎn)頭吊桶蓋安裝不當；轉(zhuǎn)頭不加蓋；“O“形密封圈失效離心管帽、墊圈、接合器使用不當轉(zhuǎn)頭損壞及原因第六十九頁，共102頁。三.離心方法1.差速離心法

離心介質(zhì)無密度梯度2.

沉降速度離心，又稱移動區(qū)帶離心

沉降平衡離心，又稱等密度梯度離心密度梯度離心法根據(jù)顆粒大?。?、2根據(jù)顆粒密度：3根據(jù)離心介質(zhì)有無梯度：離心介質(zhì)有密度梯度第七十頁，共102頁。1.差速離心法（Differentialcentrifugation)原理：通過一系列遞增速度的離心，依次將大小不同的顆粒逐級分離。大小顆?；旌衔镒畲箢w粒較大顆粒中等顆粒小顆粒上清上清上清上清第七十一頁，共102頁。用途：分離大小相差懸殊的細胞和細胞結(jié)構(gòu)成分。第七十二頁，共102頁。特點：

介質(zhì)密度均一；速度由低向高，逐級離心；

操作簡單；

分離純度不高。第七十三頁，共102頁。密度梯度離心法離心介質(zhì)有密度梯度s=2r2(p-

m)9第七十四頁，共102頁。

形成的溶液密度范圍大粘度低對細胞成分損傷小離心分離后容易去除濃度容易測定便宜理想的離心介質(zhì)可自行配制的：蔗糖、商品化的：Ficoll,Percoll,Accudenz(Nycodenz),Metrizoate第七十五頁，共102頁。2.移動區(qū)帶離心法（moving-zonecentrifugation)原理：用梯度蔗糖或甘油作為介質(zhì)，將要分離的樣品放在介質(zhì)表面，形成一個狹帶，然后超速離心，使不同大小的顆粒以不同的速度向管底方向移動，形成一系列區(qū)帶，從管底小孔中分次收集各種顆粒成分。介質(zhì)密度逐漸增高s=2r2(p-

m)9第七十六頁，共102頁。用途：分離密度相近而大小不等的細胞或細胞器。分離效果只與顆粒大小有關(guān)，與密度無關(guān)。特點：

密度梯度介質(zhì)，且密度較低，介質(zhì)的最大密度應小于被分離生物顆粒的最小密度(p>

m

)。離心時間(t)，不能使所有顆粒都沉到管底。s=2r2(p-

m)9第七十七頁，共102頁。3.等密度梯度離心法（isodensitycentrifugation)原理：離心時采用包括各種顆粒密度范圍的梯度介質(zhì)，被分離顆粒達到與其相同的密度介質(zhì)時不再移動，形成一系列區(qū)帶，然后從管底收集。s=2r2(p-

m)9第七十八頁，共102頁。用途：分離密度不等的顆粒,適用于病毒、DNA、RNA、蛋白質(zhì)等，效果只與顆粒密度有關(guān)，與大小無關(guān)。特點：

密度較高介質(zhì)，陡度大，介質(zhì)的最高密度應大于被分離組分的最大密度(

p<m

)

。所需的力場通常比速率沉降法大10~100倍，往往需要高速或超速離心。第七十九頁，共102頁。細胞結(jié)構(gòu)成分分離的離心技術(shù)離心技術(shù)原理離心設備離心方法細胞結(jié)構(gòu)成分的分離第八十頁，共102頁。1938Behrensnucleiandcytoplasmfromlivercells(differentialcentrifugation)1951Brakkeplantvirus(density-gradientcentrifugation)DeDuvelysosomes,peroxisomesMeselson,Stahl,Vinogradseparatingnucleicacid(equilibriumdensitygradientcentrifugationincesiumchloridesolutions)1984RothmanreconstituteGolgivesicletraffickinginvitro離心技術(shù)發(fā)展和細胞器分離第八十一頁，共102頁。From“Currentprotocolsincellbiology”

第八十二頁，共102頁。四.細胞結(jié)構(gòu)成分的分離細胞沉淀細胞破碎細胞結(jié)構(gòu)成分的分離－離心技術(shù)4.分離細胞器的鑒定和評價5.舉例：線粒體分離、細胞核分離(略）第八十三頁，共102頁。1.介質(zhì)密度為1g/ml;2.一般細菌和動物細胞密度為1.08-1.12g/ml,

病毒密度為1.18-1.31g/ml。3.相對離心力(g)和離心時間（min)決定沉降

材料大小(m)

離心條件(離心力，離心時間）動物細胞10-60200-500g5-15min人紅細胞6-8500g5-15min細菌1-10500-6000g10-15min病毒0.02-0.0330000-40000g20-30min1.細胞沉淀（cellpellet)第八十四頁，共102頁。2.細胞破碎*滲透壓沖擊*超聲波振蕩*機械力研磨或剪切*反復凍融原則：只需破碎細胞膜，保留完整細胞器第八十五頁，共102頁。3.細胞結(jié)構(gòu)成分的分步分離一系列的差速離心＋密度梯度離心差速離心：分離細胞器梯度離心：純化細胞器第八十六頁，共102頁。沉淀RCF×時間內(nèi)容物P11000g*10min細胞核、重線粒體、大片細胞膜P23000g*10min重線粒體、細胞膜碎片P36000g*10min線粒體、溶酶體、過氧化物酶體、完整高爾基體P410，000g*10min

線粒體、溶酶體、過氧化物酶體、高爾基膜P520，000g*10min溶酶體、過氧化物酶體、高爾基膜、大的高密度小泡P6100，000g*10min

細胞膜、高爾基體、內(nèi)體等差速離心形成的沉淀（肝臟）差速離心第八十七頁，共102頁。差速離心需要的設備離心機：低速、高速、超高速轉(zhuǎn)頭：固定角、垂直或水平介質(zhì)：蔗糖第八十八頁，共102頁。密度梯度離心梯度離心需要的設備離心機：低速、高速、超高速轉(zhuǎn)頭：水平、固定角、垂直介質(zhì)：蔗糖、Ficoll,Percoll,Accudenz(Nycodenz),Metrizoate

介質(zhì)的梯度形成裝置和收集裝置第八十九頁，共102頁。4.離心方法的選擇勻漿物中各類細胞器大小不同：

差速離心上清中各類細胞器大小有差別：

速率區(qū)帶離心上清中各類細胞器密度有差別：

等密度離心根據(jù)分離細胞器的性質(zhì)：第九十頁，共102頁。根據(jù)研究目的：分析分離：差速離心（時間短；介質(zhì)濃度低，對細胞結(jié)構(gòu)成分損傷?。┲苽浞蛛x：密度梯度離心（時間長，純度高）4.離心方法的選擇第九十一頁，共102頁。5.分離細胞器的鑒定和評價（1）形態(tài)鑒定：光鏡或電鏡（2）生化分析：細胞器特異的標志酶第九十二頁，共102頁。(2)生化分析：細胞器特異的標志酶細胞器標志酶細胞核NAD合成酶、DNA聚合酶線粒體細胞色素氧化酶、琥珀酸脫氫酶、單胺氧化酶溶酶體酸性磷酸酶、－半乳糖苷酶過氧化物酶體過氧化氫酶、尿酸氧化酶內(nèi)質(zhì)網(wǎng)葡萄糖-6-磷酸酶、細胞色素P450高爾基體－半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶細胞膜5’-核苷酸酶、Na/K-ATP酶第九十三頁，共102頁。6.舉例:細胞核分離原理：細胞核特征：體積大，沉降系數(shù)大；密度高，可通過濃蔗糖，分離容易。分離設計：

細胞破碎（機械勻漿，滲透溶脹，表面活性劑），釋放細胞核，光鏡鑒定釋放效果。

離心，光鏡鑒定分離效果第九十四頁，共102頁。從組織中制備細胞核細胞破碎：裂解緩沖液：0.25M蔗糖，

10mMTris-HClpH7.4,10mMNaCl（低滲）,3mMMgCl2,1mMDTT,0.5mMPMSF。

組織研磨器；

肝臟組織切成1cm3小塊，裝入緩沖液中，倒入研磨器離心：濃蔗糖溶液：2M蔗糖

組織勻漿產(chǎn)物和濃蔗糖溶液等體積混合

23000g，30m