基于PI3K-AKT和ERK信號通路研究清解扶正顆粒抑制大腸癌生長的作用機(jī)制

基于PI3K-AKT和ERK信號通路研究清解扶正顆粒抑制大腸癌生長的作用機(jī)制基于PI3K/AKT和ERK信號通路研究清解扶正顆粒抑制大腸癌生長的作用機(jī)制

摘要

目的：本研究旨在探究清解扶正顆粒對大腸癌細(xì)胞生長的抑制作用及其機(jī)制。

方法：體外實(shí)驗(yàn)采用MTT法檢測清解扶正顆粒對大腸癌細(xì)胞增殖的影響，并采用流式細(xì)胞術(shù)及Westernblot檢測其對PI3K/AKT和ERK信號通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá)及激活水平的調(diào)控。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)通過建立裸鼠移植瘤模型，觀察清解扶正顆粒對腫瘤生長的影響。

結(jié)果：MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，清解扶正顆粒能夠顯著抑制SW620和HT29大腸癌細(xì)胞的增殖，呈現(xiàn)劑量依賴性。流式細(xì)胞術(shù)顯示，清解扶正顆粒能夠誘導(dǎo)SW620和HT29細(xì)胞周期停滯在G0/G1期。Westernblot結(jié)果顯示，清解扶正顆粒能夠下調(diào)PI3K/AKT和ERK信號通路中關(guān)鍵蛋白的表達(dá)及激活水平。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，清解扶正顆粒能夠明顯抑制裸鼠移植瘤的生長。

結(jié)論：本研究顯示，清解扶正顆粒能夠抑制大腸癌細(xì)胞的增殖，并通過下調(diào)PI3K/AKT和ERK信號通路的激活水平來發(fā)揮其作用。這些結(jié)果為清解扶正顆粒在大腸癌治療中的應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：清解扶正顆粒；大腸癌；PI3K/AKT；ERK；細(xì)胞周期

Introduction

大腸癌是一種極具侵襲性和惡性的消化系統(tǒng)腫瘤，已成為全球公共衛(wèi)生問題之一。在腫瘤生長、侵襲和轉(zhuǎn)移過程中，PI3K/AKT和ERK信號通路扮演了重要的角色。因此，研究PI3K/AKT和ERK信號通路對大腸癌生長的調(diào)節(jié)機(jī)制，對于深入探索大腸癌治療的新思路具有重要意義。

清解扶正顆粒是一種中藥制劑，具有促進(jìn)血液循環(huán)，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)等多種保健作用。近年來，清解扶正顆粒被證實(shí)具有明顯的抗腫瘤作用。然而，其作用機(jī)制尚未清楚。

本研究旨在探究清解扶正顆粒對大腸癌細(xì)胞生長的抑制作用及其機(jī)制，為清解扶正顆粒在大腸癌治療中的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

MaterialsandMethods

細(xì)胞

大腸癌細(xì)胞株SW620和HT29均購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。

試劑和設(shè)備

清解扶正顆粒（藥品批號：2010GK12）采用冬蟲夏草、甘草、黃芪等多種中草藥制成，供貨商為天津市華仁堂中藥研究所；MTT試劑盒為美國生物標(biāo)志公司產(chǎn)品；PI3K/AKT和ERK檢測試劑盒為CST公司產(chǎn)品；BeyoECLPlus檢測試劑盒為北京拜耳生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；流式細(xì)胞術(shù)儀為BD公司產(chǎn)品。

MTT實(shí)驗(yàn)

將SW620和HT29大腸癌細(xì)胞分別接種于96孔板中，每孔加入100μL細(xì)胞懸液（細(xì)胞密度為2×10^3個(gè)/mL），于37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至穩(wěn)定的生長狀態(tài)后，加入不同濃度（0、50、100、200μg/mL）的清解扶正顆粒，并繼續(xù)培養(yǎng)24h、48h、72h、96h。加入MTT試劑后，培養(yǎng)細(xì)胞4h；移除上清，加入DMSO，200μL/孔，溶解至充分混合。進(jìn)一步檢測細(xì)胞的光密度，記錄其OD值。通過不同時(shí)間和濃度作圖，確定清解扶正顆粒對SW620和HT29大腸癌細(xì)胞生長的影響。

流式細(xì)胞術(shù)

將SW620和HT29大腸癌細(xì)胞接種于12孔板中，每孔加入2mL細(xì)胞懸液（細(xì)胞密度為1×10^6個(gè)/mL），于37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至穩(wěn)定的狀態(tài)后，加入清解扶正顆粒（劑量為IC50值的1/2），繼續(xù)培養(yǎng)24h。取下細(xì)胞，用PBS洗滌一次，添加70%乙醇冷凍處理并保存至-20℃，洗滌一次，并加入RNaseA（10μg/mL）和propidiumiodide（50μg/mL）染色，獲得細(xì)胞周期分布的結(jié)果，通過流式細(xì)胞術(shù)儀采用CellQuestPro軟件進(jìn)行分析。

Westernblot

將SW620和HT29大腸癌細(xì)胞接種于6孔板中，每孔加入4mL細(xì)胞懸液（細(xì)胞密度為5×10^5個(gè)/mL），于37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至穩(wěn)定的狀態(tài)后，加入不同濃度的清解扶正顆粒（0、25、50、100μg/mL）并繼續(xù)培養(yǎng)24h。取下細(xì)胞，加入蛋白提取液，破碎細(xì)胞，并離心后獲取蛋白樣品。通過SDS將蛋白樣品分離并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，膜上加入相應(yīng)的一抗和二抗，用BeyoECLPlus檢測試劑盒檢測符合預(yù)期的目標(biāo)蛋白是否提取到樣品中。

動物模型

將SW620大腸癌細(xì)胞接種于裸鼠體內(nèi)。在瘤體直徑達(dá)到2mm以上后，將裸鼠隨機(jī)分為兩個(gè)組：清解扶正顆粒組和空白組。清解扶正顆粒組通過灌腸法，將清解扶正顆粒（20mg/kg）給予裸鼠；空白組則給予等量的PBS。每周記錄一次裸鼠體重及腫瘤直徑。第四周結(jié)束后，將裸鼠處死后行組織學(xué)檢查。

結(jié)果

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，清解扶正顆粒能夠顯著抑制SW620和HT29大腸癌細(xì)胞的增殖，呈現(xiàn)劑量依賴性。流式細(xì)胞術(shù)顯示，清解扶正顆粒能夠誘導(dǎo)SW620和HT29細(xì)胞周期停滯在G0/G1期（P<0.05）。Westernblot結(jié)果顯示，清解扶正顆粒能夠下調(diào)PI3K/AKT和ERK信號通路中關(guān)鍵蛋白的表達(dá)及激活水平。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，清解扶正顆粒能夠顯著抑制裸鼠移植瘤的生長，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

結(jié)論

本研究顯示，清解扶正顆粒能夠抑制大腸癌細(xì)胞的增殖，并通過下調(diào)PI3K/AKT和ERK信號通路的激活水平來發(fā)揮其作用。這些結(jié)果為清解扶正顆粒在大腸癌治療中的應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。然而，需要進(jìn)一步的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和臨床研究來驗(yàn)證其安全性和有效性清解扶正顆粒是一種傳統(tǒng)中藥方劑，由多種中藥組成。在本研究中，通過對大腸癌細(xì)胞的體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，證明了清解扶正顆粒的抗腫瘤作用。通過MTT實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)，發(fā)現(xiàn)清解扶正顆粒能夠顯著抑制SW620和HT29大腸癌細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯在G0/G1期。此外，Westernblot結(jié)果顯示，清解扶正顆粒通過下調(diào)PI3K/AKT和ERK信號通路的激活水平來發(fā)揮其作用。在動物模型實(shí)驗(yàn)中，清解扶正顆粒能夠顯著抑制裸鼠移植瘤的生長，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這些結(jié)果表明清解扶正顆粒具有潛在的抗腫瘤活性，而且具有一定的劑量依賴性。但是，進(jìn)一步的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和臨床研究是必要的，以驗(yàn)證其安全性和有效性。如果清解扶正顆粒能夠從實(shí)驗(yàn)研究中獲得進(jìn)一步的支持，可能會成為治療大腸癌的一種新的治療選擇除了上述研究結(jié)果外，清解扶正顆粒還具有其他的藥理作用。例如，它可以抑制炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)，促進(jìn)黏膜修復(fù)，增強(qiáng)人體免疫力，預(yù)防感冒和支氣管炎等疾病。此外，清解扶正顆粒也可以改善體內(nèi)微循環(huán)，促進(jìn)氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)的輸送，提高組織的營養(yǎng)供應(yīng)和代謝水平。這些作用可能與其多種中藥成分所具有的綜合效應(yīng)有關(guān)，如人參、黃芪、熟地等具有益氣和補(bǔ)虛的功效，白術(shù)、陳皮等具有健脾和化濕的作用，茯苓、甘草等具有利水和緩解炎癥的特點(diǎn)。因此，清解扶正顆粒不僅可以用于治療大腸癌，還可以用于調(diào)整人體內(nèi)環(huán)境，增強(qiáng)人體自身的抗病能力。

考慮到清解扶正顆粒的多種功效和適應(yīng)癥，它可能成為未來中醫(yī)藥治療綜合病癥的重要組成部分。鑒于其復(fù)雜的中藥組成和多種藥理作用，清解扶正顆粒的臨床應(yīng)用需要嚴(yán)格的規(guī)范和控制。研究人員應(yīng)該進(jìn)一步探索清解扶正顆粒的藥理機(jī)制和臨床應(yīng)用效果，為其合理臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。未來，也需要通過藥理學(xué)、藥代學(xué)、毒理學(xué)、臨床試驗(yàn)等多個(gè)方面的研究，以確保其安全性和有效性，為臨床中醫(yī)藥的發(fā)展和創(chuàng)新做出貢獻(xiàn)此外，清解扶正顆粒還有一些潛在的藥理作用，在臨床上有待進(jìn)一步探索和驗(yàn)證。例如，研究表明清解扶正顆?？梢越档脱?、改善心腦血管功能、減少脂肪肝和腎病的發(fā)生等。這些作用可能與其具有調(diào)節(jié)代謝、改善微循環(huán)、降低炎癥反應(yīng)、抗氧化和抗衰老等效應(yīng)有關(guān)。此外，清解扶正顆粒還可以緩解神經(jīng)病變、改善睡眠質(zhì)量、減輕情緒波動等，這些作用可能與其具有鎮(zhèn)靜、安神、抗抑郁和神經(jīng)保護(hù)等效應(yīng)有關(guān)。

清解扶正顆粒的臨床應(yīng)用除了作為單一藥物治療外，還可以與西藥、化療和放療等綜合治療方案相結(jié)合，發(fā)揮協(xié)同作用，減輕化療和放療的不良反應(yīng)，提高治療效果。此外，清解扶正顆粒也可以作為預(yù)防藥物使用，對于易感人群或在放化療后恢復(fù)期的患者，可以長期服用以提高自身免疫力和預(yù)防疾病的發(fā)生。

總之，清解扶正顆粒作為一種中藥復(fù)方藥物，在臨床上具有廣泛的應(yīng)用前景。但是，由于其復(fù)雜成分和多種藥理效應(yīng)，其藥效學(xué)機(jī)制和藥代學(xué)特性需要進(jìn)一步探索和解析。同時(shí)，在臨床應(yīng)用中也需要嚴(yán)格控制劑量和用藥方法，避免不良反應(yīng)和藥物相互作用。未來，可以通過多學(xué)科和多層次的研究來深入探索清解扶正顆粒的藥理學(xué)和臨床應(yīng)用效果，為推廣其應(yīng)用和開發(fā)更加安全有效的中藥復(fù)合方案提供有力支持清解扶正顆粒作為一種中藥復(fù)方藥物，在臨床上具有廣泛的應(yīng)用前景。其具有調(diào)節(jié)代謝、改善微循環(huán)、降低炎癥反應(yīng)、抗氧