園藝植物生物技術(shù)第八章

園藝植物生物技術(shù)第八章第1頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四§8.1Geneticmarker（遺傳標(biāo)記）第2頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四Geneticmarker（遺傳標(biāo)記）canbeclearlyreflectthecharacteristicsofgeneticpolymorphisms.(是指可以明確反映遺傳多態(tài)性的生物特征)Geneticpolymorphisms(遺傳多態(tài)性):Thevariationofalleleinclassicgenetics.(經(jīng)典遺傳學(xué)中，指等位基因的變異。)Therelativedifferencebetweenanysiteinthegenomeinmoderngentics.(現(xiàn)代遺傳學(xué)中，遺傳多態(tài)性是指基因組中任何座位上的相對(duì)差異。)8.1.1Concept第3頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四8.1.2Geneticmarkerlevels(遺傳標(biāo)記的類型)Morphologicalmarker（形態(tài)標(biāo)記）Cytologicalmarker(細(xì)胞學(xué)標(biāo)記)Biochemicalmarker(生化標(biāo)記)Molecularmarker(分子標(biāo)記)第4頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四（1）Morphologicalmarker(形態(tài)標(biāo)記

)Referstothosecanclearlyshowthegeneticpolymorphismsoftheappearance.(指那些能夠明確顯示遺傳多態(tài)性的外觀性狀)Forexample:therelativediferenceofflowercolor,plantheight,fruitshap,andsoon.廣義的形態(tài)標(biāo)記還包括那些借助簡(jiǎn)單測(cè)試即可識(shí)別的某些性狀如生理特性、生殖特性、抗病蟲性等。第5頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四第6頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四Advantage：Simpleandintuitive,economicandconvenient(簡(jiǎn)單直觀、經(jīng)濟(jì)方便等)。Disadvantage：Quantityislimited,lesspolymorphism.(在多數(shù)植物中數(shù)量是很有限，多態(tài)性較少)；Affectedbyenvirmentanddevelopment.易受環(huán)境、生育期等因素的影響；linkagewithbadgenessometims.(有一些標(biāo)記與不良性狀的基因連鎖)longerperiod.(周期比較長(zhǎng))。Morphologicalmarker第7頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四（2）Cytologicalmarkers

細(xì)胞學(xué)標(biāo)記細(xì)胞學(xué)標(biāo)記是指能明確顯示遺傳多態(tài)性的細(xì)胞學(xué)特征。Structurecharacteristicsofchromosomes(染色體的結(jié)構(gòu)特征)Quantitycharacteristicsofchromosomes(染色體的數(shù)量特征)第8頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四Structurecharacteristicsincludesvariationchromosomekaryotype(核型）andchromosomebandingpattern（C-band、N-band、G-band）.Quantitycharacteristicsincludestheeuploid(整倍體)andaneuploid(非整倍體).第9頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四Advantage:itcanbeusedtomapsomeimportantgenesonchromosomes(能進(jìn)行一些重要基因的染色體定位)。Disadvantage:Timeconsuminganddifficult.(標(biāo)記材料需花費(fèi)較多人力和較長(zhǎng)的時(shí)間來培育，難度很大)Limited.(某些植物物種對(duì)染色體變異反應(yīng)敏感)Somevariationcannotbedetected.(還有些變異難以用細(xì)胞學(xué)方法進(jìn)行檢測(cè))Cytologicalmarkers第10頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四（3）Biochemicalmarkers生化標(biāo)記Includesisozyme(同工酶)andequipotentialenzymes(等位酶).Isozyme(同工酶)是指由一個(gè)以上基因座位編碼的酶的不同形式.譬如過氧化物酶、超氧化物歧化酶、多酚氧化酶、蘋果酸脫氫酶等.Equipotentialenzymes(等位酶)是指由一個(gè)基因座位的不同等位基因編碼的酶的不同分子形式。第11頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四第12頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四Advantages：Nearlyneutral(近中性)geneticmarkers，對(duì)植物經(jīng)濟(jì)性狀一般沒有大的不良影響；Directlyreflectsthedifferencesamonggeneproducts，lessaffectedbytheenvironment.Disadvantages：limited/目前可使用的標(biāo)記數(shù)量相當(dāng)有限；Someenzymestainingmethodandelectrophoreticseparationtechnologyhavethecertaindifficulty.有些酶的染色方法和電泳分離技術(shù)有一定難度。Biochemicalmarkers第13頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四(4)Molecularmarker(分子標(biāo)記)AmolecularmarkerisaDNAsequencethatisreadilydetectedandwhoseinheritancecaneasilydetectedandwhoseinheritancecaneasilybemonitored.TheuseofmolecularmarkersisbasedonnaturallyoccurringDNApolymorphism.第14頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四第15頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四§8.2DNA

MolecularMarker第16頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四DNAmarker是指能反映生物個(gè)體或種群間基因組中某種差異特征的DNA片段，是DNA水平上遺傳多態(tài)性的直接反映。第17頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四In1974，GrozdickerfirstdevelopedDNAmolecularmarkersthatis

Restrictionfragmentlengthpolymorphism(RFLP,限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性）.ItisthefirstgenerationofDNAmarkerswhichwasusedbyBostseinforconstructionofmankindlinkagemapin1980.In1982，Simplesequencerepeats（SSR,簡(jiǎn)單序列重復(fù))wasdevelopedbyHamade.ItisthesecondgenerationofDNAmarkers。In1990，WilliamandWelshdevelopedRandomamplifiedpolymorphicDNA(RAPD,隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA).8.2.1HistoryofDNAmarkers第18頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四In1991,AdamsdevelopedExpressedsequencetags(EST,表達(dá)序列標(biāo)簽標(biāo)記)一種相對(duì)簡(jiǎn)便和快速鑒定大批基因表達(dá)的技術(shù)。In1993，ZabeauandVosinventedtheAmplifiedfragmentlengthpolymorphism

(AFLP,擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性標(biāo)記).In1994，ZietkiewiczdevelopedInter-simplesequencerepeat(ISSR,簡(jiǎn)單重復(fù)間序列標(biāo)記)。In1995，VelculescudevelopedSerialanalysisofgeneexpression(SAGE,基因表達(dá)系列分析技術(shù))。第19頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四In1998，Singlenucleotidepolymorphisms(SNP,單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記)wasproducedinIntheprocessofhumangenomeproject(人類基因組計(jì)劃).Itwasthethirdgenerationofmolecularmarkers.In2001,LiandQuirosdevelopedsequence-relatedamplificationpolymorphism(SRAP,相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性標(biāo)記)attheuniversityofCaliforniainUnitedStates.In

2003，美國農(nóng)業(yè)部北方作物科學(xué)實(shí)驗(yàn)室HuandVickputforwardTargetedregionalamplificationpolymorphism(TRAP,靶位區(qū)域擴(kuò)增多態(tài)性).目前，DNA分子標(biāo)記已經(jīng)發(fā)展到幾十種。第20頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四8.2.2ThecharacteristicsofDNAmarkers1.直接以DNA的形式表現(xiàn)，在生物體的各個(gè)組織、各個(gè)發(fā)育階段均可檢測(cè)到，不受季節(jié)、環(huán)境限制，不存在表達(dá)與否問題；2.數(shù)量極多，遍布整個(gè)基因組，可檢測(cè)的基因座位幾乎是無限的；3.多態(tài)性高，自然界存在許多等位變異，無需人為創(chuàng)造；4.表現(xiàn)為中性，不影響目標(biāo)性狀的表達(dá)；5.許多標(biāo)記表現(xiàn)為共顯性的特點(diǎn)，能區(qū)別純合體和雜合體。第21頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四Theidealmolecularmarkersrequire:1.Highpolymophism(遺傳多態(tài)性高)；2.Co-dominant(共顯性遺傳)，信息完整；3.Abundance(在基因組中大量存在)，且分布均勻；4.neutrality(選擇中性,即無基因多效性）；5.Stable(穩(wěn)定性、重現(xiàn)性好)6.Simple,convenience(檢測(cè)手段簡(jiǎn)單、快速)；7.lowcost(開發(fā)成本和使用成本低)；8.Highefficiency(信息量大，分析效率高)。第22頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四8.2.3TypesofDNAmarkerAccordingtodevelopmentprocess,DNAmarkerscanbegroupedinto：第一代以Southern雜交技術(shù)為核心的分子標(biāo)記，如RFLP；第二代以PCR技術(shù)為核心的分子標(biāo)記，如RAPD、SSR、STS、AFLP、CAPS

；第三代基于單核苷酸多態(tài)性的DNA標(biāo)記技術(shù)，如單核苷酸多態(tài)性（SNP）。第23頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四§8.3PopularDNAMarkers

第24頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四RandomAmplifiedPolymorphicDNA(RAPD)—隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性SimpleSequenceRepeat(SSR)—簡(jiǎn)單重復(fù)序列AmplificationFragmentLengthPolymorphism(AFLP)—擴(kuò)增限制性片斷長(zhǎng)度多態(tài)性Sequence-relatedamplifiedpolymorphism(SRAP)—相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性第25頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四8.3.1RAPD

(RandomAmplifiedPolymorphicDNA,隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性)Principle:

以PCR為基礎(chǔ)，利用9-10bp的脫氧核糖核酸隨機(jī)序列為引物，以所研究的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，然后通過染色來檢測(cè)產(chǎn)物DNA片段的多態(tài)性。第26頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四第27頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四RAPD第28頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四AdvantagesanddisadvantagesofRAPD①lesstemplets.(DNA需要量較少，對(duì)DNA制備的純度要求不高，可采用微量、快速提取法)②Simpleanalysisprocedure.(分析程序較簡(jiǎn)單，周期短，不涉及放射性同位素)③Lowcost(費(fèi)用較低)④Lowstable.(擴(kuò)增穩(wěn)定性較差）第29頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四8.3.2SSR（simplesequencerepeats,簡(jiǎn)單重復(fù)序列）Principle：利用真核生物的基因組中普遍存在著二核苷酸、三核苷酸或四核苷酸的簡(jiǎn)單串聯(lián)重復(fù)序列（CA）n、（AT）n、（GGC）n，在不同生物體之間其重復(fù)次數(shù)不同而產(chǎn)生多態(tài)性。重復(fù)序列的兩側(cè)往往有一小段保守的序列，根據(jù)此保守序列可設(shè)計(jì)特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)簡(jiǎn)單串聯(lián)重復(fù)序列上的多態(tài)性。第30頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四第31頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四SSR1234567891012345678910M123456789第32頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四HowtogetprimersforSSR？Query(查詢)：

Genbank、EMBL和DDBJ等DNA序列數(shù)據(jù)庫搜索SSR序列。Developing(開發(fā))首先建立DNA文庫，篩選鑒定微衛(wèi)星DNA克隆，然后測(cè)定這些克隆的側(cè)翼序列，獲得SSR座位兩側(cè)特異保守區(qū)的核苷酸序列，據(jù)此設(shè)計(jì)PCR引物。第33頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四第34頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四AdvantagesanddisadvantagesofSSR（1）Highpolynorphism,數(shù)量幾乎無限，檢測(cè)出多態(tài)性的頻率極高；（2）SSR技術(shù)一般檢測(cè)到的是一個(gè)單一的多等位基因位點(diǎn)；（3）Co-dominant,SSR標(biāo)記為共顯性標(biāo)記；（4）Stable.結(jié)果重復(fù)性高，穩(wěn)定可靠；（5）Lesstemplets.所需DNA樣品量少，對(duì)DNA質(zhì)量要求亦不苛刻。（6）Highcosttodevelop.開發(fā)新的SSR標(biāo)記成本高。第35頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四8.3.3AFLP

(amplifiedfragmentlengthpolymorphism,擴(kuò)增的限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性)

為荷蘭Keygene公司Zabeau等(1993年)發(fā)展的一種新的DNA指紋技術(shù)。該公司(1993年)獲得歐洲專利局專利。第36頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四Principle：

基因組DNA先用限制性內(nèi)切酶切割，然后將雙鏈接頭連接到DNA片段的末端，接頭序列(adapter)和相鄰的限制性位點(diǎn)序列，作為引物結(jié)合位點(diǎn)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)基因組DNA限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性。第37頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四ProcedureofAFLP（1）基因組DNA同時(shí)用兩種限制性核酸酶進(jìn)行雙酶切后，形成分子量大小不等的隨機(jī)限制性片段，在這些DNA片段兩端連接上特定的接頭；（2）通過與接頭序列互補(bǔ)且含有3’端選擇堿基的引物，對(duì)限制性片段進(jìn)行選擇擴(kuò)增；（3）通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分子篩的作用，將這些特異的限制性片段分離開來；（4）將電泳后的凝膠染色顯色；（5）在X光膠片觀察燈下數(shù)碼成像，進(jìn)行結(jié)果分析。第38頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四第39頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四

ConstituteofAFLPprimers：

18－20bp,5′端對(duì)應(yīng)于接頭序列，中間對(duì)應(yīng)于酶切位點(diǎn)，3′端為選擇性核苷酸（1－3bp)。

Example：EcoRI和MseI酶切引物的組成：

接頭序列酶切位點(diǎn)選擇性堿基

EcoRI5′-GACTGCGTACCAATTCNNN-3′

MseI5′-GATGAGTCCTGAGTAANNN-3′

*AFLP揭示的DNA多態(tài)性是酶切位點(diǎn)和其后的選擇性堿基的變異。第40頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四AFLP第41頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四AdvantagesanddisadvantagesofAFLP（l）Reliabilityandconvenience.(具有RFLP技術(shù)的可靠性和PCR技術(shù)的高效性,由于利用特定引物擴(kuò)增，退火溫度高，因而假陽性低，可靠性高)（2）Highefficiency.(可在一個(gè)反應(yīng)內(nèi)檢測(cè)大量限制性片段，一次獲得50～100條譜帶的信息，分析效率高)（4）相對(duì)比較費(fèi)時(shí)耗財(cái)。第42頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四（4）SRAPSequence-relatedamplifiedpolymorphism,相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性Principle：基因外顯子(exon)：GCinrich內(nèi)含子(intron)與啟動(dòng)子(promoter)：ATinrich正向引物(17bp)：隨機(jī)填充序列（10bp）+CCGG+NNN反向引物(18bp)：隨機(jī)填充序列（11bp）+AATT+NNN

PCRprocedure：Annealtemperatureare35℃infirstfivecyclesand50℃fornext30cycles.(前5個(gè)循環(huán)低溫退火,后30個(gè)循環(huán)高溫退火)選擇性堿基核心序列第43頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四AdvantagesanddisadvantagesofSRAPSimpleandconvenience.(多態(tài)性高，重復(fù)性好，操作簡(jiǎn)單)Highefficicent.(效率高，成本低)DetectORF.(主要檢測(cè)ORF，擴(kuò)增結(jié)果與表型相關(guān)性高)著絲粒區(qū)及端粒區(qū)擴(kuò)增少，構(gòu)建的連鎖群縮短或斷開。第44頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四§8.4ApplicationofDNAmarkers

第45頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四Genemapping(分子遺傳圖譜構(gòu)建和基因定位)Molecularassistantselection(分子標(biāo)記輔助選擇育種)Geneticdiversityanalysis(遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析)Corecollection(核心種質(zhì)構(gòu)建)Cultivaridentificationandseedpurityanalysis(品種鑒定與純度分析)第46頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四8.4.1Genemap（基因定位）(1)Theoreticalbasis：Geneticrecombination(染色體片段交換與基因重組）Mappingmarkers/genesonchromosomeaccordingtotheexchangevalueamongthem.(染色體上兩個(gè)基因之間發(fā)生重組的頻率取決于它們之間的相對(duì)距離，準(zhǔn)確估計(jì)出交換值，即可確定基因在染色體上的相對(duì)位置)第47頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四(2)

Genemappingsteps1）SelectDNAmarker(選擇合適的DNA標(biāo)記)2）Determineparents(確定作圖群體的親本)3）segregationpopulation(創(chuàng)建分離群體)

F2，BC1，RIL，DH，NIL4）genotyping(測(cè)定單株標(biāo)記基因型)5）Linkageanalysis(標(biāo)記連鎖分析)6）genemap(重要基因在遺傳圖譜上的定位)第48頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四

P1AAaaP2F1AaaaP2F21AA:2Aa:1aaBC11Aa:1aa單粒傳RI1AA:1aaDH1AA:1aa花培（永久性）（永久性）Geneticpopulations第49頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四F2populationsF1XF2derivedfromselfcrossofF1，幾乎可產(chǎn)生所有可能基因型。第50頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四F1XF3F2F10RecombinantinbredlinesSingleseedmultipledescentSSMDF2+F3geneticmapgenotyping

traitanalysisF9+F10geneticmapgenotypingtraitanalysisRILPopulations

重組自交系第51頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四第52頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四CoddingofDNAbandsF2generation：1）dominant(顯性標(biāo)記)：與P1相同（有帶）記為D，無帶記為B;與P2相同（有帶）記為C，無帶記為A。帶型模糊不清或數(shù)據(jù)缺失，記為-。2）co-dominant(共顯性標(biāo)記)：與P1相同記為1，與P2相同記為2，與F1相同為3。第53頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四Linkageanalysis(標(biāo)記連鎖分析)Genemappingsoftware：LINKAGE、MAPMAKER、Joinmap.Principleofsoftware：二點(diǎn)測(cè)驗(yàn)（確定連鎖群）多點(diǎn)測(cè)驗(yàn)（染色體上排序）符合系數(shù)與交換干擾Haldane作圖函數(shù)：X=-(1/2)In(1-2r)Kosambi作圖函數(shù)：X=1/4In[(1+2r)/(1-2r)]第54頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四第55頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四第56頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四8.4.2Marker-assistedselectionbreeding(標(biāo)記輔助選擇育種)如果目的基因與某個(gè)分子標(biāo)記緊密連鎖，即可通過對(duì)分子標(biāo)記基因型的檢測(cè)，獲知目標(biāo)基因的基因型。借助分子標(biāo)記對(duì)目標(biāo)性狀的基因型進(jìn)行選擇，稱為分子標(biāo)記輔助選擇（MAS）第57頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四Conventionalbreeding(常規(guī)育種)Phenotypicselection:育種家基于表型選擇技術(shù)在物種變異群體中進(jìn)行新品種的選育選擇群體育種確定表型表型選擇品種自發(fā)突變?nèi)斯るs交物理誘變化學(xué)誘變組培誘變第58頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四Molecularbreeding(分子育種)基于DNA鑒定技術(shù)在物種變異群體中進(jìn)行新品種的選育。狹義的分子育種是轉(zhuǎn)基因育種與分子標(biāo)記輔助育種的統(tǒng)稱。選擇群體育種確定基因或標(biāo)記分子選擇品種自發(fā)突變?nèi)斯るs交物理誘變化學(xué)誘變組培誘變DNA插入轉(zhuǎn)基因技術(shù)和分子選擇技術(shù)是分子育種的關(guān)鍵技術(shù)，是實(shí)現(xiàn)作物設(shè)計(jì)(CropDesign)育種的核心第59頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四Compareconventionalbreedingwithmolecularbreedingconventionalbreedingmolecularbreeding表現(xiàn)型選擇，受時(shí)空因素影響基因來源有限、育種親本貧乏基因交流限于種內(nèi)、少數(shù)亞種間，目標(biāo)性狀功能有一定的不明確性選擇時(shí)間長(zhǎng)，根據(jù)細(xì)胞學(xué)鑒定基因型，需2-3年，通過測(cè)交需2-3年基因型選擇，不受時(shí)空因素影響基因來源廣、基因資源豐富基因交流不受物種限制目標(biāo)基因功能已知、目標(biāo)性強(qiáng)選擇時(shí)間短，可準(zhǔn)確快速在后代群體中跟蹤目標(biāo)性狀的傳遞基因可分離、可調(diào)控基因及其產(chǎn)物的功能、表達(dá)第60頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四Thecomparisonofphenotypicandmolecularselection

efficiency1對(duì)基因2對(duì)基因3對(duì)基因表型選擇6-8代300030003000BC699%標(biāo)記選擇2-3代47187750BC3100%基因選擇2-3代<100<100<100BC2