2023年中國藥科大學本科畢業(yè)論文解讀

第中國藥科大學本科畢業(yè)論文解讀

中國藥科大學

本科畢業(yè)論文

論文題目TQ0701對大鼠腦缺血再灌注

損傷的保護作用

英文題目ProtectiveeffectsofTQ0701on

cerebralischemicreperfusioninjuryinrats專業(yè)中藥學院部中藥院學號姓名指導教師

課題

完成場所中國藥科大學藥學院生理教研室

論文工作時間：年月至年月

TQ0701對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用

目錄

摘要.............................................................................................................1前言.............................................................................................................3第一章材料...............................................................................................61.1藥物和試劑...................................................................................61.2主要儀器.......................................................................................71.3動物................................................................................................7第二章方法...............................................................................................82.1TQ0701iv對局灶性腦缺血大鼠的神經(jīng)功能和腦組織梗塞率的影響.......................................................................................................82.2TQ0701iv對局灶性腦缺血大鼠腦組織學的影響.......................92.3統(tǒng)計學處理...................................................................................9第三章結(jié)果.............................................................................................103.1TQ0701對局灶性腦缺血大鼠的神經(jīng)功能和腦組織梗塞率的影響.........................................................................................................103.2TQ0701對局灶性腦缺血大鼠腦組織學的影響........................10第四章討論.............................................................................................12參考文獻...................................................................................................14致謝...........................................................................................................16

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TQ0701對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用

學號姓名

摘要：目的:探討新型的化合物TQ0701對大鼠腦缺血再灌注損傷保護作用的有效性，從而為該化合物的機制研究以及臨床應用開發(fā)提供相關(guān)實驗數(shù)據(jù)和實驗思路。

方法:將60只雄性SD大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組、陽性對照組（依達拉奉3mg/kg）、TQ0701低劑量組(1.5mg/kg)、中劑量組(3mg/kg)、高劑量組(6mg/kg)各10只。假手術(shù)組僅進行手術(shù)而不造成缺血狀態(tài)，其余各組均采用Longa線栓法制備大鼠MCAO模型，在缺血2h后進行再灌注。給藥組和陽性對照組分別在缺血前30min以及再灌注0、2h尾靜脈注射TQ0701和依達拉奉，假手術(shù)組和模型組則給予等量的0.9%氯化鈉溶液。再灌注24h后觀察大鼠神經(jīng)功能評分、腦組織梗塞百分率和病理組織學的改變。

結(jié)果:模型組大鼠的神經(jīng)功能評分和腦組織梗塞百分率同假手術(shù)組、陽性對照組以及TQ0701三個劑量組相比有顯著差異，陽性對照組與TQ0701三個劑量組相比未見顯著差異。同時電鏡觀察結(jié)果也發(fā)現(xiàn)TQ0701三個劑量組及陽性對照組與模型組相比神經(jīng)細胞病理改變較輕。

結(jié)論：化合物TQ0701對急性腦梗死有明顯的保護作用。關(guān)鍵詞：TQ0701；腦缺血再灌注；依達拉奉；

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ProtectiveeffectsofTQ0701oncerebralischemicreperfusion

injuryinrats

Abstract:Aim:ToinvestigatetheeffectsofTQ0701bydynamicchangesofinfarctvolumesandneurologicaldeficitscoresonlocalcerebralischemic-reperfusioninjuryinrats.Method:MaleSDratswererandomlydividedintosham-operatedcontrolgroup(n=10),normalsalinecontrolgroups(n=10),edaravone-treatedgroup(3mg/kg)(n=10)andTxL-treatedgroups(6mg/kg,3mg/kgand1.5mg/kg)(n=10each).Animalsinthelatterfourgroupsweresubjectedtotransientfocalischemiabythemiddlecerebralarteryocclusion(MCAO)for120minutes.TheratswerepretreatedwithnormalsalineorTxL30minbeforeischemicand0min,2hoursafterreperfusion.After24hoursofreperfusion,infarctvolumesweredeterminedby2,3,5-triphenyltetrazoliumchloride(TTC)andneurologicalscoreswereinvestigated.Results:InfarctvolumesinTQ0701-treatedgroupsweresignificantlydecreasedcomparedwiththoseincontrolgroupsat24afterMCAO,andtheneurologicaldeficitscoresinTQ0701-treatedgroupsweresynchronouslyimproved.Conclusion:TheseresultsshowthattreatmentwithTQ0701canattenuatebraininjuryandTQ0701maybeapotentialneuroprotectiveagentincerebralischemia-reperfusion.Keywords:TQ0701;cerebralischemicreperfusion;edaravone

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前言

目前，腦血管病嚴重危害人類健康，已成為三大死亡原因之一，其中缺血性腦血管病約占56.6%～80%。因此對于腦血管病治療藥物的研究與開發(fā)具有很大的實際價值和前景。

隨著對急性腦缺血再灌注和缺氧復氧損傷研究的進展，對腦梗塞的病理生理機制有了新的認識。大量研究已經(jīng)證實了急性缺血后恢復血液灌流，會使病變加劇而發(fā)生再灌注損傷。目前主要從細胞內(nèi)鈣離子、NMDA受體、自由基、花生四烯酸代謝、缺血區(qū)酸堿平衡破壞、基因表達及蛋白質(zhì)的磷酸化等方面，對腦缺血再灌注損傷的機理和防治開展了廣泛而深人的研究。下面就幾個最基礎(chǔ)的病理生理機制進行探討。

1.鈣與缺血缺氧性腦損傷

細胞內(nèi)鈣作為第二信使、代謝調(diào)節(jié)因子和膜穩(wěn)定劑在細胞正常機能活動中起重要作用，亦可介導多種病理情況下的細胞死亡。生理情況下，鈣在細胞內(nèi)外存在很大的濃度差，這依賴于膜正常通透性及胞漿鈣外排機制來維持，后一過程需消耗能量。腦缺血缺氧時主要由于ATP供應不足、N-甲基-D-門冬氨酸(NMDA)受體過度興奮介導與其偶聯(lián)的鈣通道開放、膜通透性增大及封阻機制障礙而致細胞外鈣內(nèi)流增加、胞漿鈣外排障礙，造成細胞內(nèi)Ca2+濃度增高[1]。細胞內(nèi)Ca2+超載，一方面使血管收縮、進一步加重腦缺血缺氧；同時引起細胞代謝、結(jié)構(gòu)與功能多方面的異常改變，從而導致細胞死亡。2.自由基連鎖反應

腦缺血再灌注時，可通過黃嘌呤氧化酶、線粒體系統(tǒng)、白細胞系統(tǒng)、花生四烯酸相關(guān)酶系統(tǒng)、一氧化氮合成酶(NOS)系統(tǒng)等使自由基大量產(chǎn)生，同時自由基防御系統(tǒng)功能受損，動態(tài)平衡被打亂。自由基具有很高的化學活性，可快速攻擊其它化合物的分子并產(chǎn)生更多的自由基，自由基破壞膜結(jié)構(gòu)中蛋白成分、引起膜脂質(zhì)過氧化，導致膜損傷、線粒體功能障礙、溶酶體破裂、細胞溶解和組織水腫等一系列損害作用，稱之為自由基連鎖反應[2-4]。近年大量研究證實，氧自由基介導的自由基連鎖反應是導致腦缺血缺氧與再灌注復氧損傷的主要原因。3.興奮性氨基酸的神經(jīng)毒性作用

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生理情況下，興奮性氨基酸作為正常的神經(jīng)遞質(zhì)，在神經(jīng)元之間的信息傳遞中發(fā)揮重要作用。突觸前膜釋放的谷氨酸（GIU）主要通過神經(jīng)細胞膜上的高親和性攝取系統(tǒng)攝取滅活，細胞外液GIU濃度維持在1umol/L左右。病理狀態(tài)下，GIU通過使神經(jīng)元過度興奮而發(fā)揮其神經(jīng)毒作用。在腦缺血缺氧時，GIU大量釋放，同時其再攝取機制受阻，在突觸中堆集，使NMDA受體過度興奮，啟動NMDA受體的控鈣通道而使外鈣大量內(nèi)流，由此引發(fā)神經(jīng)細胞的損傷。目前認為，細胞內(nèi)鈣超載是介導興奮性氨基酸遞質(zhì)神經(jīng)毒性作用的關(guān)鍵因素。GIU主要與局灶性或不完全性腦缺血性損傷有關(guān)[5]。4.腦內(nèi)NO的神經(jīng)細胞毒性作用

NO在腦缺血損傷中的作用可能是雙重性的。它一方面可通過舒張腦血管和抑制血小板聚集，下調(diào)NMDA受體，從而改善組織灌流、對缺血邊緣區(qū)腦組織施加直接保護作用，減輕缺血性損害；另一方面可通過形成自由基或其它途徑，而產(chǎn)生神經(jīng)毒性，加重缺血損傷，促使缺血區(qū)邊緣腦組織向梗死發(fā)展。5.花生四烯酸代謝失衡

腦缺血再灌注時，通過AA代謝產(chǎn)生大量的TxA2、PGF2及白三烯(LT)C4、B4等物質(zhì)。同時，由于合成酶抑制或內(nèi)皮細胞損傷而致與TxA2、PGF2具有對抗作用的PGI2產(chǎn)生減少，造成TxA2/PGI2比值失衡。TxA2、PGF2和白三烯等可致血小板聚積、腦血管痙攣和血管通透性增加，加重腦缺血和腦水腫形成，導致缺血后遲發(fā)性低灌注損傷[6]：LTB4和12-羥花生四烯酸對白細胞浸潤和激活起著放大作用。并且，AA自身代謝過程中，可產(chǎn)生大量O2-，從不同途徑導致組織損傷?？梢?，AA代謝失衡在腦缺血再灌注損傷中起著非常重要的作用。

依達拉奉首先由日本三菱東京制藥株式會社開發(fā)，202x年6月剛剛在日本上市。1984年日本三菱東京制藥株式會社根據(jù)酚類化合物具有強的自由基清除作用的原理,經(jīng)過多次篩選,終于研發(fā)出一種神經(jīng)元保護劑(自由基清除劑)依達拉奉。它是一種安替吡啉的代謝產(chǎn)物，其在體內(nèi)以陰離子形式存在，血腦屏障通透性高，靜脈給藥可清除大腦內(nèi)具有高度細胞毒性的羥自由基。因此，該藥最早用于腦缺血性病變急性期治療。研究表明，作為自由基清除劑，依達拉奉可有效改善腦組織缺血再灌注損傷。腦缺血再灌注后，過多的氧自由基導致腦組織直接損傷及細胞膜脂質(zhì)過氧化，破壞細胞膜結(jié)構(gòu)和完整性，引起細胞膜通透性增加，細胞毒性

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水腫增加。研究證實，依達拉奉能減少神經(jīng)元NO合成酶，增加內(nèi)皮型NO合酶，抑制腦線粒體通透性轉(zhuǎn)運孔開放，起到腦組織保護作用。另外，依達拉奉還能明顯抑制缺血區(qū)腦水腫，減少缺血再灌注引起的白三烯合成[7]?？梢姡肋_拉奉能對缺血再灌注損傷的腦組織起到理想的保護作用。隨著該藥的腦保護作用逐漸得到臨床肯定，其適應癥進一步擴大，如治療心肌缺血、肺缺血、腎臟缺血、肝臟缺血和腸缺血等，其相關(guān)研究已取得較大進展。

鑒于依達拉奉良好的腦保護作用，在依達拉奉的基礎(chǔ)上，對其進行結(jié)構(gòu)改造，合成了新型化合物TQ0701。本課題就是主要觀察TQ0701對于腦缺血的保護作用，從而為該化合物的機制研究以及臨床應用開發(fā)提供相關(guān)實驗數(shù)據(jù)和實驗思路。

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第一章材料

1.1藥物和試劑1.1.1TQ0701原料：

提供單位：江蘇正大天晴制藥有限公司規(guī)格：純度為98.0％以上

配制方法：按(1.2mgTQ0701原料)：(1mL0.9%氯化鈉溶液)的比例配制成原液。TQ0701高劑量組，給予大鼠iv0.5mL/100g體重的原液；中劑量組需將原液用0.9%氯化鈉溶液稀釋一倍，給藥體積同上；低劑量組將原液稀釋兩倍，給藥體積同上

1.1.2依達拉奉(Edaravone)原料：

提供單位：江蘇正大天晴制藥有限公司規(guī)格：純度為98.0％以上

配制方法：按(0.6mg依達拉奉原料)：(1mL0.9%氯化鈉溶液)的比例配制成溶液。大鼠iv0.5mL/100g體重

1.1.3水合氯醛(TCA):

提供單位：國藥集團化學試劑有限公司規(guī)格：分析純

配制方法：用0.9%氯化鈉溶液配制成10%的溶液，大鼠ip0.5mL/100g體重

1.1.4紅四氮唑(TTC)：

提供單位：上海靈錦精細化工有限公司規(guī)格：分析純

配制方法：用PBS溶液配制成1%的溶液，4℃避光保存

1.1.5PBS溶液(g/L)：

配制方法：每升蒸餾水加入NaCl8.00g，KCL0.20g，Na2HPO4·H2O0.156g，KH2PO40.20g，充分溶解

1.1.60.9%氯化鈉溶液：

提供單位：中國大冢制藥有限公司

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規(guī)格：250ml/瓶

1.1.7肝素鈉注射液

提供單位：常州千紅生化制藥有限公司規(guī)格：2mL:12500單位

配制方法：臨用前加0.9%氯化鈉溶液將肝素配制成125μ/mL溶液

1.1.8無水乙醇：

提供單位：無錫市亞盛化工有限公司規(guī)格：分析純

配制方法：用蒸餾水配制成75%的溶液

1.1.9甲醛溶液

提供單位：國藥集團化學試劑有限公司規(guī)格：分析純

配制方法：用蒸餾水配制成10%的溶液，避光保存

1.1.10HE染色試劑盒：

提供單位：南京建成生物工程研究所

1.2主要儀器1.2.1電熱恒溫水浴鍋：

江蘇省東臺市電器廠

1.2.2分析天平：

北京賽多利斯天平有限公司

1.3動物

SD大鼠，雄性，220～260g，清潔級，生產(chǎn)許可證由河南省實驗動物中心提供，生產(chǎn)許可證號：SCxK(豫)202x-0001；使用許可證由中國藥科大學新藥篩選中心提供，使用許可證號：SYxK(蘇)202x-0010。

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第二章方法

2.1TQ0701iv對局灶性腦缺血大鼠的神經(jīng)功能和腦組織梗塞率的影響

取SD大鼠60只，雄性，體重220～260g，按體重隨機分為6組，分別為假手術(shù)組，模型組（均給以等量0.9%氯化鈉溶液），陽性對照組（依達拉奉3mg/kg），TQ0701高、中、低三個劑量組（6、3、1.5mg/kg）。以上各組給藥容量均為0.5mL/100g。參考Longa[8～10]等人的方法，采用頸內(nèi)動脈線栓法制備大鼠大腦中動脈閉塞（MCAO）模型。大鼠用10%水合氯醛（300mg/kg）ip麻醉后仰臥恒溫手術(shù)臺上。從頸部正中切口，暴露右側(cè)頸總動脈，向外牽引二腹肌及胸鎖乳突肌，由頸總動脈分叉處向頭端依次游離，結(jié)扎并剪斷頸外動脈的分支：枕骨下動脈和甲狀腺上動脈，在頸外動脈遠端結(jié)扎，切斷頸外動脈使其主干游離備用，然后分離頸內(nèi)動脈，用絲線在頸外動脈根部打一松扣，夾閉頸總動脈和頸內(nèi)動脈。將尼龍線（長5cm，直徑0.28mm）經(jīng)頸外動脈主干切口，緩慢向頸內(nèi)動脈入顱方向推進，以頸總動脈分叉處為標記，推進18mm左右時感到阻力，即達到了較細的大腦中動脈內(nèi)，阻斷了MCA的所有血供來源，扎緊頸外動脈根部松扣。2h后，拔出尼龍線，扎緊動脈殘端?？p合皮膚，完成MCAO導致局灶性腦缺血—再灌注模型。假手術(shù)組大鼠麻醉后，僅暴露頸內(nèi)外動脈分叉，不閉塞MCA。TQ0701三個劑量組和陽性對照組分別在缺血前30min以及再灌注0、2h尾靜脈注射TQ0701和依達拉奉，假手術(shù)組和模型組則給予等量的0.9%氯化鈉溶液。

術(shù)后24h按Bederson的方法對動物的行為缺陷進行分級評分，標準如下[11]：0分：無神經(jīng)功能缺失癥狀；1分：提大鼠尾，見癱瘓側(cè)前肢回收屈曲不能正常伸向地面；2分：向癱瘓側(cè)推時感阻力較對側(cè)明顯降低；3分：大鼠爬行時向癱瘓側(cè)旋轉(zhuǎn)；4分：伴有意識障礙。

MCAO24h后，斷頭處死大鼠，取出全腦（去除小腦）。在視交叉及其前后各2mm處，做冠狀切片5片，于1%TTC中避光37℃孵育30min，再分離蒼白區(qū)（梗塞區(qū)）和非蒼白區(qū)（正常區(qū)），計算梗塞百分比如下：

梗塞百分比(%)=蒼白區(qū)重量/(蒼白區(qū)重量+非蒼白區(qū)重量)×100%

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2.2TQ0701iv對局灶性腦缺血大鼠腦組織學的影響

取SD大鼠60只，雌性，220～260g，隨機分為6組，分組給藥及手術(shù)方法如前。MCAO后24h斷頭處死大鼠，取出全腦（去除小腦），于10%甲醛溶液中固定。標本于臘制模具中切片后作HE染色，對大腦皮層海馬進行病理組織學檢查。

2.3統(tǒng)計學處理

實驗數(shù)據(jù)用

表示。采用單因素方差分析進行組間顯著性比較,兩組

間樣本均數(shù)比較采用t檢驗。

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第三章結(jié)果

3.1TQ0701對局灶性腦缺血大鼠的神經(jīng)功能和腦組織梗塞率的影響

由表1可見：模型組的MCAO大鼠腦卒中評分明顯增加，梗死面積也明顯增大（P

表1.TQ0701對局灶性腦缺血大鼠行為學評分、梗死面積的影響

（x?s，n=10）

組別假手術(shù)組模型組陽性對照組TQ0701給藥組

△

劑量（mg/kg）

－－3631.5

行為學評分0.0±0.0△△3.3±0.51.7±0.8△△1.5±0.6△△1.9±0.7△△2.6±0.7△

梗死面積（％）

－41.4±3.519.7±2.5△△20.1±3.0△△25.9±6.3△△36.0±5.6△

P

3.2TQ0701對局灶性腦缺血大鼠腦組織學的影響

（1）假手術(shù)組：10例腦組織神經(jīng)元基本正常，核居中，未見神經(jīng)元明顯病變、

壞死及炎細胞浸潤等病理學改變。

（2）模型組：10例腦組織大腦皮質(zhì)神經(jīng)元均見中－重度變性、壞死（＋＋～＋

＋＋），神經(jīng)元結(jié)構(gòu)模糊，胞體腫脹，尼氏小體減少或消失，出現(xiàn)不同程度的核深染、核固縮、核溶解，神經(jīng)元數(shù)目明顯減少，其中5例見篩狀軟化灶形成。

（3）陽性對照組：10例腦組織中有8例未見明顯神經(jīng)元變性、壞死及炎細胞浸潤

等病理學改變。2例腦組織神經(jīng)元輕度變性、壞死（＋），神經(jīng)元結(jié)構(gòu)模糊，

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胞體腫脹，尼氏小體減少或消失，有不同程度的核深染、核固縮、核溶解。該組神經(jīng)元數(shù)目較模型組多。

（4）TQ07016mg/kgiv組：10例腦組織中有7例腦組織未見神經(jīng)元變性、壞死及

炎細胞浸潤等病理學改變。3例腦組織神經(jīng)元見輕－中度變性、壞死（＋～＋＋），神經(jīng)元結(jié)構(gòu)模糊，胞體腫脹，尼氏小體減少或消失，出現(xiàn)不同程度的核深染、核固縮、核溶解。該組神經(jīng)元數(shù)目較模型組多。

（5）TQ07013mg/kgiv組：10例腦組織中有6例腦組織未見神經(jīng)元變性、壞死及

炎細胞浸潤等病理學改變。4例腦組織神經(jīng)元見輕－中度變性、壞死（＋～＋＋），神經(jīng)元結(jié)構(gòu)模糊，胞體腫脹，尼氏小體減少或消失，出現(xiàn)不同程度的核深染、核固縮、核溶解。該組神經(jīng)元數(shù)目較模型組多。

（6）TQ07011.5mg/kgiv組：10例腦組織中有4例腦組織未見神經(jīng)元變性、壞死

及炎細胞浸潤等病理學改變。6例腦組織神經(jīng)元見輕－中度變性、壞死（＋～＋＋），神經(jīng)元結(jié)構(gòu)模糊，胞體腫脹，尼氏小體減少或消失，出現(xiàn)不同程度的核深染、核固縮、核溶解，其中2例見篩狀