基因工程的基本操作程序使用修改

基因工程的基本操作程序使用修改第1頁(yè)，共82頁(yè)，2023年，2月20日，星期四基因工程培育抗蟲(chóng)棉的簡(jiǎn)要過(guò)程：提取棉花細(xì)胞(含抗蟲(chóng)基因)蘇云金芽孢桿菌抗蟲(chóng)基因與運(yùn)載體DNA拼接導(dǎo)入普通棉花(無(wú)抗蟲(chóng)特性)棉花植株(有抗蟲(chóng)特性)第2頁(yè)，共82頁(yè)，2023年，2月20日，星期四基因工程的基本操作程序（1）目的基因的獲?。?）（3）將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞（4）目的基因的檢測(cè)與鑒定基因表達(dá)載體的構(gòu)建第3頁(yè)，共82頁(yè)，2023年，2月20日，星期四一、目的基因的獲取1、目的基因：主要是編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因也可以是一些具有調(diào)控作用的因子第4頁(yè)，共82頁(yè)，2023年，2月20日，星期四補(bǔ)：原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)啟動(dòng)子終止子RNA聚合酶能夠識(shí)別調(diào)控序列中的結(jié)合位點(diǎn)，并與其結(jié)合。轉(zhuǎn)錄開(kāi)始后，RNA聚合酶沿DNA分子移動(dòng)，并以DNA分子的一條鏈為模板合成RNA。轉(zhuǎn)錄完畢后，RNA鏈釋放出來(lái)，緊接著RNA聚合酶也從DNA模板鏈上脫落下來(lái)。第5頁(yè)，共82頁(yè)，2023年，2月20日，星期四①不能轉(zhuǎn)錄為信使RNA，不能編碼蛋白質(zhì)。：能轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的信使RNA，能編碼蛋白質(zhì)編碼區(qū)非編碼區(qū)原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)②有調(diào)控遺傳信息表達(dá)的核苷酸序列非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游啟動(dòng)子終止子與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)啟動(dòng)子、終止子一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA片斷，基因的首端，是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合部位，驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄——啟動(dòng)子一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA片斷，基因的尾端，使轉(zhuǎn)錄終止——終止子第6頁(yè)，共82頁(yè)，2023年，2月20日，星期四補(bǔ)：真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)含子外顯子能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做外顯子不能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做內(nèi)含子啟動(dòng)子終止子編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游內(nèi)含子：外顯子：第7頁(yè)，共82頁(yè)，2023年，2月20日，星期四真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)非編碼區(qū)外顯子：能編碼蛋白質(zhì)的序列內(nèi)含子：不能編碼蛋白質(zhì)的序列：有調(diào)控作用的核苷酸序列，包括位于編碼區(qū)上游的RNA

聚合酶結(jié)合位點(diǎn)。第8頁(yè)，共82頁(yè)，2023年，2月20日，星期四結(jié)構(gòu)基因外顯子內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄、加工修飾mRNA第9頁(yè)，共82頁(yè)，2023年，2月20日，星期四原核細(xì)胞真核細(xì)胞不同點(diǎn)編碼區(qū)是_____的編碼區(qū)是間隔的、_____的相同點(diǎn)都由能夠編碼蛋白質(zhì)的______和具有調(diào)控作用的______

區(qū)組成的原核細(xì)胞與真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)比較思考編碼相同數(shù)目氨基酸的蛋白質(zhì)，原核細(xì)胞與真核細(xì)胞基因結(jié)構(gòu)一樣長(zhǎng)嗎？連續(xù)不連續(xù)編碼區(qū)非編碼第10頁(yè)，共82頁(yè)，2023年，2月20日，星期四一、目的基因的獲取1、目的基因：2、獲取方法：（1）從基因文庫(kù)中獲取目的基因；（2）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因；（3）人工合成：通過(guò)DNA合成儀用化學(xué)方法直接合成主要是編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因也可以是一些具有調(diào)控作用的因子第11頁(yè)，共82頁(yè)，2023年，2月20日，星期四（一）從基因文庫(kù)中獲取目的基因1.什么叫基因文庫(kù)？將含有某種生物不同基因的許多DNA片斷，導(dǎo)入到受體菌的群體中，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫(kù)?；蛭膸?kù)

基因組文庫(kù)部分基因文庫(kù)（cDNA文庫(kù)）第12頁(yè)，共82頁(yè)，2023年，2月20日，星期四基因組文庫(kù)的構(gòu)建模式圖注意：基因文庫(kù)中不是直接保管相應(yīng)基因，而是保存受體菌，菌中含基因。第13頁(yè)，共82頁(yè)，2023年，2月20日，星期四基因組DNA文庫(kù)cDNA文庫(kù)基因組DNA文庫(kù)與cDNA文庫(kù)的比較第14頁(yè)，共82頁(yè)，2023年，2月20日，星期四基因組文庫(kù)與部分基因文庫(kù)的關(guān)系第15頁(yè)，共82頁(yè)，2023年，2月20日，星期四基因組文庫(kù)和部分基因文庫(kù)的比較文庫(kù)類型cDNA文庫(kù)基因組文庫(kù)文庫(kù)大小基因中啟動(dòng)子基因中內(nèi)含子基因多少物種間基因交流小大無(wú)有無(wú)有某種生物的部分基因某種生物的全部基因可以部分基因可以第16頁(yè)，共82頁(yè)，2023年，2月20日，星期四思考：如何從基因文庫(kù)中得到所需要的基因？依據(jù)：目的基因的有關(guān)信息。如：根據(jù)基因的核苷酸序列；基因的功能；基因在染色體上的位置；基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA；

基因翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性。第17頁(yè)，共82頁(yè)，2023年，2月20日，星期四（二）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因第18頁(yè)，共82頁(yè)，2023年，2月20日，星期四（二）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因第19頁(yè)，共82頁(yè)，2023年，2月20日，星期四1234522557294時(shí)間（min）溫度（℃）PCR反應(yīng)PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)1~3步25~30輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬(wàn)倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍第20頁(yè)，共82頁(yè)，2023年，2月20日，星期四模板DNA95℃第21頁(yè)，共82頁(yè)，2023年，2月20日，星期四PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)50℃引物1引物2DNA引物第22頁(yè)，共82頁(yè)，2023年，2月20日，星期四PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶第23頁(yè)，共82頁(yè)，2023年，2月20日，星期四PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)72℃第1輪結(jié)束第2輪開(kāi)始第24頁(yè)，共82頁(yè)，2023年，2月20日，星期四PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaq第25頁(yè)，共82頁(yè)，2023年，2月20日，星期四PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)72℃第2輪結(jié)束第26頁(yè)，共82頁(yè)，2023年，2月20日，星期四PCR的基本反應(yīng)步驟變性90-95?C延伸70-75?C退火55-60?CPCR總結(jié)：第27頁(yè)，共82頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第28頁(yè)，共82頁(yè)，2023年，2月20日，星期四Taq

DNA聚合酶（thermusaquaticus)酶活性(%)溫度(℃)40506070809010010080604020第29頁(yè)，共82頁(yè)，2023年，2月20日，星期四①概念：PCR全稱為_(kāi)______________，是一項(xiàng)在生物____復(fù)制___________的核酸合成技術(shù)。③前提條件：_______________________；原料：___________、___________、__________________、________________。②原理：__________④方式：以_____方式擴(kuò)增，即____（n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)）⑤結(jié)果：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體外特定DNA片段DNA復(fù)制已知基因的核苷酸序列四種脫氧核苷酸DNA引物熱穩(wěn)定DNA聚合酶指數(shù)2n使目的基因的片段在短時(shí)間內(nèi)成百萬(wàn)倍地?cái)U(kuò)增模板DNA第30頁(yè)，共82頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

過(guò)程：變性、退火、延伸三步曲變性：加熱至90～95℃雙鏈DNA解鏈成為單鏈DNA退火：冷卻至55～60℃部分引物與模板的單鏈DNA的特定互補(bǔ)部位相配對(duì)和結(jié)合延伸：加熱至70～75℃以目的基因?yàn)槟０?，合成互補(bǔ)的新DNA鏈變性退火延伸第31頁(yè)，共82頁(yè)，2023年，2月20日，星期四⑥過(guò)程：a、DNA變性（90℃-95℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，_____斷裂，形成___________b、退火（復(fù)性55℃-65℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，從引物的5′端→3′端延伸，合成與模板互補(bǔ)的________。氫鍵單鏈DNA雙鏈DNA鏈第32頁(yè)，共82頁(yè)，2023年，2月20日，星期四思考？1個(gè)DNA分子進(jìn)行PCR擴(kuò)增,循環(huán)4次，理論上至少需要幾個(gè)引物？2×（2n-1）(n為循環(huán)次數(shù))（24-1）×2=30第33頁(yè)，共82頁(yè)，2023年，2月20日，星期四PCR技術(shù)擴(kuò)增與DNA復(fù)制的比較PCR技術(shù)DNA復(fù)制相同點(diǎn)原理原料條件不同點(diǎn)解旋方式場(chǎng)所酶結(jié)果堿基互補(bǔ)配對(duì)四種脫氧核苷酸模板、能量、酶DNA在高溫下變性解旋解旋酶催化體外復(fù)制細(xì)胞核內(nèi)熱穩(wěn)定的DNA聚合酶細(xì)胞內(nèi)的DNA聚合酶大量的DNA片段形成整個(gè)DNA分子第34頁(yè)，共82頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

根據(jù)已知蛋白質(zhì)的氨基酸序列，推測(cè)出相應(yīng)的mRNA序列，然后按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，推測(cè)出它的結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列，再通過(guò)化學(xué)方法，以單核苷酸為原料合成目的基因。蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列推測(cè)推測(cè)目的基因化學(xué)合成（三）化學(xué)方法人工合成目的基因第35頁(yè)，共82頁(yè)，2023年，2月20日，星期四人工合成(基因比較小)DNA合成儀第36頁(yè)，共82頁(yè)，2023年，2月20日，星期四從基因文庫(kù)中獲取利用PCR技術(shù)擴(kuò)增利用化學(xué)方法人工合成歸納：獲取目的基因的方法第37頁(yè)，共82頁(yè)，2023年，2月20日，星期四用一定的_________切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個(gè)切口，露出____________。用_____________切斷目的基因，使其產(chǎn)生_________________。將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的______處，再加入適量___________，形成了一個(gè)重組

DNA分子（重組質(zhì)粒）限制酶黏性末端同一種限制酶相同的黏性末端切口DNA連接酶1.過(guò)程:二、構(gòu)建表達(dá)載體——核心第38頁(yè)，共82頁(yè)，2023年，2月20日，星期四質(zhì)粒DNA分子限制酶處理兩個(gè)切口獲得目的基因DNA連接酶重組DNA分子（重組質(zhì)粒）同一種一個(gè)切口兩個(gè)黏性末端復(fù)制原點(diǎn)+啟動(dòng)子+目的基因+終止子+標(biāo)記基因過(guò)程:第39頁(yè)，共82頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2.基因表達(dá)載體的目的（1）使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在并可以遺傳給下一代；（2）使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。第40頁(yè)，共82頁(yè)，2023年，2月20日，星期四科學(xué)家在培育抗蟲(chóng)棉時(shí)，經(jīng)歷了多次失敗，才獲得成功。起初把蘇云金芽孢桿菌的抗蟲(chóng)基因插入載體質(zhì)粒中，然后導(dǎo)入棉花的受精卵中，結(jié)果抗蟲(chóng)基因在棉花體內(nèi)沒(méi)有表達(dá)。然后在插入抗蟲(chóng)基因的質(zhì)粒中插入啟動(dòng)子(抗蟲(chóng)基因首端)，導(dǎo)入棉花受精卵，長(zhǎng)成的棉花植株還是沒(méi)有抗蟲(chóng)能力。科學(xué)家又在有啟動(dòng)子、抗蟲(chóng)基因的質(zhì)粒中插入終止子(抗蟲(chóng)基因末端)，導(dǎo)入棉花受精卵，結(jié)果成長(zhǎng)的植株，有了抗蟲(chóng)能力。資料:第41頁(yè)，共82頁(yè)，2023年，2月20日，星期四思考：作為基因工程表達(dá)載體，只需含有目的基因就可以完成任務(wù)嗎？為什么？（P15）

不可以。因?yàn)槟康幕蛟诒磉_(dá)載體中得到表達(dá)并發(fā)揮作用，還需要有其他控制元件，如啟動(dòng)子、終止子和標(biāo)記基因等。

第42頁(yè)，共82頁(yè)，2023年，2月20日，星期四（1）生物之間進(jìn)行基因交流，只有使用受體生物自身基因的啟動(dòng)子才能比較有利于基因的表達(dá)；（2）通過(guò)cDNA文庫(kù)獲得的目的基因沒(méi)有啟動(dòng)子，只將編碼序列導(dǎo)入受體生物中無(wú)法轉(zhuǎn)錄；（3）目的基因是否導(dǎo)入受體生物中需要有篩選標(biāo)記；（4）為了增強(qiáng)目的基因的表達(dá)水平，往往還要增加一些其他調(diào)控元件，如增強(qiáng)子（增強(qiáng)基因啟動(dòng)子工作效率的順式作用序列，能夠在相對(duì)于啟動(dòng)子的任何方向和任何位置(上游或下游)上都發(fā)揮作用。）等；（5）有時(shí)需要確定目的基因表達(dá)的產(chǎn)物存在于細(xì)胞的什么部位，往往要加上可以標(biāo)識(shí)存在部位的基因（或做成目的基因與標(biāo)識(shí)基因的融合基因），如綠色熒光蛋白基因等。第43頁(yè)，共82頁(yè)，2023年，2月20日，星期四3.基因表達(dá)載體的組成：它們有什么作用？a、目的基因b、啟動(dòng)子c、終止子d、標(biāo)記基因第44頁(yè)，共82頁(yè)，2023年，2月20日，星期四調(diào)節(jié)基因操縱基因結(jié)構(gòu)基因RNA聚合酶半乳糖苷酶酶酶

RNA聚合酶啟動(dòng)子RNA聚合酶啟動(dòng)子：位于基因首端的一段特殊的DNA片斷，它是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終獲得蛋白質(zhì)。第45頁(yè)，共82頁(yè)，2023年，2月20日，星期四思考1：

表達(dá)載體為什么一定要有啟動(dòng)子？（1）生物之間進(jìn)行基因交流，只有使用受體生物自身基因的啟動(dòng)子才能有利于基因的表達(dá)；（2）通過(guò)cDNA文庫(kù)獲得的目的基因沒(méi)有啟動(dòng)子，只將編碼序列導(dǎo)入受體細(xì)胞無(wú)法轉(zhuǎn)錄。第46頁(yè)，共82頁(yè)，2023年，2月20日，星期四思考2：終止子的作用是什么？

終止子是位于基因尾端的一段特殊的DNA片斷，能終止mRNA的轉(zhuǎn)錄。是為了鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將有目的基因的細(xì)胞篩選出來(lái)。思考3：標(biāo)記基因有什么作用？第47頁(yè)，共82頁(yè)，2023年，2月20日，星期四①載體與表達(dá)載體的區(qū)別：二者都有標(biāo)記基因和復(fù)制原點(diǎn)兩部分DNA片段。表達(dá)載體在載體基礎(chǔ)上增加了目的基因、啟動(dòng)子、終止子三部分結(jié)構(gòu)。注意②用到的工具酶：既用到限制酶切割載體，又用到DNA連接酶將目的基因和載體拼接，兩種酶作用的化學(xué)鍵都是磷酸二酯鍵。③啟動(dòng)子、終止子對(duì)于目的基因表達(dá)必不可少。④目的基因不能單獨(dú)進(jìn)入受體細(xì)胞，必需以表達(dá)載體的方式攜帶進(jìn)去。第48頁(yè)，共82頁(yè)，2023年，2月20日，星期四基因工程技術(shù)路線第49頁(yè)，共82頁(yè)，2023年，2月20日，星期四三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞常用的受體細(xì)胞：有大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農(nóng)桿菌、酵母菌和動(dòng)植物細(xì)胞等。將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的原理：借鑒細(xì)菌或病毒侵染細(xì)胞的途徑。（一）轉(zhuǎn)化：目的基因進(jìn)入_________內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持_____和_____的過(guò)程受體細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)第50頁(yè)，共82頁(yè)，2023年，2月20日，星期四（二）方法將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法——顯微注射法——感受態(tài)細(xì)胞第51頁(yè)，共82頁(yè)，2023年，2月20日，星期四1.將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法第52頁(yè)，共82頁(yè)，2023年，2月20日，星期四（1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法①特點(diǎn)：

易感染雙子葉植物和裸子植物，對(duì)大多數(shù)單子葉植物沒(méi)有感染能力②原理：

Ti質(zhì)粒上的T-DNA可以轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，并整合到受體細(xì)胞染色體的DNA上。第53頁(yè)，共82頁(yè)，2023年，2月20日，星期四③轉(zhuǎn)化過(guò)程:Ti質(zhì)粒目的基因構(gòu)建表達(dá)載體導(dǎo)入植物細(xì)胞插入植物細(xì)胞染色DNA表達(dá)新性狀轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌第54頁(yè)，共82頁(yè)，2023年，2月20日，星期四基因槍法又稱微彈轟擊法，是利用壓縮氣體產(chǎn)生的動(dòng)力，將包裹在金屬顆粒表面的表達(dá)載體DNA打入受體細(xì)胞中，使目的基因與其整合并表達(dá)的方法。（2）基因槍法適用于單子葉植物第55頁(yè)，共82頁(yè)，2023年，2月20日，星期四（3）花粉通道法植物花粉在柱頭上萌發(fā)后，花粉管要穿過(guò)花柱直通胚囊?；ǚ酃芡ǖ婪ň褪窃谥参锸芊酆螅ǚ坌纬傻幕ǚ酃苓€未愈合前，剪去柱頭，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道進(jìn)入受體細(xì)胞。適用于被子植物第56頁(yè)，共82頁(yè)，2023年，2月20日，星期四胚珠花藥花絲柱頭花柱子房壁子房雄蕊雌蕊第57頁(yè)，共82頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2.將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞（1）方法：顯微注射法（將基因表達(dá)載體提純，用顯微儀注射到受精卵中）思考：為什么要用受精卵而不用體細(xì)胞？第58頁(yè)，共82頁(yè)，2023年，2月20日，星期四（2）操作程序:提純含目的基因表達(dá)載體取受精卵顯微注射移植到子宮受精卵發(fā)育新性狀動(dòng)物第59頁(yè)，共82頁(yè)，2023年，2月20日，星期四常用法：Ca2+處理常用菌：大腸桿菌微生物作受體細(xì)胞原因：繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對(duì)少過(guò)程：Ca2+處理大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA3.將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞思考：為什么要用Ca2+處理受體細(xì)胞？用Ca2＋處理，增加細(xì)菌細(xì)胞壁的通透性第60頁(yè)，共82頁(yè)，2023年，2月20日，星期四受體生物植物動(dòng)物微生物受體細(xì)胞導(dǎo)入方法受精卵體細(xì)胞受精卵細(xì)胞/個(gè)體農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法顯微注射技術(shù)用Ca2+處理成感受態(tài)細(xì)胞采用基因工程的方法培育抗蟲(chóng)棉，下列導(dǎo)入目的基因的作法正確的是（）

A.將毒素蛋白注射到受精卵中

B.將編碼毒素蛋白的DNA序列，與質(zhì)粒重組，導(dǎo)入細(xì)菌，用該細(xì)菌感染棉的體細(xì)胞，再進(jìn)行組織培養(yǎng)

C.將編碼毒素蛋白的DNA序列，與質(zhì)粒重組，注射到棉的子房并進(jìn)入受精卵

D.將編碼毒素蛋白的DNA序列，注射到棉受精卵中BC第61頁(yè)，共82頁(yè)，2023年，2月20日，星期四四、目的基因的檢測(cè)與鑒定檢測(cè):是否插入目的基因是否轉(zhuǎn)錄是否翻譯鑒定:分子水平鑒定個(gè)體生物學(xué)水平鑒定第62頁(yè)，共82頁(yè)，2023年，2月20日，星期四1、檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因①首先取出轉(zhuǎn)基因生物的基因組DNA；（1）方法:DNA分子雜交（2）過(guò)程:②將含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作標(biāo)記,以此做探針；③使探針和轉(zhuǎn)基因生物的基因組雜交,若顯示出雜交帶,表明染色體已插入染色體DNA中。（一）檢測(cè)第63頁(yè)，共82頁(yè)，2023年，2月20日，星期四基因探針：是一段帶有檢測(cè)標(biāo)記，且序列已知的，與目的基因互補(bǔ)的核酸序列。基因探針通過(guò)分子雜交與目的基因結(jié)合，產(chǎn)生雜交信號(hào)，能從浩翰的基因組中把目的基因顯示出來(lái)。第64頁(yè)，共82頁(yè)，2023年，2月20日，星期四DNA分子雜交示意圖采用一定的技術(shù)手段，將兩種生物的DNA分子的單鏈放在一起，如果這兩個(gè)單鏈具有互補(bǔ)的堿基序列，那么，互補(bǔ)的堿基序列就會(huì)結(jié)合在一起，形成雜合雙鏈區(qū)；在沒(méi)有互補(bǔ)堿基序列的部位，仍然是兩條游離的單鏈。第65頁(yè)，共82頁(yè)，2023年，2月20日，星期四（二）鑒定（個(gè)體生物學(xué)水平）2、檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA3、檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗蟲(chóng)鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等①方法:分子雜交方法:抗原-抗體雜交②過(guò)程:用上述探針和轉(zhuǎn)基因生物的mRNA雜交,若出現(xiàn)雜交帶,表明目的基因轉(zhuǎn)錄出了mRNA。第66頁(yè)，共82頁(yè)，2023年，2月20日，星期四提取（3）檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)方法——抗原-抗體雜交蘇云金桿菌Bt毒素蛋白將Bt毒蛋白注射小鼠體內(nèi)從小鼠血管抽出血液分離出抗Bt毒素的抗體抗體蛋白質(zhì)

出現(xiàn)雜交帶脫分化組織培養(yǎng)第67頁(yè)，共82頁(yè)，2023年，2月20日，星期四若不能表達(dá)，要對(duì)抗蟲(chóng)基因再進(jìn)行修飾。怎樣檢驗(yàn)抗蟲(chóng)基因在棉細(xì)胞內(nèi)是否表達(dá)呢？沒(méi)有抗蟲(chóng)基因的棉植株有抗蟲(chóng)基因的棉植株棉鈴蟲(chóng)蟲(chóng)沒(méi)有死蟲(chóng)被殺死沒(méi)有表達(dá)目的基因表達(dá)第68頁(yè)，共82頁(yè)，2023年，2月20日，星期四類型步驟檢測(cè)內(nèi)容方法結(jié)果顯示分子檢測(cè)第一步目的基因是否進(jìn)入受體細(xì)胞DNA分子雜交（DNA和DNA之間）是否成功顯示出雜交帶第二步目的基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNA分子雜交技術(shù)（DNA和mRNA之間）是否成功顯示出雜交帶第三步目的基因是否翻譯出蛋白質(zhì)抗原—抗體雜交是否成功顯示出雜交帶個(gè)體水平鑒定

包括抗蟲(chóng)、抗病的接種實(shí)驗(yàn)，以確定是否有抗性以及抗性的程度；基因工程產(chǎn)品與天然產(chǎn)品的活性比較，以確定功能是否相同等。目的基因的表達(dá)和檢測(cè)第69頁(yè)，共82頁(yè)，2023年，2月20日，星期四提示：

①DNA分子雜交技術(shù)首先提取受體細(xì)胞中的DNA，然后高溫解成單鏈，再與同位素標(biāo)記的DNA探針雜交；

②抗原－抗體雜交所用到的抗體是用表達(dá)出的蛋白質(zhì)注射動(dòng)物進(jìn)行免疫，產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，并提取出而來(lái)的。第70頁(yè)，共82頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第71頁(yè)，共82頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第72頁(yè)，共82頁(yè)，2023年，2月20日，星期四歸納:基因工程的基本操作程序獲取目的基因從基因文庫(kù)利用PCR化學(xué)方法人工合成構(gòu)建基因表達(dá)載體目的基因、啟動(dòng)子、終止子、標(biāo)記基因?qū)⒛康幕驅(qū)胧荏w細(xì)胞轉(zhuǎn)化法（微生物）、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法（植物）、顯微注射法（動(dòng)物）目的基因的檢測(cè)與鑒定檢測(cè)：是否插入、轉(zhuǎn)錄、翻譯第73頁(yè)，共82頁(yè)，2023年，2月20日，星期四為什么要構(gòu)建基因文庫(kù)？直接從含有目的基因的生物體內(nèi)提取不行嗎？構(gòu)建基因文庫(kù)是獲取目的基因的方法之一，并不是唯一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通過(guò)PCR方式從含有該基因的生物的DNA中，直接獲得，也可以通過(guò)反轉(zhuǎn)錄，用PCR方式從mRNA中獲得，不一定要構(gòu)建基因文庫(kù)。但如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段，或想從一種生物體內(nèi)獲得許多基因，或者想知道這種生物與另一種生物之間有多少基因不同，或者想知道一種生物在個(gè)體發(fā)育的不同階段表達(dá)的基因有什么不同，或者想得到一種生物的全基因組序列，往往就需要構(gòu)建基因文庫(kù)。第74頁(yè)，共82頁(yè)，2023年，2月20日，星期四利用大腸桿菌可以生產(chǎn)出人的胰島素，聯(lián)系前面有關(guān)細(xì)胞器功能的知識(shí)，結(jié)合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生產(chǎn)人的糖蛋白，可以用大腸桿菌嗎？有些蛋白質(zhì)肽鏈上有共價(jià)結(jié)合的糖鏈，這些糖鏈?zhǔn)窃趦?nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體上加工完成的，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體存在于真核細(xì)胞中，大腸桿菌不存在這兩種細(xì)胞器，因此，在大腸桿菌中生產(chǎn)這種糖蛋白是不可能的。尋根問(wèn)底：第75頁(yè)，共82頁(yè)，2023年，2月20日，星期四根據(jù)農(nóng)桿菌可將目的基因?qū)腚p子葉植物的機(jī)理,你能分析出農(nóng)桿菌不能將目的基因不能