分子生物學(xué)研究方法和技術(shù)

本人基本情況1984年獲湖南農(nóng)學(xué)院農(nóng)學(xué)學(xué)士學(xué)位。1987年獲中國(guó)科學(xué)院遺傳研究所理學(xué)碩士學(xué)位，專業(yè):分子遺傳。1999年11月-200２年11月受國(guó)家科技部派遣，在日本農(nóng)林水產(chǎn)省北海道國(guó)家農(nóng)業(yè)研究中心博士后特別研究員；主要從事基因定位和功能基因的篩選。１９８４－１９９９年：主要從事水稻細(xì)胞質(zhì)雄性不育機(jī)理研究；水稻分子育種技術(shù)研究。１９９９－２０１4：主要從事雜交水稻種子純度快速鑒定技術(shù)研究；水稻品種ＤＮＡ指紋研究；基因定位和分子育種技術(shù)研究?，F(xiàn)在是1頁(yè)\一共有93頁(yè)\編輯于星期三現(xiàn)在是2頁(yè)\一共有93頁(yè)\編輯于星期三

1、分子生物學(xué)的發(fā)展歷程

1871年，首次發(fā)現(xiàn)DNA（鮭精DNA）。

1943年，證明DNA為遺傳分子，而不是蛋白（1944，OTAvery）1953年，DNA雙螺旋模型提出（JDWatson（美）和FHCCrick（英），1962年或諾貝爾生理學(xué)、醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)）。從而為分子生物學(xué)這一學(xué)科奠基。

1961年，合成mRNA，破譯第一個(gè)遺傳密碼（MWNirenberg（美），1968年獲諾貝爾生理學(xué)、醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)）

——基礎(chǔ)研究的創(chuàng)新，與推動(dòng)人類文明的進(jìn)步。

（以上被稱為理論上的三大發(fā)現(xiàn)）現(xiàn)在是3頁(yè)\一共有93頁(yè)\編輯于星期三1970年，分離出第一個(gè)限制性內(nèi)切酶（WArber（瑞士），1978年獲諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)）1970年，Baltimore和Temin發(fā)現(xiàn)了逆轉(zhuǎn)錄酶——長(zhǎng)期的基礎(chǔ)研究積累迎來了突飛猛進(jìn)的高潮。1973年，Cohen把質(zhì)粒作為基因工程的載體使用——基礎(chǔ)研究向應(yīng)用研究的拓展。（以上被稱為生物工程技術(shù)的的三大發(fā)明）現(xiàn)在是4頁(yè)\一共有93頁(yè)\編輯于星期三3個(gè)事例：（1）1976年，重組DNA成功（HBoyer和SNColen，1981年獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)）——勇敢的科學(xué)精神。（2）1982年，美國(guó)一制藥公司在2000升發(fā)酵液中提取出100克精制胰島素。相當(dāng)于從1600磅動(dòng)物胰腺中的提取量——效率、成本、質(zhì)量、競(jìng)爭(zhēng)。（3）荷蘭最早把分子生物學(xué)產(chǎn)品“豬牛痢疾疫苗”投放市場(chǎng)，比以上美國(guó)的胰島素早半年——后來居上?，F(xiàn)在是5頁(yè)\一共有93頁(yè)\編輯于星期三人類對(duì)生命現(xiàn)象的認(rèn)識(shí)

20世紀(jì)個(gè)體→染色體→基因→DNA→SNP生物與非生物間的界限消失了！21世紀(jì)基因克隆，拼結(jié)→組裝植物、動(dòng)物、嬰兒！現(xiàn)在是6頁(yè)\一共有93頁(yè)\編輯于星期三數(shù)、理、化相關(guān)學(xué)科生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)滲透交叉近代生物學(xué)生物學(xué)個(gè)性共性宏觀生物學(xué)（生態(tài)學(xué)為核心）微觀生物學(xué)（分子生物學(xué)為核心）細(xì)胞水平分子水平結(jié)構(gòu)生物學(xué)，發(fā)育生物學(xué)，神經(jīng)生物學(xué)等新興學(xué)科發(fā)展生物多樣性研究資源保護(hù)與利用人類生態(tài)環(huán)境的保護(hù)工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)持續(xù)發(fā)展現(xiàn)代生物學(xué)的發(fā)展現(xiàn)在是7頁(yè)\一共有93頁(yè)\編輯于星期三分子生物學(xué)分子結(jié)構(gòu)生物學(xué)分子發(fā)育生物學(xué)分子神經(jīng)生物學(xué)分子育種學(xué)分子腫瘤學(xué)分子細(xì)胞生物學(xué)分子免疫學(xué)分子病毒學(xué)分子生理學(xué)分子考古學(xué)分子遺傳學(xué)分子數(shù)量遺傳學(xué)分子生態(tài)學(xué)分子進(jìn)化學(xué)…………….分子生物學(xué)滲透到生物學(xué)幾乎所有學(xué)科分子生物學(xué)成為現(xiàn)代生命科學(xué)的共同語言

分子生物學(xué)的延伸現(xiàn)在是8頁(yè)\一共有93頁(yè)\編輯于星期三2分子生物學(xué)的概念2.1分子生物學(xué)的定義2.2分子生物學(xué)的三大原則2.3分子生物學(xué)研究的三大主要領(lǐng)域2.4分子生物學(xué)發(fā)展的三大支撐學(xué)科現(xiàn)在是9頁(yè)\一共有93頁(yè)\編輯于星期三2.1分子生物學(xué)的定義

Molecularbiologyisthestudyofgenesandtheiractivitiesatthemolecularlevel,includingtranscription,translation,DNAreplication,recombinationandtranslocation.分子生物學(xué)是研究核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子的形態(tài)、結(jié)構(gòu)特征及其重要性、規(guī)律性和相互關(guān)系的科學(xué)，是人類從分子水平上真正揭示生物世界的奧秘，由被動(dòng)地適應(yīng)自然界轉(zhuǎn)向主動(dòng)地改造和重組自然界的基礎(chǔ)學(xué)科?，F(xiàn)在是10頁(yè)\一共有93頁(yè)\編輯于星期三分子生物學(xué)與生物化學(xué)之間的關(guān)系與區(qū)別分子生物學(xué)—研究生物大分子的結(jié)構(gòu)、功能及信息傳遞過程，從分子水平研究生命現(xiàn)象。生物化學(xué)—生物體內(nèi)的化學(xué)運(yùn)動(dòng)，包括化學(xué)組成、變化、結(jié)構(gòu)與功能，生物分子間的物質(zhì)與能量轉(zhuǎn)換過程。分子生物學(xué)≠生物化學(xué)現(xiàn)在是11頁(yè)\一共有93頁(yè)\編輯于星期三★構(gòu)成生物大分子的單體是相同的★生物遺傳信息的表達(dá)的中心法則相同DNARNApolypeptidesproteincharacter高級(jí)結(jié)構(gòu)生物大分子之間的互作個(gè)性2.2分子生物學(xué)的三大原則共同的核酸語言共同的蛋白質(zhì)★生物大分子單體的排列（核苷酸，氨基酸）現(xiàn)在是12頁(yè)\一共有93頁(yè)\編輯于星期三結(jié)構(gòu)生物學(xué)基因分子生物學(xué)生物技術(shù)理論論與應(yīng)用2.3分子生物學(xué)研究的三大主要領(lǐng)域生物大分子的結(jié)構(gòu)與功能生物大分子之間的互作DNA—proteinHormone—receptorEnzyme--substrate基因的概念基因的結(jié)構(gòu)基因的復(fù)制基因的表達(dá)基因的重組基因的突變基因工程細(xì)胞工程酶工程發(fā)酵工程蛋白質(zhì)工程狹義的分子生物學(xué)——分子遺傳學(xué)現(xiàn)在是13頁(yè)\一共有93頁(yè)\編輯于星期三2.4分子生物學(xué)發(fā)展的三大支撐學(xué)科現(xiàn)在是14頁(yè)\一共有93頁(yè)\編輯于星期三1839-1847年MatthiasSchleiden&TheodorSchwann細(xì)胞的化學(xué)組成，細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)，細(xì)胞骨架，生物大分子在細(xì)胞中的定位及功能分子生物學(xué)發(fā)展的三大支撐學(xué)科之一生物體由細(xì)胞組成所有組織的最基本單元----形狀相似，高度分化的細(xì)胞細(xì)胞的發(fā)生與形成是生物界普遍和永久的規(guī)律CytologyMolecularCellbiology

現(xiàn)在是15頁(yè)\一共有93頁(yè)\編輯于星期三GregorMendel1864年GeneticsMolecularGeneticsGenestructureGeneduplicationGeneexpressionGenerecombinationGenemutation

分子生物學(xué)發(fā)展的三大支撐學(xué)科之二遺傳因子假說Genetics現(xiàn)在是16頁(yè)\一共有93頁(yè)\編輯于星期三BiochemistryNucleicAcidChemistryProteinChemistry(1936年JamesSumner)分子生物學(xué)發(fā)展的三大支撐學(xué)科之三Enzymaticnatureofcrystalline（晶體）ProteinBiochemistry現(xiàn)在是17頁(yè)\一共有93頁(yè)\編輯于星期三321世紀(jì)分子生物學(xué)展望3.1自然科學(xué)歷史舞臺(tái)角色的重大變化3.2未來生物學(xué)形成的新熱點(diǎn)及領(lǐng)域3.3應(yīng)用生物學(xué)發(fā)展3.4

21世紀(jì)—生命科學(xué)的世紀(jì)現(xiàn)在是18頁(yè)\一共有93頁(yè)\編輯于星期三3.1

自然科學(xué)歷史舞臺(tái)角色將發(fā)生重大變化引導(dǎo)自然科學(xué)向物質(zhì)運(yùn)動(dòng)最高層次突破的帶頭學(xué)科物理學(xué)

生物學(xué)現(xiàn)在是19頁(yè)\一共有93頁(yè)\編輯于星期三3.2未來生物學(xué)形成的新熱點(diǎn)及領(lǐng)域現(xiàn)在是20頁(yè)\一共有93頁(yè)\編輯于星期三生物大分子的高級(jí)三維結(jié)構(gòu)與功能的統(tǒng)一生物大分子之間的互作基因表達(dá)，基因互作器官發(fā)生胚胎形成個(gè)體發(fā)育結(jié)構(gòu)生物學(xué)（StructuralBiology）

分子發(fā)育生物學(xué)（MolecularDevelopingBiology）現(xiàn)在是21頁(yè)\一共有93頁(yè)\編輯于星期三個(gè)體細(xì)胞分子整體論細(xì)胞中的定位細(xì)胞分化神經(jīng)基質(zhì)神經(jīng)通道信息傳遞大分子克隆一級(jí)結(jié)構(gòu)分析三維結(jié)構(gòu)重建思維感情記憶科學(xué)解釋分子細(xì)胞生物學(xué)(MolecularCellBiology)分子神經(jīng)生物學(xué)（MolecularNeurobiology）現(xiàn)在是22頁(yè)\一共有93頁(yè)\編輯于星期三計(jì)算機(jī)語言

分辨，提取，分析，比較，預(yù)測(cè)生物信息

生物大分子的結(jié)構(gòu)與功能信息

基因的識(shí)別與鑒定基因功能信息的提取與證實(shí)基因表達(dá)譜的繪制(microarray)蛋白質(zhì)水平上基因互作的探測(cè)

功能基因組學(xué)(FunctionalGenomicsorpost—Genomics)

生物信息學(xué)(Bioinformatics)現(xiàn)在是23頁(yè)\一共有93頁(yè)\編輯于星期三3.3應(yīng)用生物學(xué)發(fā)展

生物技術(shù)

診斷試劑治療藥物植物品種環(huán)境工程食品加工生物塑料廢物處理再生能源……現(xiàn)在是24頁(yè)\一共有93頁(yè)\編輯于星期三3.421世紀(jì)——生命科學(xué)的世紀(jì)現(xiàn)在是25頁(yè)\一共有93頁(yè)\編輯于星期三二十一世紀(jì)生命科學(xué)的世紀(jì)現(xiàn)在是26頁(yè)\一共有93頁(yè)\編輯于星期三分子生物學(xué)理論的突破生物技術(shù)的有效應(yīng)用新舊技術(shù)的有機(jī)結(jié)合人口與糧食能源與資源環(huán)境與生態(tài)健康與疾病現(xiàn)在是27頁(yè)\一共有93頁(yè)\編輯于星期三更加深刻更為明確闡明生物大系統(tǒng)

生長(zhǎng)發(fā)育

遺傳變異

繁殖死亡

生命本質(zhì)更加主動(dòng)更為有效利用生物技術(shù)

改造生物

創(chuàng)造生物

新興產(chǎn)業(yè)

推動(dòng)工，農(nóng)，醫(yī)的發(fā)展

學(xué)習(xí)分子生物學(xué)的意義現(xiàn)在是28頁(yè)\一共有93頁(yè)\編輯于星期三第一章RNA的分離純化現(xiàn)在是29頁(yè)\一共有93頁(yè)\編輯于星期三主要內(nèi)容

前言一、核酸分離、純化原則（一）保持核酸分子一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性（二）防止核酸的生物降解二、分離提取核酸的主要步驟（一）細(xì)胞的破碎（二）核蛋白的解聚、變性蛋白的去除（三）核酸的沉淀

(四）核酸的濃度測(cè)定（五）核酸的保存現(xiàn)在是30頁(yè)\一共有93頁(yè)\編輯于星期三

核酸（nucleicacid）是遺傳信息的攜帶者，是基因表達(dá)的物質(zhì)基礎(chǔ)。無論是進(jìn)行核酸結(jié)構(gòu)還是功能研究，首先需要對(duì)核酸進(jìn)行分離和純化。核酸樣品質(zhì)量將直接關(guān)系到實(shí)驗(yàn)的成敗。前言現(xiàn)在是31頁(yè)\一共有93頁(yè)\編輯于星期三一、核酸分離、純化原則（一）保持核酸分子一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性

1意義遺傳信息全部?jī)?chǔ)存在一級(jí)結(jié)構(gòu)之中，核酸的—級(jí)結(jié)構(gòu)還決定其高級(jí)結(jié)構(gòu)的形式以及和其他生物大分子結(jié)合的方式。

2分離核酸原則：

1）溫度不要過高；

2）控制一定的pH值范圍(pH值5-9);

3）保持一定的離子強(qiáng)度;

4）減少物理因素對(duì)核酸降解的機(jī)械剪切力.現(xiàn)在是32頁(yè)\一共有93頁(yè)\編輯于星期三（二）防止核酸的生物降解

細(xì)胞內(nèi)或外來的各種核酸酶能消化核酸鏈中的磷酸二酯鍵，破壞核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)。所用器械和一些試劑需高溫滅菌，提取緩沖液中需加核酸酶抑制劑?，F(xiàn)在是33頁(yè)\一共有93頁(yè)\編輯于星期三1.DNA酶抑制劑1）金屬離子螯合劑：

DNA酶需要金屬二價(jià)離子Mg2+、Ca2+的激活，因此使用金屬二價(jià)離子螯合劑，可抑制DNA酶活性。如EDTA-Na2(乙二胺四乙酸二鈉)、8-羥基喹啉；2）陰離于型表面活性劑：如SDS，該試劑除對(duì)核酸酶有抑制作用外，還能使蛋白質(zhì)變性，并與變性蛋白結(jié)合成帶負(fù)電荷的復(fù)合物，該復(fù)合物在高鹽溶液中沉淀?，F(xiàn)在是34頁(yè)\一共有93頁(yè)\編輯于星期三2.RNA酶（RNAase)抑制劑

RNAase分布廣泛，極易污染樣品，而且耐高溫、耐酸、耐堿，不宜失活。

(1)皂土（bentonite

）作用機(jī)制：皂土帶負(fù)電荷，能吸附RNase，使其失活。現(xiàn)在是35頁(yè)\一共有93頁(yè)\編輯于星期三

(2)DEPC(二乙基焦碳酸鹽)(C2H5OCOOCOOC2H5)

粘性液體，很強(qiáng)的核酸酶抑制劑。

作用機(jī)制：與蛋白質(zhì)中His結(jié)合使蛋白變性。

使用注意：

1）DEPC也能破壞單鏈核酸中大部分腺嘌呤環(huán)。但濃度比使蛋白質(zhì)變性的濃度大100～1000倍。

2）容易降解，保存在4℃或液氮中；

3）提RNA時(shí)，0.1%DEPC浸泡器皿37℃2h。

4）劇毒。現(xiàn)在是36頁(yè)\一共有93頁(yè)\編輯于星期三（3)肝素（4）復(fù)合硅酸鹽（Macaloid)（5）RNase阻抑蛋白（RNasin）（6）氧釩核糖核苷復(fù)合物(Vanadyl-RibonucleosideComplex,VRC)現(xiàn)在是37頁(yè)\一共有93頁(yè)\編輯于星期三二分離提取核酸的主要步驟（一）細(xì)胞的破碎

1高速組織搗碎機(jī)搗碎

2玻璃勻漿器勻漿

3超聲波處理法

4液氮研磨法

5化學(xué)處理法(SDS、吐溫80等）

6生化法（溶菌酶、纖維素酶等）現(xiàn)在是38頁(yè)\一共有93頁(yè)\編輯于星期三（二）核蛋白的解聚、變性蛋白的去除核酸與蛋白質(zhì)的結(jié)合力主要是正負(fù)靜電吸力(核酸與堿性蛋白的結(jié)合)、氫鍵和非極性的范德華力。分離核酸最困難的是將與核酸緊密結(jié)合的蛋白質(zhì)分開，同時(shí)避免核酸降解?，F(xiàn)在是39頁(yè)\一共有93頁(yè)\編輯于星期三

常用方法：

1.加入濃鹽溶液（如NaCl）核酸-蛋白質(zhì)加入NaCl后，破壞靜電吸力，使氫鍵破壞，核蛋白解聚；

2.加入SDSSDS除有破胞和抑制核酸酶的作用外，還具有使核酸從蛋白質(zhì)上游離出來的功能；

現(xiàn)在是40頁(yè)\一共有93頁(yè)\編輯于星期三

3.酚/氯仿抽提

酚／氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果，并對(duì)核酸酶有抑制作用。氯仿比重大，能加速有機(jī)相與水相分層，減少殘留在水相中的酚，同時(shí)氯仿具有去除植物色素和蔗糖的作用。在酚/氯仿抽提核酸提取液時(shí)，需要振搖，為防止起泡和促使水相與有機(jī)相的分離，再加上一定量的異戊醇（酚：氯仿：異戊醇=25：24：1）?，F(xiàn)在是41頁(yè)\一共有93頁(yè)\編輯于星期三

1）使用注意酚通常是透明無色的結(jié)晶，如果酚結(jié)晶呈現(xiàn)粉紅色或黃色，表明其中含有酚的氧化產(chǎn)物，例如醌、二酸等。變色的酚不能用于核酸抽提實(shí)驗(yàn)，因?yàn)檠趸锟善茐暮怂岬牧姿岫ユI。

2）安全操作酚腐蝕性很強(qiáng)，并可引起嚴(yán)重的灼傷，操作時(shí)應(yīng)戴手套。使用酚時(shí)應(yīng)注意現(xiàn)在是42頁(yè)\一共有93頁(yè)\編輯于星期三（三）核酸的沉淀

沉淀是濃縮核酸最常用的方法。優(yōu)點(diǎn)：①改變核酸的溶解緩沖液；②重新調(diào)整核酸的濃度；③去除溶液中某些鹽離子與雜質(zhì)?，F(xiàn)在是43頁(yè)\一共有93頁(yè)\編輯于星期三1.核酸沉淀的鹽類及濃度現(xiàn)在是44頁(yè)\一共有93頁(yè)\編輯于星期三2.有機(jī)沉淀劑

（1）乙醇優(yōu)點(diǎn)：

對(duì)鹽類沉淀少，沉淀中所含跡量乙醇易揮發(fā)除去，不影響以后實(shí)驗(yàn)。缺點(diǎn)：

需要量大，一般要求低溫操作?，F(xiàn)在是45頁(yè)\一共有93頁(yè)\編輯于星期三（2）異丙醇優(yōu)點(diǎn)：需體積小，速度快，適于濃度低、體積大的DNA樣品沉淀。一般不需低溫長(zhǎng)時(shí)間放置。缺點(diǎn)：易使鹽類、蔗糖與DNA共沉淀．異丙醇難以揮發(fā)除去。所以，最后用70％乙醇漂洗數(shù)次?，F(xiàn)在是46頁(yè)\一共有93頁(yè)\編輯于星期三（3）聚乙二醇（PEG）優(yōu)點(diǎn)：可用不同濃度的PEG選擇沉淀不同相對(duì)分子質(zhì)量的DNA片段。應(yīng)用6000相對(duì)分子質(zhì)量的PEG進(jìn)行DNA沉淀時(shí)，使用濃度與DNA片段的大小成反比。注意：PEG沉淀一般需要加入0.5mol/L的NaCl或10mmol/L的MgCl2。要除去DNA沉淀中PEG。現(xiàn)在是47頁(yè)\一共有93頁(yè)\編輯于星期三（4）精胺

精胺不是有機(jī)溶劑，但可快速有效沉淀DNA。

原理是：精胺與DNA結(jié)合后，使DNA在溶液中結(jié)構(gòu)凝縮而發(fā)生沉淀，并可使單核苷酸和蛋白質(zhì)雜質(zhì)與DNA分開，達(dá)到純化DNA的目的?，F(xiàn)在是48頁(yè)\一共有93頁(yè)\編輯于星期三3.核酸沉淀的溫度和時(shí)間一般強(qiáng)調(diào)，核酸沉淀在低溫長(zhǎng)時(shí)間下進(jìn)行。低溫長(zhǎng)時(shí)間沉淀，易導(dǎo)致鹽與DNA共沉淀，影響以后的實(shí)驗(yàn)。一般使用0℃冰水，10-15min，DNA樣品足可達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。現(xiàn)在是49頁(yè)\一共有93頁(yè)\編輯于星期三(四）核酸的濃度測(cè)定

1.紫外分光光度法測(cè)定DNA和RNA的含量

前提：核酸樣品要較純，無顯著蛋白質(zhì)、酚、瓊脂糖及其他核酸污染。測(cè)定濃度應(yīng)大于0.25μg/ml。

結(jié)論：在波長(zhǎng)260nm紫外光下，1OD值的吸光度相當(dāng)于雙鏈DNA濃度為50μg/ml；單鏈DNA為37μg/ml；RNA為40ug/ml?，F(xiàn)在是50頁(yè)\一共有93頁(yè)\編輯于星期三紫外分光光度計(jì)測(cè)定核酸濃度的操作步驟a．吸取一定量的DNA樣品或RNA樣品，加水至特定體積后，轉(zhuǎn)入分光光度計(jì)的石英比色杯中。b．分光光度計(jì)先用一定量的水校正零點(diǎn)。c．測(cè)定待測(cè)樣品在230nm、260nm和280nm的OD值。d．計(jì)算濃度。

雙鏈DNA樣品濃度(μg/μl)=OD260×核酸稀釋倍數(shù)×50；RNA樣品濃度(μg/μl)=OD260×核酸稀釋倍數(shù)×40。e．分析純度?，F(xiàn)在是51頁(yè)\一共有93頁(yè)\編輯于星期三A：測(cè)DNA：

純的DNA樣品OD260/OD280應(yīng)為1.8，OD260m／OD230應(yīng)大于2.0。1)OD260/OD280大于1.9時(shí)，表明有RNA污染。2)小于1.6時(shí)，表明樣品中存在蛋白質(zhì)或酚污染；3)OD260/OD230小于2.0時(shí)，表明溶液中有殘存的鹽和小分子雜質(zhì)，如核苷酸、氨基酸、酚等。注：可能出現(xiàn)既含蛋白質(zhì)又含RNA的DNA溶液比值為1.8的情況。測(cè)定結(jié)果分析現(xiàn)在是52頁(yè)\一共有93頁(yè)\編輯于星期三B：測(cè)RNA

純的RNA樣品其OD260／OD280應(yīng)介于之間，OD260/OD230比值應(yīng)大于2.0。1）若RNA樣品OD260/OD280比值太小，說明有蛋白質(zhì)或酚的污染；2）比值大于2.0時(shí)，可能被異硫氰酸胍等污染；3）OD260/OD230比值小于2.0時(shí)表明有小分子及鹽存在?，F(xiàn)在是53頁(yè)\一共有93頁(yè)\編輯于星期三

2.溴乙錠熒光法測(cè)定核酸的含量

如果DNA和RNA的量很少或有較多雜質(zhì)的情況下，其含量可用溴乙錠熒光法測(cè)定。原理：DNA、RNA本身并不產(chǎn)生熒光，但在熒光染料溴乙錠(EB)嵌入堿基平面之間后，DNA樣品在紫外光激發(fā)下，可發(fā)出紅色熒光，熒光強(qiáng)度與核酸含量成正比。使用一系列已知的不同濃度DNA溶液作標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，可比較出被測(cè)DNA溶液濃度。

注意：此法的比較主要基于目測(cè)，是估計(jì)水平?，F(xiàn)在是54頁(yè)\一共有93頁(yè)\編輯于星期三（五）核酸的保存對(duì)DNA保存：①DNA樣品溶于pH8.0的TE，4℃或-20℃保存；

②長(zhǎng)期保存樣品中可加入1滴氯仿。對(duì)RNA

保存：①RNA樣品溶于0.3mol/LNaAc(pH5.2)或雙蒸滅菌水中，-70℃保存;②

長(zhǎng)期保存可以沉淀形式貯于乙醇中;

③在RNA溶液中，加1滴0.2mol/LVRC(氧釩核糖核苷復(fù)合物)凍貯于-70℃,可保存數(shù)年?，F(xiàn)在是55頁(yè)\一共有93頁(yè)\編輯于星期三總RNA提取目的1．了解某一特定組織或細(xì)胞某一特定mRNA轉(zhuǎn)錄量的變化，如PCR、Northernblot等。2．了解某一特定組織或細(xì)胞全部mRNA轉(zhuǎn)錄量的變化，如DD-PCR、基因芯片等。3．獲得某一特定組織或細(xì)胞全部mRNA，以便建立cDNA庫(kù)等。4．獲得某一特定組織或細(xì)胞全部RNA。以上工作的前提是制備純凈且完整的RNA。現(xiàn)在是56頁(yè)\一共有93頁(yè)\編輯于星期三根據(jù)生物學(xué)“中心法則”原理，基因的表達(dá)包括轉(zhuǎn)錄與翻譯兩個(gè)階段。其中，由DNA到RNA的轉(zhuǎn)錄過程受到各種因素的調(diào)節(jié)，其調(diào)節(jié)水平反映出某種或某些特定的因素對(duì)相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)節(jié)能力。RNA主要由rRNA（占總量的80-85％），tRNA和核內(nèi)小分子RNA（占總量的10-15％）以及mRNA（占總量的1-5％）所構(gòu)成。理論上認(rèn)為每克組織（或108個(gè)培養(yǎng)細(xì)胞）可提取5-10mgRNA?，F(xiàn)在是57頁(yè)\一共有93頁(yè)\編輯于星期三提取總RNA的方法有多種，比如：1)酚/SDS法

2）采用Trizol試劑盒或類似的方法，稱為一步法，方便而快捷。缺點(diǎn)是RNA的獲得量偏低，質(zhì)量不夠純凈。3）超離心方法，可以獲得豐富且質(zhì)量高的RNA。缺點(diǎn)是實(shí)驗(yàn)時(shí)間比較長(zhǎng)，要求離心過夜。4）其它一些試劑盒，主要是利用某些特定的介質(zhì)吸附RNA，洗去其它雜質(zhì)，最后洗脫純凈的RNA?？梢栽诙虝r(shí)間內(nèi)獲得純凈的RNA。但是價(jià)格比較昂貴。現(xiàn)在是58頁(yè)\一共有93頁(yè)\編輯于星期三植物總RNA提取(酚/SDS法

)現(xiàn)在是59頁(yè)\一共有93頁(yè)\編輯于星期三材料

液氮研磨緩沖液：0.18mol/L

Tris0.09mol/LLiCL4.5mmol/LEDTA1%（W/V）SDS

用HCL調(diào)PH至8.2現(xiàn)在是60頁(yè)\一共有93頁(yè)\編輯于星期三1mol/LTris的配法：在800雙蒸水中溶解121克Tris堿，用濃鹽酸調(diào)PH值，混勻后加水至1升。現(xiàn)在是61頁(yè)\一共有93頁(yè)\編輯于星期三

要獲得所需PH值的1M

TrisHCL，可通過將一定數(shù)量的10MHCL和1升Tris堿混合，如下表所示:

現(xiàn)在是62頁(yè)\一共有93頁(yè)\編輯于星期三0.5MEDTA的配制：在700ML雙蒸水中溶解186.1克Na2EDTA.2H2O，用NaOH調(diào)PH8.0（1000ML0．5MEDTA需加入20克NaOH），補(bǔ)加雙蒸水至1升。現(xiàn)在是63頁(yè)\一共有93頁(yè)\編輯于星期三TLE緩沖液平衡酚TLE溶液:0.2mol/L

Tris0.1mol/LLiCL5mmol/LEDTA用HCL調(diào)PH至8.2，用等體積的PH8.0的TLE溶液抽提，然后再用TLE溶液至少抽提2次現(xiàn)在是64頁(yè)\一共有93頁(yè)\編輯于星期三氯仿：異戍醇（24：1）8MOL/L和2MOL/LLICL溶液（DEPC處理，焦碳酸二乙酯）3MOL/L乙酸鈉（DEPC處理），將408克NaAc.3H2O溶于水，用3MOL/L乙酸調(diào)PH5.2，補(bǔ)加水至1升95%乙醇DEPC處理水現(xiàn)在是65頁(yè)\一共有93頁(yè)\編輯于星期三試驗(yàn)步驟：1、用液氮冷卻研缽，取15g低溫冷凍的植物組織，迅速置于研缽中，不時(shí)加入液氮以防止研磨過程中葉片融化，充分研磨后，立即轉(zhuǎn)移到一個(gè)盛有150ML研磨緩沖液和50mlTLE緩沖液平衡酚的500ml離心管中。2、加入50ml氯仿：異戍醇，于50℃加熱20min。18000g,4℃，離心20min?，F(xiàn)在是66頁(yè)\一共有93頁(yè)\編輯于星期三3、將上層水相轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中，加入50mlTLE緩沖液平衡酚的500ml，混勻，再加入50ml氯仿：異戍醇，18000g,4℃，離心20min?，F(xiàn)在是67頁(yè)\一共有93頁(yè)\編輯于星期三4、用TLE緩沖液平衡酚抽提水相，直至兩面相間界面干凈為止，水相再以氯仿抽提。5、吸取上清液，加1/3體積的8M/LLiCL混合至終濃度為2M/L，4℃沉淀過夜，然后15000g，4℃，離心20min，沉淀以2-3ml2M/LLiCL溶液沖洗。6、沉淀以5ml水重溶，加入1/3體積的8M/LLiCL混合至終濃度為2M/L，于4℃深沉RNA兩小時(shí)以上。現(xiàn)在是68頁(yè)\一共有93頁(yè)\編輯于星期三7、

15000g，4℃，離心20min，沉淀用2ml2M/LLiCL溶液沖洗，重溶于2ml雙蒸水，加入200ul3MOL/L乙酸鈉溶液和5.5ml無水乙醇，-20℃沉淀過夜或在干冰/乙醇中沉淀30min。8、18000g,4℃，離心15min，沉淀用1ml雙蒸水溶解，取10ul稀釋至1ml測(cè)OD260和OD280現(xiàn)在是69頁(yè)\一共有93頁(yè)\編輯于星期三Trizol試劑盒方法原理本實(shí)驗(yàn)類似于“異硫氰酸胍-酚-氯仿一步法”。方法采用強(qiáng)RNA酶抑制劑異硫氰酸胍，抑制RNA酶的活性，防止RNA的降解；酚/氯仿使蛋白質(zhì)變性。離心后，RNA選擇性地進(jìn)入無DNA和蛋白質(zhì)的水相。之后通過異丙醇沉淀，75%乙醇洗滌等，便可得到較為完整與純潔的總RNA?，F(xiàn)在是70頁(yè)\一共有93頁(yè)\編輯于星期三實(shí)驗(yàn)步驟1．取50毫克植物細(xì)嫩組織，加入1mlTrizol液，剪碎，快速勻漿。2．22℃，靜置5min。3．加入氯仿0.2ml，顛倒15s。4．22℃，靜置3min。5．離心：4℃×15000轉(zhuǎn)/分×15min。6．取上清液0.45ml。7．加入0.45ml異丙醇，混勻?，F(xiàn)在是71頁(yè)\一共有93頁(yè)\編輯于星期三8．22℃，靜置10min。9．離心：4℃×15000轉(zhuǎn)/分×10min。10．棄上液。11．加入1ml4℃75%乙醇。12．離心：4℃×10000轉(zhuǎn)/分×5min。13．棄上液，真空干燥5min。14．用高壓消毒過的去離子水25ul水冰上溶解，-70℃保存。15．紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA的含量：現(xiàn)在是72頁(yè)\一共有93頁(yè)\編輯于星期三取樣本5ul加入石英比色杯內(nèi)，加入蒸水1ml，充分混勻。與蒸鎦水對(duì)照。讀260nm、280nm兩個(gè)測(cè)得值，記錄。計(jì)算：OD260為1時(shí)，為40ugRNA，所以計(jì)算如下：樣本RNA含量（ug/ul）=OD260*200*40/1000當(dāng)OD值260/280<1.8時(shí)，提示有蛋白或酚的污染?，F(xiàn)在是73頁(yè)\一共有93頁(yè)\編輯于星期三實(shí)驗(yàn)結(jié)果得到比較純凈的植物組織總RNA。分光光度計(jì)讀數(shù)260/280值為1.85±0.04?，F(xiàn)在是74頁(yè)\一共有93頁(yè)\編輯于星期三植物RNA提取中的一些特殊方法1、多酚類植物的RNA提取：

蘋果、棉花等多酚類植物提取RNA用TRIZOL一般提不出來。用下述方法提取的RNA純度不是特別高,但是用作northern足夠。（1）1.5ml離心管用液N2冷凍后加入0.1g樣品,立即加入500ul酚氯仿,再加入500ul提取buffer,劇烈振蕩1-2min,冰上放置5min.

（2）4℃12000rpm離心15min,上清轉(zhuǎn)入新管,加氯仿異戊醇抽提一次

（3）取600ul異丙醇,-20℃沉淀20min.

（4）12000rpm離心10min

（5）沉淀用70%乙醇洗

（6）8000rpm5min

（7）沉淀晾干,溶于30ulDEPC水

現(xiàn)在是75頁(yè)\一共有93頁(yè)\編輯于星期三2、纖維組織：

心臟/骨骼肌等纖維組織提取RNA的關(guān)鍵在于徹底破碎組織。這些組織細(xì)胞密度低，單位重量的組織RNA的含量就少，建議用盡可能多的起始量。使用TRNzol法可以提取纖維組織終RNA，由于纖維組織終RNA含量較少，可按照增加的起始量成比例增加TRNzol的用量，并在液氮中將組織徹底磨碎，同時(shí)適當(dāng)減少溶解RNA的溶液體積?，F(xiàn)在是76頁(yè)\一共有93頁(yè)\編輯于星期三3、蛋白/脂肪含量高的組織：

動(dòng)物的腦和某些特殊的植物組織中，脂肪或者蛋白的含量很高，可以采用TRNzol來提取此類樣品中的RNA。在該提取過程中，用氯仿抽提后，如上清仍含白色絮狀物，必須用氯仿再次對(duì)上清進(jìn)行抽提。使用TRNzol提取脂肪含量高的組織中RNA時(shí)，使用氯仿抽提后會(huì)分成油滴、水相（含RNA）、DNA中間層、有機(jī)相四層，應(yīng)用移液管小心吸取水相液體，避免吸到油滴層和DNA層。現(xiàn)在是77頁(yè)\一共有93頁(yè)\編輯于星期三4、核酸/RNase含量高的組織：

脾、胸腺、胰臟等組織的核酸和核酸酶含量很高，可以在液氮中碾磨組織，再快速勻漿。如果裂解液太粘稠（因?yàn)楹怂岷扛叩木壒剩?，?氯仿抽提不能有效分層，可以加入更多裂解液以解決此類問題。如果加入乙醇后馬上有白色沉淀形成則表明有DNA污染，可以在核酸溶解后用酸性酚/氯仿再次抽提，去除DNA污染。

現(xiàn)在是78頁(yè)\一共有93頁(yè)\編輯于星期三5、植物組織和真菌組織：植物組織和真菌組織比動(dòng)物組織更為復(fù)雜，因此為了避免出現(xiàn)內(nèi)源酶作用使RNA降解的現(xiàn)象，一般選擇在液氮條件下對(duì)植物或者真菌材料進(jìn)行碾磨。如果降解問題不能解決，基本上是由于樣品中的內(nèi)含雜質(zhì)導(dǎo)致。許多植物和真菌中的內(nèi)含雜質(zhì)如多糖、多酚等都會(huì)殘留，因?yàn)檫@些雜質(zhì)分子與RNA有一些相似性，可以與RNA同時(shí)沉淀或者吸附，因此在植物和真菌組織的RNA提取過程中，需要用一些特別的步驟或者特別的試劑（RNAplant）來去除多糖多酚等雜質(zhì)的干擾和污染?，F(xiàn)在是79頁(yè)\一共有93頁(yè)\編輯于星期三病毒RNA提取方法異硫氰酸胍提取法:

實(shí)驗(yàn)步驟：

1、取200ul樣品數(shù)+陰性對(duì)照+陽性對(duì)照個(gè)1.5ml滅菌eppendorf管。

2、加600ul異硫氰酸胍，然后加入對(duì)照和樣品，再加200ul氯仿，顛倒混勻。

3、13000rpm離心15min。

4、在第3步離心快結(jié)束時(shí)，另取同樣多eppendorf管，加入400ul-20度預(yù)冷的異丙醇?，F(xiàn)在是80頁(yè)\一共有93頁(yè)\編輯于星期三5、取第3步離心的上清（一定不要吸取到中間白色層，第3步離心結(jié)束往外拿的時(shí)候，管子盡量不要傾斜）轉(zhuǎn)移到第4步準(zhǔn)備的管中，顛倒混勻。

6、13000rpm離心15min，輕輕倒去上清；在吸水紙上盡量沾干液體。

7、加600ul75％乙醇，顛倒數(shù)次以洗滌殘存異丙醇。

現(xiàn)在是81頁(yè)\一共有93頁(yè)\編輯于星期三8、13000rpm離心15min，輕輕倒去上清；在吸水紙上盡量沾干液體。9、4000rpm離心10s，將管壁殘存液體甩到底部，用微量槍頭吸干，室溫干燥2－3min（不可過分干燥，防止下一步RNA不溶解）。10、加入20ulDEPE水(加入depc的純水高壓后的水即為DEPE水)，輕輕混勻溶解RNA。2000rpm離心5s，冰上保存?zhèn)溆茫ㄗ詈?小時(shí)內(nèi)使用，以免RNA降解）。現(xiàn)在是82頁(yè)\一共有93頁(yè)\編輯于星期三RNA提取注意事項(xiàng)一些RNA提取方法，在進(jìn)行具體實(shí)驗(yàn)時(shí)，應(yīng)根據(jù)研究對(duì)象的性質(zhì)，提取核酸的用途而對(duì)上述方法在操作步驟和試劑使用量上作一定的修改。

1、在核酸提取時(shí)，為了增加細(xì)胞的裂解度，增加核蛋白復(fù)合體破碎度，以釋放更多的游離核酸，在操作中常要用到溶菌酶和蛋白酶K，在確保沒有核酸水解酶存在的前提下，酶反應(yīng)時(shí)間越長(zhǎng)越好。

現(xiàn)在是83頁(yè)\一共有93頁(yè)\編輯于星期三2、有時(shí)在使用蛋白酶時(shí)，為了抑制核酸水解酶的降解作用，可在蛋白酶緩沖液中用終濃度5mM的EDTA代替NaCL，并且可將反應(yīng)溫度提高到50－60℃，并將反應(yīng)時(shí)間縮短到15－25min，但酶用量必須提高10－20倍。溶菌酶使用時(shí)緩沖液中需加EDTA，因游離金屬離子對(duì)酶有抑制。

現(xiàn)在是84頁(yè)\一共有93頁(yè)\