基因工程與食品產(chǎn)業(yè)

基因工程與食品產(chǎn)業(yè)第1頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四第四節(jié)基因工程的基本操作技術(shù)一、

目的基因的獲得與序列分析（一）目的基因的獲得

基因工程主要是通過人工的方法，分離、改造、擴(kuò)增并表達(dá)生物的特定基因，以獲得有價(jià)值的基因產(chǎn)物。目的基因的分離是基因工程操作的第一步。第2頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四

通常，我們把插入到載體內(nèi)的非自身的DNA片段稱為“外源基因”(foreigngene)。

目的基因(objectivegene)：又叫靶基因(targetgene)，是指根據(jù)基因工程的目的,設(shè)計(jì)的所需要的某些DNA分子片段，它含有一種或幾種遺傳信息的全套密碼(code)第3頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四

目前采用的分離、合成目的基因的常用方法有：1.鳥槍法（霰彈槍法）具體做法是：首先利用物理方法（如剪切力、超聲波等）或酶化學(xué)方法（如限制性內(nèi)切核酸酶）將生物細(xì)胞染色體DNA切割成為基因水平的許多片段，而后將這些片段與適當(dāng)?shù)妮d體結(jié)合，將重組DNA轉(zhuǎn)入受體菌中擴(kuò)增，獲得無性繁殖的基因文庫，再結(jié)合篩選方法，從眾多的轉(zhuǎn)化子菌株中選出含有某種基因的菌株，從中將重組的DNA分離、回收。這種方法也就是應(yīng)用基因工程技術(shù)分離目的基因。其特點(diǎn)是繞過直接分離基因的難關(guān)，在基因組DNA文庫中篩選出目的基因。第4頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四2.

物理化學(xué)法

利用核酸DNA雙螺旋之間存在著堿基G和C配對、A和T配對的這一特性，從生物基因組分離目的基因的方法。常用的分離基因的物理化學(xué)法主要方法有：密度梯度離心法；單鏈酶法；分子雜交法。

第5頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四（1）密度梯度離心法：

根據(jù)液體在離心時(shí)其密度隨轉(zhuǎn)軸距離而增加，堿基GC配對的雙鏈DNA片段密度較大，利用精密的密度梯度超離心技術(shù)可使切割適當(dāng)片段的不同DNA按密度大小分布開來，進(jìn)而通過與某種放射性標(biāo)記的mRNA雜交來檢驗(yàn)，分離相應(yīng)的基因。第6頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四（2）單鏈酶法：

堿基GC配對之間有三個(gè)氫鍵，比AT配對的穩(wěn)定性高。當(dāng)用加熱或其他變性試劑處理DNA時(shí)，雙鏈上AT配對較多的部位先變成單鏈，應(yīng)用單鏈特異的S1核酸酶切除單鏈，再經(jīng)氯化銫超速離心，獲得無單鏈切口的DNA第7頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四（3）分子雜交法：

單鏈DNA與其互補(bǔ)的序列總有“配對成雙”的傾向，如DNA：DNA配對或者DNA：RNA配對，這就是分子雜交的原理。利用分子雜交的基本原理既可以分離又可以鑒別某一基因。第8頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四3.化學(xué)合成法

是以單核苷酸為原料，在體外用化學(xué)方法按照已知基因的堿基順序合成DNA短片段，再依次連接成完整的目的基因鏈。此法必須預(yù)先知道目的基因或其mRNA或蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)，即核苷酸或氨基酸的順序。為了保證定向合成，需要將一個(gè)分子的5’端與另一個(gè)分子的3′端封閉保護(hù)。這種封閉可用磷酸化等方法，必要時(shí)可以酸或堿解除封閉。

第9頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四

化學(xué)合成法的最大優(yōu)點(diǎn)是能按照人們的意愿合成突變基因。但有局限性，要合成較長鏈的DNA分子尚有困難。隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，基因工程操作儀器設(shè)備也不斷更新。如日本Zeon公司已成功制成并出售“全自動DNA合成儀”，精工電子工業(yè)公司的“

DNA序列儀”。目前單鏈DNA短片段的合成已經(jīng)成為分子生物學(xué)和生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)技術(shù)了。第10頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四4.酶促逆轉(zhuǎn)錄合成法

酶促逆轉(zhuǎn)錄合成法即利用逆轉(zhuǎn)錄酶以mRNA為模板合成相應(yīng)的DNA方法。主要用于合成分子量較大而又不知其序列的基因。這種方法是以目的基因的mRNA為模板，借助逆轉(zhuǎn)錄酶合成互補(bǔ)的DNA(cDNA)，再在DNA聚合酶的催化下合成雙鏈cDNA片段，與適當(dāng)?shù)妮d體結(jié)合后轉(zhuǎn)入受體菌，擴(kuò)增為cDNA文庫。然后，采用適當(dāng)?shù)姆椒◤腸DNA文庫中篩選出目的基因。如：1972年采用逆轉(zhuǎn)錄酶合成了家兔和人球蛋白的cDNA。第11頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四5.PCR擴(kuò)增法

當(dāng)巳知目的基因的序列時(shí)，通常利用多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)來分離目的基因。它能快速、簡便地在體外擴(kuò)增特定的DNA片段，具有高度的專一性和靈敏度。第12頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四

PCR反應(yīng)體系應(yīng)具備的條件：

（1）要有與被分離的目的基因的DNA雙鏈兩端序列相互補(bǔ)的DNA引物(約20個(gè)堿基左右)；（2）具有熱穩(wěn)定性的酶如TaqDNA聚合酶；（3）dNTP；（4）作為模板的目的DNA序列。一般PCR反應(yīng)可擴(kuò)增出100～5000bp的目的基因。第13頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四

PCR反應(yīng)過程包括：

1.DNA變性（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈DNA

2.退火（25℃-65℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部雙鏈。

3.延伸（70℃-75℃）：在TaqDNA聚合酶（在72℃左右最佳的活性）的作用下，以dNTP為原料，從引物的5′端→3′端延伸，合成與模板互補(bǔ)的DNA鏈。

每一循環(huán)經(jīng)過變性、退火和延伸，DNA含量既增加一倍。如此反復(fù)進(jìn)行約30個(gè)循環(huán)左右，即可擴(kuò)增得到目的DNA序列

第14頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四（二）DNA序列測定

DNA序列分析(DNAsequencing)：指對某一段DNA分子或片段的核苷酸排列順序測定，也就是測定組成DNA分子的A、T、G、C的排列順序。測序也常常用于對重組DNA的序列分析，其結(jié)果是最直接、最客觀反映重組DNA中有無目的基因的方法。第15頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四

核苷酸序列測定的方法有：化學(xué)降解法酶促法（雙脫氧終止法）自動測序法PCR測序法第16頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四1.化學(xué)降解法

也叫Maxam-Gilbert法。原理：用一些特殊的化學(xué)試劑，分別作用于DNA序列中四種不同的堿基。這些堿基經(jīng)過處理后，在核苷酸序列中形成的糖苷鍵連接變?nèi)?，因此很容易從DNA鏈上脫落下來。丟失了堿基的核苷酸鏈再經(jīng)適當(dāng)處理，就可在缺失堿基處斷裂。在進(jìn)行這些反應(yīng)時(shí)，將反應(yīng)條件控制在每條DNA鏈斷開一處，因此經(jīng)過處理，產(chǎn)生一系列長短不等的DNA片段。根據(jù)所用的試劑不同，其末端分別為G、A、C、T，再對一系列這樣的片段進(jìn)行綜合分析，就可測得DNA分子中的核苷酸排列順序。第17頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四2.

酶促法

又叫Sanger法和鏈終止法。原理：先將DNA分子用限制性內(nèi)切酶切割成片段，然后用電泳依其長短不同分離，鈍化單股片段，以32P標(biāo)記其5’末端，并用以作為復(fù)制其互補(bǔ)片段的模板，在復(fù)制過程中，利用從大腸桿菌提取的DNA聚合酶Ⅰ經(jīng)過枯草桿菌蛋白酶處理而得的大片段，以復(fù)制互補(bǔ)單股DNA，從而求得其序列。第18頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四3.自動化測序法

Prober等1987年將鏈終止法加以改進(jìn)，并與電子計(jì)算機(jī)程序的自動化技術(shù)相結(jié)合，加快了序列測定，并且不用放射性同位素標(biāo)記脫氧核苷酸，避免了放射線對操作者的危害。實(shí)際做法：在每種脫氧核苷酸上分別都以共價(jià)鍵接上不同熒光染料，然后與四種三磷酸核苷在同一器皿中，依照上述鏈終止法條件進(jìn)行，即會復(fù)制出一系列不斷增加較長一點(diǎn)的多聚脫氧核苷酸鏈，其3’末端都各自帶有特色熒光染料的雙脫氧核苷酸，為了測定序列，將反應(yīng)混合物在一條道上進(jìn)行凝膠電泳，結(jié)果這條道上出現(xiàn)一系列有熒光的帶。第19頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四

這些有熒光的帶中每一條都代表一個(gè)堿基在復(fù)制鏈中所在的位置。凝膠熒光測定體系由電子計(jì)算機(jī)控制。這個(gè)體系是用激光激發(fā)不同顏色的染料所發(fā)生的熒光，用短波長的藍(lán)光及長波長的紅光分別測量熒光強(qiáng)度之比值，測定在復(fù)制鏈中各堿基的位置，從而得到DNA的序列。熟練的操作者用這種方法一天可測1000個(gè)以上的堿基，而現(xiàn)在其他測序方法一般一人一年只能測50000個(gè)堿基。這種方法因用電子計(jì)算機(jī)控制，自動化操作，大大縮短測定時(shí)間，而且結(jié)果準(zhǔn)確可靠，是目前最優(yōu)越的測序方法。第20頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四二、目的基因與載體的連接

通過不同的途徑獲取了目的基因，選擇或構(gòu)建適當(dāng)?shù)幕蜉d體之后，基因工程的下一步工作是如何將目的基因與載體連接在一起，即DNA的體外重組?；蛑亟M是基因工程的核心。

基因重組(generecombination)，就是將目的基因與載體DNA兩者連接起來。這種連接主要靠T4DNA連接酶。第21頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四

通常連接的形式有：黏性末端連接平端連接人工接頭連接同聚物加尾連接

第22頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四（一）黏性末端連接

黏性末端連接有兩種情況。

同一限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)連接

由同一限制性內(nèi)切酶切割的不同DNA片段，會產(chǎn)生具有完全相同的黏性末端，在適合條件下。單鏈黏性末端間進(jìn)行堿基配對形成雙鏈，然后在T4DNA連接酶催化作用下使之共價(jià)連接，形成的重組DNA分子。第23頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四不同限制酶切位點(diǎn)連接

由兩種不同的限制性內(nèi)切酶切割的DNA片段，產(chǎn)生具有相同類型的黏性末端，彼此稱為互補(bǔ)末端，也可以產(chǎn)生末端連接。第24頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四（二）

平端連接

一些內(nèi)切酶如HaeⅢ和HpaI切割產(chǎn)生的DNA片段是平齊末端。具有平齊末端的酶切載體只能與平齊末端的目的基因連接。

T4DNA連接酶可催化相同和不同限制性內(nèi)切酶切割的平端之間連接。第25頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四（三）人工接頭連接

人工接頭是人工合成的具有特定限制性內(nèi)切酶識別和切割序列的雙股平端DNA短序列。將其接在目的基因片段和載體DNA上，使它們具有新的內(nèi)切酶位點(diǎn)，應(yīng)用相應(yīng)的內(nèi)切酶切割，就可以分別得到互補(bǔ)的黏性末端。第26頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四第27頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四（四）同聚物加尾連接

利用末端轉(zhuǎn)移酶(也稱DNA轉(zhuǎn)移酶)在DNA片段上制造一個(gè)粘性末端的方法。如在目的基因片段的3’末端添加一小段同聚物(如dA堿基)，在載體3’末端添加一小段同聚物dT，形成堿基配對，而后在T4DNA連接酶催化作用下使之共價(jià)連接，形成的重組DNA分子。

第28頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四第29頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四三、重組DNA向受體的轉(zhuǎn)化

在目的基因與載體連接成重組DNA分子以后，下面的重要工作主要是將其導(dǎo)入受體細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增和篩選，獲得大量的重組DNA分子，這就是外源基因的無性繁殖，即克隆(cloning)。

由于外源基因與載體構(gòu)成的重組DNA分子性質(zhì)不同、宿主細(xì)胞不同，將重組DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞的具體方法也不相同。第30頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四常用的受體細(xì)胞以細(xì)菌為主，其中主要有大腸桿菌、枯草桿菌重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞的方法有：（1）轉(zhuǎn)化：是將重組質(zhì)粒DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞，使受體遺傳性狀發(fā)生改變的方法；轉(zhuǎn)化是使重組體DNA分子在熱休克的短暫時(shí)間內(nèi)被導(dǎo)入受體。熱休克后將受體菌在不含抗生素的培養(yǎng)液中生長至少30分鐘以上，使其蛋白得到足夠表達(dá)，以便能在含抗生素的瓊脂培養(yǎng)平板上生長。由于E.coliX1776菌株用CaCl2處理后制備的感受態(tài)細(xì)胞長期冷藏仍能保持其攝取外源DNA的能力，故常用作受體菌。第31頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四（2）轉(zhuǎn)染：是指噬菌體、病毒、或以其為載體構(gòu)建的重組DNA導(dǎo)入細(xì)胞的過程。(其中又分磷酸鈣沉淀法與體外包裝法)磷酸鈣沉淀法

利用磷酸鈣-DNA共沉淀，把外源基因與λ噬菌體DNA的重組分子導(dǎo)入大腸桿菌和哺乳動物細(xì)胞，簡稱磷酸鈣沉淀法。細(xì)胞具有攝取磷酸鈣沉淀的雙鏈DNA的能力，幾乎所有的雙鏈DNA都可以通過這種方法導(dǎo)入細(xì)胞，而且可在電子顯微鏡下清楚地看到細(xì)胞吞噬DNA-磷酸鈣復(fù)合顆粒。此法的轉(zhuǎn)染效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)不如體外包裝法。第32頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四體外包裝轉(zhuǎn)染法

體外包裝：指在體外將重組DNA放置到噬菌體的蛋白質(zhì)外殼里，然后通過正常的噬菌體感染過程，將它們導(dǎo)入宿主細(xì)胞。將重組DNA噬菌體包裝成噬菌體顆粒，使其能夠感染細(xì)菌，并在宿主菌體內(nèi)擴(kuò)增和表達(dá)外源基因。

（2）轉(zhuǎn)染：是指噬菌體、病毒、或以其為載體構(gòu)建的重組DNA導(dǎo)入細(xì)胞的過程。(其中又分磷酸鈣沉淀法與體外包裝法)第33頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四又稱之為直接顯微注射。一般是用微吸管吸取供體DNA溶液，在顯微鏡下準(zhǔn)確地插入受體細(xì)胞核中，并將DNA注射進(jìn)去。此法常用于轉(zhuǎn)基因動物的基因轉(zhuǎn)移。（3）微注射技術(shù)：是將外源基因直接注射到真核細(xì)胞內(nèi)的方法；第34頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四（4）電轉(zhuǎn)化法也有人稱做高壓電穿孔法（簡稱電穿孔法），即在受體細(xì)胞上施加短暫、高壓的電流脈沖，使質(zhì)膜形成納米大小的微孔，DNA能直接通過這些微孔，或者作為微孔閉合時(shí)所伴隨發(fā)生的膜組分重新分布而進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中。該法可用于真核細(xì)胞(如動物細(xì)胞和植物細(xì)胞)和原核細(xì)胞(轉(zhuǎn)化大腸桿菌和其他細(xì)菌等)的外源DNA的直接導(dǎo)入。

電穿孔法具有簡便、快速、效率高等優(yōu)點(diǎn)第35頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四又稱高速微型子彈射擊法、微彈射擊法、高速粒子轟擊法基本原理：將DNA吸附在微型子彈(1μm)的表面通過放電或機(jī)械加速，使子彈射入完整的細(xì)胞或組織內(nèi)?；咀龇ǎ合葘⑼庠碊NA溶液與鎢、金等金屬微粒(直徑0.5-5μm)共同保溫，使DNA吸附于金屬顆粒表面，然后放電加速金屬顆粒，使之以400m/s的速度直接噴射受體細(xì)胞，外源遺傳物質(zhì)隨金屬顆粒進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。（5）基因槍技術(shù)第36頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四（6）脂質(zhì)體介導(dǎo)法（7）其他方法：很多高效的新穎的導(dǎo)入方法，如加速冷凍法、碳化硅纖維介導(dǎo)法等正在研究并逐漸達(dá)到實(shí)用水平。

脂質(zhì)體(又叫做人工膜泡)作為體內(nèi)或體外輸送載體的方法，一般都需要將DNA或RNA包囊于脂質(zhì)體內(nèi)，然后進(jìn)行脂質(zhì)體與細(xì)胞膜的融合，通過融合導(dǎo)入細(xì)胞。第37頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四

受體細(xì)胞：也叫宿主細(xì)胞，是指在轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、雜交中接受外源基因的細(xì)胞。分為原核受體細(xì)胞(最主要是大腸桿菌)、真核受體細(xì)胞

(最主要是酵母菌)、動物細(xì)胞和昆蟲細(xì)胞(其實(shí)也是真核受體細(xì)胞)。

具有接受外源DNA的能力；為限制性內(nèi)切酶缺陷型菌珠或?yàn)镈NA重組型菌珠；在標(biāo)記上和載體對應(yīng)；有利于表達(dá)；不適宜在人體或非培養(yǎng)條件下生存，有利于安全。第38頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四

大腸桿菌是目前基因工程中最常用的受體細(xì)胞。通常采用的是大腸桿菌的感受態(tài)細(xì)胞，即在冰浴中用一定濃度的CaCl2處理對數(shù)生長期的大腸桿菌，以獲得高效轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞。也有采用Rb+、Mn2+、K+、二甲亞礬、二硫蘇糖醇(DTT)或用氯化己胺鈷處理制備感受態(tài)細(xì)胞。

感受態(tài)是指受體細(xì)胞能吸收外源DNA分子而有效地作為轉(zhuǎn)化受體的某些生理狀態(tài)。一般受體細(xì)胞在對數(shù)生長期轉(zhuǎn)化能力最強(qiáng)。第39頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四四、重組體的篩選與外源基因的鑒定（一）重組體的篩選

基因克隆的下一道工序是：從轉(zhuǎn)化細(xì)菌菌落中篩選含有陽性重組DNA分子的菌落，并鑒定重組DNA分子的正確性。第40頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四1、針對遺傳表型篩選按載體的性狀變化進(jìn)行篩選根據(jù)插入基因的遺傳性狀進(jìn)行篩選。2、根據(jù)重組子的結(jié)構(gòu)特征篩選快速裂解菌落，鑒定分子大小內(nèi)切酶圖譜鑒定PCR篩選重組子核酸分子雜交第41頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四（二）

重組體的鑒定

經(jīng)過轉(zhuǎn)化的重組體，如轉(zhuǎn)基因微生物、轉(zhuǎn)基因動物和轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，經(jīng)過培養(yǎng)在其形成了一定的菌株、品系之后，就需要對它們進(jìn)行鑒定，檢驗(yàn)它們在生長發(fā)育、傳種接代過程中是否保留了已獲得的外源基因。

第42頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四1、

報(bào)告基因的檢測法

是一種快速而簡易地區(qū)分轉(zhuǎn)基因生物和非轉(zhuǎn)基因生物的方法。報(bào)告基因檢測法：指在構(gòu)建目的基因時(shí)將一種報(bào)告基因(如GUS基因)構(gòu)建在一起，當(dāng)目的基因轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞時(shí)，報(bào)告基因一同被轉(zhuǎn)入。報(bào)告基因：是一種編碼可被檢測的蛋白質(zhì)或酶的基因，也就是說，是一個(gè)其表達(dá)產(chǎn)物非常容易被鑒定的基因。第43頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四2、分子雜交技術(shù)

為了從分子水平鑒定目的基因是否已經(jīng)整合到受體細(xì)胞中，是否轉(zhuǎn)錄，是否表達(dá)，經(jīng)常用到基因探針雜交技術(shù)。即用已知基因片段(往往是目的基因片段)制作的探針，與待測樣品的基因片段進(jìn)行核酸分子雜交，從而判斷二者的同源程度。目前已廣泛應(yīng)用于食品生物技術(shù)的研究中。這種技術(shù)通常包括原位雜交、點(diǎn)雜交、Southern吸印雜交、Northern吸印雜交、Western吸印雜交等。后三者需要瓊脂糖凝膠電泳與分子雜交相結(jié)合的分析手段。第44頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四（1）點(diǎn)雜交：將待測DNA或RNA或細(xì)胞裂解物變性后直接點(diǎn)在硝酸纖維素膜上，不需限制性酶進(jìn)行酶切，即可與探針進(jìn)行雜交反應(yīng)。該技術(shù)對于基因拷貝數(shù)多的樣品很適合，具有間接快速的特點(diǎn)，一般可作大批量樣品的篩選。

（2）Southern吸印雜交：是1975年由Southern首創(chuàng)的，以后又由多人改造，目前被認(rèn)為是最經(jīng)典和應(yīng)用最廣泛的雜交力方法。根據(jù)基因探針與待測DNA限制酶的酶解片段雜交帶譜，可以直接確定是否已經(jīng)轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞并接合到受體細(xì)胞的基因組中。第45頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四

基本原理和操作過程是：提取重組體DNA，限制性酶切后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，在堿溶液中使DNA變性即雙鏈變?yōu)閱捂?，再?jīng)毛細(xì)管虹吸作用被原位轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜或尼龍膜上，將膜上的DNA烤干，固定后加入雜交液和標(biāo)記探針進(jìn)行雜交，洗去多余探針，在X光底片上放射自顯影。第46頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四（3）

Northern吸印雜交基本原理與Southern大致相同，只是檢測的對象不是DNA，而是RNA。具體做法是：提取重組體總RNA或mRNA，在強(qiáng)變性劑如甲基汞或甲醛存在的情況下(防止RNA形成二級結(jié)構(gòu)環(huán))，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，電泳后，將電泳分離開的RNA原位吸印到經(jīng)化學(xué)處理過的紙或硝酸纖維素膜上，用同位素標(biāo)記的探針進(jìn)行雜交，然后放射自顯影，根據(jù)X光片上的條帶，可以了解與探針互補(bǔ)的RNA的大小及數(shù)量。由于RNA比DNA更易受到各種因素的降解，整個(gè)操作過程必須十分小心，按規(guī)程操作。對轉(zhuǎn)基因生物Northern雜交顯示陽性，說明外源基因已經(jīng)轉(zhuǎn)入受體基因組中，并且順利地進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，形成mRNA。第47頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四（4）

Western吸印雜交：主要用于檢測外源基因在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中的表達(dá)情況，即是否進(jìn)行了翻譯，產(chǎn)生了外源基因所編碼的蛋白質(zhì)。具體做法是：提取重組體蛋白質(zhì)，用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，然后將蛋白質(zhì)從聚丙烯酰胺凝膠上原位轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，最后進(jìn)行抗體與抗原結(jié)合反應(yīng)。

第48頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四（5）原位(菌落)雜交技術(shù)：

是利用核酸雜交原理檢測含有待測DNA序列的重組分子。在許多情況下，含有理想重組體的細(xì)菌往往混雜在含有其他重組分子的細(xì)菌之中，當(dāng)理想重組體的存在無法用遺傳方法檢測時(shí)，必須考慮其他篩選方法，原位(菌落)雜交法是最常用的方法之一。

第49頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四大致過程：先通過一定方法，讓菌落轉(zhuǎn)移到一種支撐膜上，如硝酸纖維素濾膜，然后裂解膜上的細(xì)菌，使DNA變性并原位結(jié)合在濾膜上，將帶有DNA印跡的濾膜與放射性標(biāo)記的RNA或DNA探針雜交。在雜交后，先洗未雜交的探針，再進(jìn)行放射性自顯影，與探針有同源性的DNA印跡將會顯露在X光片上。顯然，提供這種DNA的菌落包含著理想的DNA序列，可從主盤中找到那個(gè)相應(yīng)的菌落。

第50頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四第六節(jié)反義基因技術(shù)一、反義基因技術(shù)的基本概念和原理

反義RNA(antisenseRNA)：有義DNA鏈轉(zhuǎn)錄成的、與特異的靶RNA互補(bǔ)結(jié)合并能抑制靶RNA表達(dá)的一段序列。反義ＲＮＡ是一類能與特異ｍＲＮＡ互補(bǔ)的小分子量、可擴(kuò)散的ＤＮＡ轉(zhuǎn)錄物，它能夠從翻譯水平、轉(zhuǎn)錄水平和核酸復(fù)制水平上高度特異地抑制靶基因表達(dá)。轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生反義RNA的基因稱之為反義基因。第51頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四反義RNA技術(shù)：指把一段DNA序列以反義方向插入到合適的啟動子和終止子之間，然后把此基因構(gòu)建體轉(zhuǎn)化到受體細(xì)胞中去(通常用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的方法)，通過選擇培養(yǎng)獲得轉(zhuǎn)化生物體的技術(shù)。

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第52頁，共59頁，2023年，2月20日，星期四反義基因的表達(dá)載體構(gòu)建方法：第一步，分離得到的mRNA為模板，合成反義DNA；第二步，以此反義鏈為模板合成有義DNA鏈；第三步