實(shí)驗(yàn)五金黃色葡萄球菌檢測(cè)概述課件

實(shí)驗(yàn)五乳制品中金黃色葡萄球菌檢測(cè)生物學(xué)特性

---菌體形態(tài)及培養(yǎng)特征革蘭氏陽(yáng)性球菌，直徑為0.8-1.0微米，鏡檢時(shí)呈單個(gè)、成對(duì)、四聯(lián)或不規(guī)則的簇群；無(wú)芽孢，不運(yùn)動(dòng)；兼性厭氧菌，在好氧條件下生長(zhǎng)最好；可在15%氯化鈉和40%膽汁中生長(zhǎng)生物學(xué)特性

---菌體形態(tài)及培養(yǎng)特征大多數(shù)菌株能生長(zhǎng)在6.5-46℃之間（最適溫度30-37℃）能在pH4.2-9.3之間生長(zhǎng)（最適pH為7.0-7.5）；大多數(shù)菌株產(chǎn)生類胡羅卜素，使細(xì)胞團(tuán)呈現(xiàn)出深橙色到淺黃色，色素的產(chǎn)生取決于生長(zhǎng)的條件，而且在單個(gè)菌株中可能也有變化致病性金黃色葡萄球菌為條件致病菌，菌株致病力的強(qiáng)弱主要取決于其產(chǎn)生的毒素和侵襲性酶：

a.溶血素：外毒素，分α、β、γ、δ四種，能損傷血小板，破壞溶酶體，引起肌體局部缺血和壞死；

b.殺白細(xì)胞素：可破壞人的白細(xì)胞和巨噬細(xì)胞；

c.血漿凝固酶：當(dāng)金黃色葡萄球菌侵入人體時(shí)，該酶使血液或血漿中的纖維蛋白沉積于菌體表面或凝固，阻礙吞噬細(xì)胞的吞噬作用。葡萄球菌形成的感染易局部化與此酶有關(guān)；

d.脫氧核糖核酸酶：金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的脫氧核糖核酸酶能耐受高溫，可用來(lái)作為依據(jù)鑒定金黃色葡萄球菌；

e.腸毒素：金黃色葡萄球菌能產(chǎn)生數(shù)種引起急性胃腸炎的蛋白質(zhì)性腸毒素，分為A、B、C、D、E五種。致病性葡萄球菌性食物中毒是葡萄球菌腸毒素所引起的疾病，可引發(fā)不同程度的急性胃腸炎癥狀，惡心、嘔吐最為突出而且普遍，腹痛、腹瀉次之。當(dāng)金黃色葡萄球菌污染了含淀粉及水分較多的食品，如牛奶和奶制品、肉、蛋等，在溫度條件適宜時(shí)，經(jīng)8-10小時(shí)即可相當(dāng)數(shù)量的腸毒素。分布在自然界中廣泛存在，空氣、水、灰塵及人和動(dòng)物的排泄物中都可找到。作為人和動(dòng)物的常見病原菌，其主要存在于人和動(dòng)物的鼻腔、咽喉、頭發(fā)上，50%以上健康人的皮膚上都有金黃色葡萄球菌存在。因而，食品受其污染的機(jī)會(huì)很多。傳播媒介為被該菌污染的食品，主要為淀粉類(如剩飯、米面、粥等)、牛乳及乳制品，以及魚、肉、蛋類等。被污染的食物在室溫20℃-22℃放置5小時(shí)以上時(shí)，病菌大量繁殖，并產(chǎn)生腸毒素。流行病學(xué)金黃色葡萄球菌腸毒素是個(gè)世界性衛(wèi)生問(wèn)題，在美國(guó)由金黃色葡萄球菌腸毒素引起的食物中毒占整個(gè)細(xì)菌性食物中毒的33%，加拿大則更多，占45%，我國(guó)每年發(fā)生的此類中毒事件也非常多。流行病學(xué)腸毒素形成條件：存放溫度，在37°C內(nèi)，溫度越高，產(chǎn)毒時(shí)間越短；存放地點(diǎn)，通風(fēng)不良氧分壓低易形成腸毒素；食物種類，含蛋白質(zhì)豐富，水分多，同時(shí)含一定量淀粉的食物，腸毒素易生成。耐受力幾乎所有的消毒試劑以及熱加工過(guò)程對(duì)金黃色葡萄球菌都有嚴(yán)重的破壞作用腸毒素可耐受100℃30分鐘不被破壞。對(duì)于加工過(guò)的食品或食品加工設(shè)備而言，此菌或其腸毒素的存在通常作為衛(wèi)生條件差的一種指標(biāo)。污染的控制防止金黃色葡萄球菌污染食品

防止金黃色葡萄球菌對(duì)奶及其制品的污染：如牛奶廠要定期檢查奶牛的乳房，不能擠用患化膿性乳腺炎的牛奶；奶擠出后，要迅速冷至-10℃以下，以防毒素生成、細(xì)菌繁殖。奶制品要以消毒牛奶為原料，注意低溫保存。污染的控制防止金黃色葡萄球菌污染食品

對(duì)肉制品加工廠，患局部化膿感染的禽、畜尸體應(yīng)除去病變部位，經(jīng)高溫或其他適當(dāng)方式處理后進(jìn)行加工生產(chǎn)。污染的控制防止金黃色葡萄球菌腸毒素的生成

應(yīng)在低溫和通風(fēng)良好的條件下貯藏食物，以防腸毒素形成；在氣溫高的春夏季，食物置冷藏或通風(fēng)陰涼地方也不應(yīng)超過(guò)6小時(shí)，并且食用前要徹底加熱。檢測(cè)步驟

---分離血平板：金黃色葡萄球菌可以產(chǎn)生溶血素，因此在血平板上產(chǎn)生明顯的溶血環(huán)。血平板上其典型菌落呈金黃色，有時(shí)也為白色，大而突起，圓形，不透明，表面光滑，有溶血圈。檢測(cè)步驟

---分離BP平板：胰蛋白胨、牛肉膏和酵母膏提供碳源、氮源、硫、維生素和痕量礦物元素丙酮酸鈉是一種生長(zhǎng)促進(jìn)劑亞碲酸鹽對(duì)除金黃色葡萄球外的其他能分解卵黃的菌株有毒性，并使菌落產(chǎn)生黑色卵黃提供營(yíng)養(yǎng)和有利于觀察卵磷脂環(huán)甘氨酸和氯化鋰對(duì)金黃色葡萄球菌以外的其它菌株有抑制作用。檢測(cè)步驟

---分離在BP平板上其典型菌落為：圓形，光滑突起，濕潤(rùn)，直徑2-3mm，顏色呈灰色到黑玉色，邊緣常為淡色（米黃色或灰白色略帶灰色或黃色的白色），周圍為一混濁帶，在其外緣常有一透明圈。用接種針接觸菌落似有黃油樹膠的粘稠感。偶然會(huì)遇到不分解脂肪菌株，除無(wú)混濁帶及透明圈外，其他外觀基本相同。長(zhǎng)期保存的冷凍或干燥食品中所分離的菌落，其黑色常較典型菌落淡些，且外觀可能粗燥，質(zhì)地較干燥。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊罅私馐称返馁|(zhì)量與金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)的意義。掌握金黃色葡萄球菌的生物學(xué)特性。掌握金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)的生化試驗(yàn)的操作方法和結(jié)果的判斷。掌握食品中金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)的方法和技術(shù)。二、原理葡萄球菌在自然界分布極廣，空氣、土壤、水、飼料、食品(剩飯、糕點(diǎn)、牛奶、肉品等)以及人和動(dòng)物的體表粘膜等處均有存在，大部分是不致病，也有一些致病的球菌。金黃色葡萄球菌是葡萄球菌屬一個(gè)種?？梢鹌つw組織炎癥，還能產(chǎn)生腸毒素。如果在食品中大量生長(zhǎng)繁殖，產(chǎn)生毒素，人誤食了含有毒素的食品，就會(huì)發(fā)生食物中毒，故食品中存在金黃色葡萄球菌對(duì)人的健康是一種潛在危險(xiǎn)，檢查食品中金黃色葡萄球菌及數(shù)量具有實(shí)際意義。金黃色葡萄球菌能產(chǎn)生凝固酶，使血漿凝固，多數(shù)致病菌株能產(chǎn)生溶血毒素，使血瓊脂平板菌落周圍出現(xiàn)溶血環(huán)，在試管中出現(xiàn)溶血反應(yīng)。這些是鑒定致病性金黃色葡萄球菌的重要指標(biāo)。三、試劑和儀器（一）最先準(zhǔn)備的器材規(guī)格名稱 數(shù)量 用途1、500ml三角瓶 1個(gè) 7.5%氯化鈉肉湯2、500ml三角瓶 1個(gè) 10%氯化鈉胰酪胨大豆肉湯3、250ml三角瓶 4個(gè) 制血培養(yǎng)基等4、10×100mm試管 6支 血漿凝固酶試驗(yàn)5、1ml移液管 2支6、10ml移液管 2支7、直徑為90mm平皿12套 制血平板、B-P平板8、250ml量筒 1支（二）應(yīng)滅菌的其它器材剪刀1把 不銹鋼湯匙1把稱量紙適量A.110%氯化鈉胰酪胨大豆肉湯A.1.1成分胰酪胨（或胰蛋白胨）17.0g植物蛋白胨（或大豆蛋白胨）3.0g氯化鈉100.0g磷酸氫二鉀2.5g丙酮酸鈉10.0g葡萄糖2.5g蒸餾水1000mLpH7.3±0.2A.1.2制法將上述成分混合，加熱，輕輕攪拌并溶解，調(diào)節(jié)pH，分裝，每瓶225mL，121℃高壓滅菌15min。A.27.5%氯化鈉肉湯

A.2.1成分蛋白胨10.0g牛肉膏5.0g氯化鈉75g蒸餾水1000mLpH7.4A.2.2制法將上述成分加熱溶解，調(diào)節(jié)pH，分裝，每瓶225mL，121℃高壓滅菌15min。四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

（一）、增菌培養(yǎng)法樣品處理→→選擇性增菌→→選擇性平板分離→→血漿凝固酶試驗(yàn)鑒別→→結(jié)果報(bào)告第一天樣品處理和增菌培養(yǎng)（一）、樣品處理固體或半固體食品：以無(wú)菌操作稱取25g樣品，放入裝有225mL滅菌生理鹽水的滅菌均質(zhì)杯內(nèi)，于8000r/min均質(zhì)1～2min，制成1:10樣品勻液。

液體食品:：用滅菌吸管吸取25mL樣品，放入裝有225mL滅菌生理鹽水的滅菌玻璃瓶?jī)?nèi)(瓶?jī)?nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的玻璃珠)，經(jīng)充分振搖制成1:10樣品勻液。（二）、增菌培養(yǎng)接種操作：吸取5mL稀釋液接入7.5%NaCl肉湯或胰蛋白胨肉湯中。37°C培養(yǎng)24小時(shí)。培養(yǎng)：放于36±1℃培養(yǎng)24h。培養(yǎng)結(jié)果：在NaCl肉湯中呈混濁生長(zhǎng)，胰蛋白胨肉湯中有時(shí)液體澄清，菌量多時(shí)呈混濁生長(zhǎng)。第二天接種選擇性平板進(jìn)行分離培養(yǎng)（一）、接種選擇性平板取增菌液1環(huán)，劃線接種于血平板或B－P平板。（二）、培養(yǎng)放于36±1℃培養(yǎng)24h。第三天觀察分離結(jié)果、鏡檢、做血漿凝固酶試驗(yàn)（一）、觀察分離結(jié)果結(jié)果：金黃色葡萄球菌，在血平板上呈：金黃或白色菌落，大而凸起，表面光滑，周圍有溶血圈；在Baird-Parker平板上：菌落為圓形，直徑2-3mm，顏色灰或黑色，周圍有一渾濁帶，在其外層有一透明圈。（二）、革蘭氏染色、鏡檢操作：革蘭氏染色→鏡檢結(jié)果：金黃色葡萄球菌，革蘭氏陽(yáng)性，顯微鏡下呈葡萄狀排列無(wú)芽胞，直徑0.5-1μm。（三）、結(jié)果報(bào)告：綜合形態(tài)特征，血平板情況以及血漿凝固酶試驗(yàn)結(jié)果，判別檢樣有否金黃色葡萄球菌作出報(bào)告。金黃色葡萄球菌血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)取肉湯培養(yǎng)物0.5mL同0.5mL凝固酶試驗(yàn)兔血漿于試管內(nèi)充分混合,置36±1℃培養(yǎng),定時(shí)觀察是否有凝塊形成,至少觀察6h,以內(nèi)容物完全凝固,使試管倒置或傾斜時(shí)不流動(dòng)者為陽(yáng)性。1支加入金黃色葡萄球菌的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液或菌懸液0.5ml作陽(yáng)性對(duì)照，另1支加入營(yíng)養(yǎng)肉湯或0.9％無(wú)菌氯化鈉溶液0.5ml作陰性對(duì)照。

陽(yáng)性和陰性對(duì)照血漿凝固酶試驗(yàn)(1)取潔凈玻片一張，于兩端各加兔血漿一滴。(2)用接種環(huán)取金黃色葡萄球菌苔一環(huán)，在玻片一端兔血漿中研磨混勻，接種環(huán)滅菌后再取白色葡萄球菌苔一環(huán)，在另一端兔血漿中研磨均勻。(3)觀察兔血漿有無(wú)凝集現(xiàn)象。四.檢驗(yàn)和控制

1．金黃色葡萄球菌的檢驗(yàn)

樣品處理：無(wú)菌取25g或25mL食品樣品，放入225mL滅菌生理鹽水中均質(zhì)，制成10-1稀釋液。

增菌培養(yǎng)：將10-1稀釋液接入7.5%NaCl肉湯或胰蛋白胨肉湯中，37°C培養(yǎng)24小時(shí)。

分離培養(yǎng)：將上述稀釋液或培養(yǎng)液分別劃線血平板和Baird-Parker平板，置37°C培養(yǎng)24-48小時(shí)。金黃色葡萄球菌在血平板上呈金黃或白色菌落，大而凸起，表面光滑，周圍有溶血圈。在Baird-Parker平板上菌落為圓形，直徑2-3mm，顏色灰或黑色，周圍有一渾濁帶。

染色觀察：從平板上挑取可疑性菌落進(jìn)行革蘭氏染色，金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽(yáng)性，顯微鏡下呈葡萄狀排列無(wú)芽胞、莢膜，直徑0.5-1μm。

血漿凝固酶試驗(yàn)：吸取0.5mL兔血漿與0.5mL金黃色葡萄球菌肉浸液肉湯24小時(shí)培養(yǎng)物充分混勻，置36±1°C培養(yǎng)，每隔半小時(shí)觀察一次，連續(xù)觀察6小時(shí)，出現(xiàn)凝固，即將小試管傾斜或倒置時(shí)，內(nèi)容物不流動(dòng)，判為陽(yáng)性。同時(shí)做陰陽(yáng)性對(duì)照。

耐熱核酸酶試驗(yàn)：將24小時(shí)肉湯培養(yǎng)物沸水浴處理15min，用接種環(huán)劃線刺種于甲苯胺蘭-DNA平板，36±1°C培養(yǎng)24小時(shí)，在刺種線周圍出現(xiàn)淡粉色者為陽(yáng)性。本試驗(yàn)金黃色葡萄球菌為陽(yáng)性。

血漿凝固酶試驗(yàn)：吸取0.5mL兔血漿與0.5mL金黃色葡萄球菌肉浸液肉湯24小時(shí)培養(yǎng)物充分混勻，置36±1°C培養(yǎng)，每隔半小時(shí)觀察一次，連續(xù)觀察6小時(shí)，出現(xiàn)凝固，即將小試管傾斜或倒置時(shí)，內(nèi)容物不流動(dòng)，判為陽(yáng)性。同時(shí)做陰陽(yáng)性對(duì)照。耐熱核酸酶試驗(yàn)：將24小時(shí)肉湯培養(yǎng)物沸水浴處理15min，用接種環(huán)劃線刺種于甲苯胺蘭-DNA平板，36±1°C培養(yǎng)24小時(shí)，在刺種線周圍出現(xiàn)淡粉色者為陽(yáng)性。本試驗(yàn)金黃色葡萄球菌為陽(yáng)性。問(wèn)題與討論：1.血漿與血清的區(qū)別是什么？為何凝固酶試驗(yàn)需要用血漿而不是血清？2.葡萄球菌產(chǎn)生的凝固酶有幾種？實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)血漿凝固酶的試驗(yàn)方法有幾種？每種方法測(cè)定的物質(zhì)有何不同？哪種方法最好？3.血漿中的抗