酶的分子修飾優(yōu)秀公開課件

Chapter4ModificationofEnzymeMolecule酶的分子修飾Contentsofchapter41、什么是酶分子修飾2、酶分子修飾的基本要求和條件3、酶分子的修飾方法4、酶修飾后的性質(zhì)變化GoGoGoGo5、酶的定向進(jìn)化附：酶的活性中心Go4.1什么是酶分子修飾？通過各種方法使酶分子的結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變，從而改變酶的某些特性和功能的技術(shù)過程稱為酶分子修飾。即：在體外將酶分子通過人工的方法與一些化學(xué)基團(tuán)（物質(zhì)），特別是具有生物相容性的物質(zhì)，進(jìn)行共價(jià)連接，從而改變酶的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)。酶修飾的方向1)通過分子修飾的方法來改變已分離出來的天然酶的活性。2)通過基因工程方法改變編碼酶分子的基因而達(dá)到改造酶的目的。酶分子修飾的意義提高酶的活力activity增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性stability降低或消除酶的抗原性immunologicalproperty研究和了解酶分子中主鏈、側(cè)鏈、組成單位、金屬離子和各種物理因素對酶分子空間構(gòu)象的影響structure

一、如何增強(qiáng)酶天然構(gòu)象的穩(wěn)定性與耐熱性修飾劑分子存在多個(gè)反應(yīng)基團(tuán)，可與酶形成多點(diǎn)交聯(lián)。使酶的天然構(gòu)象產(chǎn)生“剛性”結(jié)構(gòu)。二、如何保護(hù)酶活性部位與抗抑制劑大分子修飾劑與酶結(jié)合后，產(chǎn)生的空間障礙或靜電斥力阻擋抑制劑，“遮蓋”了酶的活性部位。酶分子修飾的原理：四、如何消除酶的抗原性及穩(wěn)定酶的微環(huán)境1.酶蛋白氨基酸組成的抗原決定簇，與修飾劑形成了共價(jià)鍵。破壞了抗原決定簇——抗原性降低乃至消除“遮蓋”了抗原決定簇——阻礙抗原、抗體結(jié)合2.大分子修飾劑本身是多聚電荷體，能在酶分子表面形成“緩沖外殼”，抵御外界環(huán)境的極性變化，維持酶活性部位微環(huán)境相對穩(wěn)定。4.2酶分子修飾的基本要求和條件

對酶分子進(jìn)行修飾必須在修飾原理、修飾劑和反應(yīng)條件的選擇以及酶學(xué)性質(zhì)等方面都要有足夠的了解。一．修飾劑的要求二．酶性質(zhì)的了解三．反應(yīng)條件的選擇四．酶修飾方法修飾劑的要求1．修飾劑的分子量、修飾劑鏈的長度對蛋白質(zhì)的吸附性。2．修飾劑上反應(yīng)基團(tuán)的數(shù)目及位置。3．修飾劑上反應(yīng)基團(tuán)的活化方法與條件。酶分子修飾的條件修飾反應(yīng)盡可能在酶穩(wěn)定條件下進(jìn)行，并盡量不破壞酶活性功能的必需基團(tuán)，使修飾率高，同時(shí)酶的活力回收高。（1）pH與離子強(qiáng)度

pH決定了酶蛋白分子中反應(yīng)基團(tuán)的解離狀態(tài)。由于它們的解離狀態(tài)不同，反應(yīng)性能也不同。（2）修飾反應(yīng)的溫度與時(shí)間

嚴(yán)格控制溫度和時(shí)間可以減少以至消除一些非專一性的修飾反應(yīng)。（3）反應(yīng)體系中酶與修飾劑的比例

酶修飾方法選擇1．酶分子側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)修飾2．有機(jī)大分子對酶的化學(xué)修飾3．蛋白質(zhì)類及其他。4.3酶分子的修飾方法金屬離子置換修飾,大分子結(jié)合修飾(共價(jià)/非共價(jià))側(cè)鏈基團(tuán)修飾肽鏈有限水解修飾氨基酸置換修飾酶分子的物理修飾

金屬離子置換修飾的過程a.酶的分離純化：首先將欲進(jìn)行修飾的酶經(jīng)過分離純化，除去雜質(zhì)，獲得具有一定純度的酶液。

b.除去原有的金屬離子：在經(jīng)過純化的酶液中加入一定量的金屬螯合劑，如乙二胺四乙酸（EDTA）等，使酶分子中的金屬離子與EDTA等形成螯合物。通過透析、超濾、分子篩層析等方法，將EDTA-金屬螯合物從酶液中除去。此時(shí)，酶往往成為無活性狀態(tài)。

c.加入置換離子：于去離子的酶液中加入一定量的另一種金屬離子，酶蛋白與新加入的金屬離子結(jié)合，除去多余的置換離子，就可以得到經(jīng)過金屬離子置換后的酶。金屬離子置換修飾只適用于那些在分子結(jié)構(gòu)中本來含有金屬離子的酶。用于金屬離子置換修飾的金屬離子，一般都是二價(jià)金屬離子。

金屬離子置換修飾的作用：(1)闡明金屬離子對酶催化作用的影響：(2)提高酶活力：(3)增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性：(4)改變酶的動(dòng)力學(xué)特性：將鋅型蛋白酶的Zn2+除去，然后用Ca2+置換成鈣型蛋白酶，則酶活力可提高20-30%。若將鈣型蛋白酶制成結(jié)晶，則其酶活力比鋅型蛋白酶結(jié)晶的酶活力提高2-3倍。(2)酶的大分子修飾使用一些能與酶非共價(jià)地相互作用而又能有效地保護(hù)酶的一些添加物，如聚乙二醇、右旋糖苷等，它們既能通過氫鍵固定在酶分子表面，也能通過氫鍵有效地與外部水相連，從而保護(hù)酶的活力。一些添加物，如多元醇、多糖、多聚氨基酸、多胺等能通過調(diào)節(jié)酶的微環(huán)境來保護(hù)酶的活力。另一類添加物就是蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)分子之間相互作用時(shí)，其表面區(qū)域內(nèi)排除了水分子，因而增加了相互作用力，其穩(wěn)定性也就增加了。非共價(jià)修飾采用水溶性大分子與酶的側(cè)鏈基團(tuán)共價(jià)結(jié)合，使酶分子的空間構(gòu)象發(fā)生改變，從而改變酶的特性與功能的方法大分子修飾(共價(jià))的過程修飾劑的選擇：大分子結(jié)合修飾采用的修飾劑是水溶性大分子。例如，聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐、蔗糖聚合物（Ficoll）、葡聚糖、環(huán)狀糊精、肝素、羧甲基纖維素、聚氨基酸等。要根據(jù)酶分子的結(jié)構(gòu)和修飾劑的特性選擇適宜的水溶性大分子。修飾劑的活化：作為修飾劑中含有的基團(tuán)往往不能直接與酶分子的基團(tuán)進(jìn)行反應(yīng)而結(jié)合在一起。在使用之前一般需要經(jīng)過活化，然后才可以與酶分子的某側(cè)鏈基團(tuán)進(jìn)行反應(yīng)。修飾：將帶有活化基團(tuán)的大分子修飾劑與經(jīng)過分離純化的酶液，以一定的比例混合，在一定的溫度、pH值等條件下反應(yīng)一段時(shí)間，使修飾劑的活化基團(tuán)與酶分子的某側(cè)鏈基團(tuán)以共價(jià)鍵結(jié)合，對酶分子進(jìn)行修飾。分離：需要通過凝膠層析等方法進(jìn)行分離，將具有不同修飾度的酶分子分開，從中獲得具有較好修飾效果的修飾酶。應(yīng)用：消除了抗原性如：PEG－超氧化物歧化酶（SOD）

PEG－溶血類蛋白質(zhì)（鏈激酶、尿激酶等）

PEG－天門冬酰胺酶（ASNase）延長了酶在體內(nèi)的半衰期又如：用Dextran修飾-淀粉酶，－淀粉酶，胰蛋白酶、過氧化氫酶，提高了酶的熱穩(wěn)定性。聚乙二醇是線性分子具有良好的生物相容性和水溶性，在體內(nèi)無毒性、無殘留、無免疫原性，并可消除酶的抗原性，使其末端活化后可以與酶產(chǎn)生交聯(lián)，因而，它被廣泛用于酶的修飾。酶

半衰期相對穩(wěn)定性

天然SOD6min1

右旋糖酐-SOD7h70Ficoll(低分子量)–SOD14h140Ficoll(高分子量)–SOD24h240

聚乙二醇-SOD

35h

350(3)酶分子的側(cè)鏈基團(tuán)修飾采用一定的方法（一般為化學(xué)法）使酶蛋白的側(cè)鏈基團(tuán)發(fā)生改變，從而改變酶分子的特性和功能的修飾方法?？梢杂糜谘芯扛鞣N基團(tuán)在酶分子中的作用及其對酶的結(jié)構(gòu)、特性和功能的影響。在研究酶的活性中心中的必需基團(tuán)時(shí)經(jīng)常采用。酶有蛋白類酶和核酸類酶兩大類別。它們的側(cè)鏈基團(tuán)不同，修飾方法也有所區(qū)別。（1）蛋白類酶主要由蛋白質(zhì)組成，酶蛋白的側(cè)鏈基團(tuán)是指組成蛋白質(zhì)的氨基酸殘基上的功能團(tuán)。主要包括氨基、羧基、巰基、胍基、酚基、咪唑基、吲哚基等。這些基團(tuán)可以形成各種副鍵，對酶蛋白空間結(jié)構(gòu)的形成和穩(wěn)定有重要作用。側(cè)鏈基團(tuán)一旦改變將引起酶蛋白空間構(gòu)象的改變，從而改變酶的特性和功能。（2）核酸類酶主要由核糖核酸（RNA）組成，酶RNA的側(cè)鏈基團(tuán)是指組成RNA的核苷酸殘基上的功能團(tuán)。RNA分子上的側(cè)鏈基團(tuán)主要包括磷酸基，核糖上的羥基，嘌呤、嘧啶堿基上的氨基和羥基（酮基）等。1.化學(xué)修飾反應(yīng)的類型

1)烷基化反應(yīng)試劑特點(diǎn)：烷基上帶活潑鹵素，導(dǎo)致酶分子的親核基團(tuán)（如－NH2，-SH等）發(fā)生烷基化?？勺饔没鶊F(tuán)：氨基（Lys，Arg），巰基（Cys），羧基（Asp、Glu），甲硫基（Met），咪唑基（His）。修飾劑：2，4－二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺等。烷基化反應(yīng)

2)?；磻?yīng)試劑特點(diǎn)：含有

結(jié)構(gòu)，作用于側(cè)鏈基團(tuán)上的親核基團(tuán)，使之?；?。可作用基團(tuán)：氨基，巰基，醇羥基（Ser、Thr），酚羥基（Tyr）酰基化反應(yīng)

3)氧化和還原反應(yīng)試劑特點(diǎn)：具有氧化性或還原性。氧化劑：H2O2，N-溴代琥珀酰亞胺可被氧化的側(cè)鏈基團(tuán)：巰基，甲硫基，吲哚基（Trp）、咪唑基，酚基等。還原劑：2－巰基乙醇、DTT等?？杀贿€原的側(cè)鏈基團(tuán)：二硫鍵。連四硫酸鹽氧化巰基，DTT還原逆回，用于保護(hù)巰基。

4)芳香環(huán)取代反應(yīng)試劑：鹵（碘）化，硝化試劑。碘代：

I2＋

+HI

硝化：

(NO2)4C++(NO2)3CH

（四硝基甲烷）2.特定氨基酸殘基側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)修飾1)氨基的化學(xué)修飾：來源：Lys,Arg,His,Gln修飾反應(yīng)：?；c烷基化酰基化修飾劑:

三硝基苯磺酸（TNBS）、丹磺酰氯（DNS）烷基化修飾劑：

2，4－二硝基氟苯（DNFB）、碘乙酸、碘乙酰胺、亞硝酸等

2)羧基的化學(xué)修飾修飾羧基的反應(yīng)專一性較差。常用水溶性碳化二亞胺修飾天冬氨酸和谷氨酸?？啥繙y定酶分子中羧基的數(shù)目。

+

水溶性碳化二亞胺3)胍基的化學(xué)修飾來源：Arg修飾反應(yīng)：本質(zhì)上是羰基對氨基酰基化。修飾劑：丁二酮二羰基化合物1，2－環(huán)己二酮苯乙二醛4)巰基的化學(xué)修飾

來源：Cys

修飾反應(yīng):烷基化修飾劑：碘乙酸(IAA)

碘乙酰胺(IAM)

E-SH+R-X－>E-SR+HXN-乙基馬來酰亞胺（NEM）（常用的專一修飾巰基試劑）5)二硫鍵的化學(xué)修飾還原：巰基乙醇、二硫蘇糖醇（DTT）氧化：過甲酸:Performicacid

6)咪唑基的化學(xué)修飾

來源：His

修飾反應(yīng):酰基化與烷基化?；揎梽?

常用焦碳酸二乙酯（diethylparacarbonate）

++C2H5OH+CO2

烷基化修飾劑：碘乙酸+ICH2COOH+HI7）酚羥基的化學(xué)修飾來源：Tyr修飾反應(yīng)：芳香環(huán)取代反應(yīng)修飾劑：碘、硝化試劑（四硝基甲烷）8）吲哚基的化學(xué)修飾

來源：Trp

修飾反應(yīng)：氧化反應(yīng)修飾劑：N-溴代琥珀酰亞胺氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)修飾劑Lys氨基三硝基苯磺酸，2，4－二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺、丹磺酰氯、亞硝酸Asp、Glu羧基水溶性碳化二亞胺Arg胍基苯乙二醛，1,2－環(huán)己二酮、丁二酮Cys巰基碘乙酸、碘乙酰胺、N-乙基馬來酰亞胺二硫鍵巰基乙醇、DTTHis咪唑基焦碳酸二乙酯、碘乙酸Tyr酚羥基碘、四硝基甲烷Trp吲哚基N-溴代琥珀酰亞胺

各種氨基酸側(cè)鏈的修飾劑

但解釋修飾效果須十分小心，因?yàn)椋孩偃魏我环N修飾劑不是絕對專一的。②有些修飾劑引起蛋白質(zhì)構(gòu)象變化——失活，不一定是活性中心基團(tuán)被共價(jià)修飾。③不同部分的相同基團(tuán)，修飾效果不同，分子內(nèi)部的必需基團(tuán)，不易被修飾。(4)酶蛋白主鏈修飾(肽鏈有限水解修飾)利用酶分子主鏈的切斷和連接，使酶分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)及其空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變，從而改變酶的特性和功能的方法。酶蛋白主鏈修飾主要是靠酶切/酶原激活法。酶蛋白的肽鏈被水解后，可能出現(xiàn)以下三種情況中的一種：1

引起酶活性中心的破壞，酶失去催化功能。2仍維持活性中心的完整構(gòu)象，保持酶活力。3有利于活性中心與底物結(jié)合并形成準(zhǔn)確的催化部位，酶活力提高。后兩種情況，肽鏈的水解在限定的肽鍵上進(jìn)行，稱肽鏈有限水解。主鏈切斷修飾應(yīng)用實(shí)例：1）提高酶活力：2）消除抗原性：主鏈連接修飾將兩種或兩種以上的酶通過主鏈連接在一起，形成一個(gè)酶分子具有兩種或多種催化活性。－－－－多酶融合體肽鏈上含有2種或2種以上催化活性的酶，往往是基因融合的產(chǎn)物。它可以是單體酶，也可以是寡聚酶或更復(fù)雜的多酶體系。例如E．coli天冬氨酸激酶I-高絲氨酸脫氫酶I融合體，在天冬氨酸到絲氨酸生物合成中催化兩步反應(yīng)，該酶是α4四聚體，每條肽鏈含有兩個(gè)活性：N-端部分的天冬氨酸激酶和C-端部分的高絲氨酸脫氫酶，所以又稱雙頭酶；來自樟樹種子的克木毒蛋白由一條肽鏈組成，具有3種不同的酶活性；紅色鏈孢霉的AROM多酶融合體是一個(gè)二聚體，每條肽鏈含5種酶活性。a、胃蛋白酶原的激活b、胰蛋白酶原（trypsinogen）的激活c、胰凝乳蛋白酶原（chymotrypsinogen）的激活氨基酸或核苷酸的置換修飾可以采用化學(xué)修飾方法，例如，Bender等成功地利用化學(xué)修飾法將枯草桿菌蛋白酶活性中心的絲氨酸轉(zhuǎn)換為半胱氨酸，修飾后，該酶失去對蛋白質(zhì)和多肽的水解能力，卻出現(xiàn)了催化硝基苯酯等底物水解的活性。但是化學(xué)修飾法難度大，成本高，專一性差，而且要對酶分子逐個(gè)進(jìn)行修飾，操作復(fù)雜，難以工業(yè)化生產(chǎn)。

現(xiàn)在常用的氨基酸置換修飾的方法是定點(diǎn)突變技術(shù)。定點(diǎn)突變（sitedirectedmutagenesis）是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來的一種基因操作技術(shù)。是指在DNA序列中的某一特定位點(diǎn)上進(jìn)行堿基的改變從而獲得突變基因的操作技術(shù)。是蛋白質(zhì)工程（ProteinEngineering）和酶分子組成單位置換修飾中常用的技術(shù)。定點(diǎn)突變技術(shù)，為氨基酸或核苷酸的置換修飾提供了先進(jìn)、可靠、行之有效的手段。(5)氨基酸置換修飾酶分子的定點(diǎn)突變1、基因序列分析2、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析3、酶活性中心分析4、引物設(shè)計(jì)進(jìn)行基因定點(diǎn)突變5、酶基因克隆表達(dá)6、變異特性分析(6)酶分子的物理修飾通過物理修飾，可以了解不同物理?xiàng)l件下，特別是在極端條件下（高溫、高壓、高鹽、極端pH值等）由于酶分子空間構(gòu)象的改變而引起酶的特性和功能的變化情況。特點(diǎn)在于不改變酶的組成單位及其基團(tuán)，酶分子中的共價(jià)鍵不發(fā)生改變，只是在物理因素的作用下，副鍵發(fā)生某些變化和重排。回本章目錄4.4酶修飾后的性質(zhì)變化熱穩(wěn)定性：一般來說，熱穩(wěn)定性有較大的提高?？乖裕罕容^公認(rèn)的是PEG和人血清白蛋白在消除酶的抗原性上效果比較明顯。各類失活因子的抵抗力：修飾酶對蛋白酶、抑制劑均有一定的抵抗能力，從而提高其穩(wěn)定性。半衰期：一般在體內(nèi)的半衰期得到有效延長。由于酶分子經(jīng)修飾后，增強(qiáng)對熱、蛋白酶、抑制劑等的穩(wěn)定性，從而延長了在體內(nèi)的半衰期。最適pH：大部分酶經(jīng)化學(xué)修飾后，酶的最適pH發(fā)生了變化，這種變化在應(yīng)用研究上有時(shí)具有重要意義。修飾酶最適pH更接近于生理環(huán)境，在臨床應(yīng)用上有較大意義。Km的變化：大多數(shù)酶經(jīng)修飾后，Vm沒有明顯變化，但有些酶經(jīng)修飾后，Km值變大?；乇菊履夸浢傅鞍踪|(zhì)工程的目標(biāo)功能改變減小Km，Vmax，pH改變，去除抑制部位，改變專一性結(jié)構(gòu)特性穩(wěn)定性新體系構(gòu)建雜合酶和多功能酶，添加便于分離的片斷化學(xué)修飾方法的局限性：隨著M上升，擴(kuò)散速度受限；蛋白表面被部分屏蔽，生物活性降低修飾劑呈現(xiàn)多聚合度，選擇性不夠高蛋白質(zhì)工程的主要手段基因突變定點(diǎn)突變；隨機(jī)突變基因剪接基因缺失；基因融合4.5酶的定向進(jìn)化酶分子的合理設(shè)計(jì)(rationaldesign)酶分子的定向進(jìn)化(directedevolution)酶的合理設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)工程改造的實(shí)際應(yīng)用

1.枯草桿菌蛋白酶

1）增強(qiáng)抗氧化性2）改變底物特異性枯草桿菌蛋白酶是重要的工業(yè)用酶,但該酶很容易被氧化,氧化后的蛋白酶很快地失去活性.絲氨酸蛋白酶，275aa用途：洗衣粉缺點(diǎn)：表面劑對其結(jié)構(gòu)破壞，漂白劑化學(xué)氧化失活活性位點(diǎn)：221的Ser222位是易被氧化的Met,也是酶的活性中心.將Met222突變?yōu)锳la,得到了抗氧化能力較強(qiáng)并保留較高活性的突變?；钚?3％；Ser236位于橫貫枯草蛋白酶E的α-螺旋末端，遠(yuǎn)離催化活性中心，引入Ser236Cys,可能會(huì)形成分子間二硫鍵，有利于提高酶的穩(wěn)定性。Ser236Cys變體酶(BP-1)活性是野生型蛋白酶E的1．5倍，熱穩(wěn)定性提高3倍；枯草桿菌蛋白酶的第99位門冬氨酸及156位谷氨酸替換為賴氨酸后，使這個(gè)酶在pH7時(shí)的活力提高了1倍，在pH6時(shí)活力提高了10倍。2.溶菌酶（Lysozyme）

1)抗菌范圍的擴(kuò)大2)熱穩(wěn)定性的提高T4溶菌酶的第51位蘇氨酸轉(zhuǎn)變成脯氨酸,使該酶對ATP的親和力增強(qiáng),酶活力提高了25倍.3：胰蛋白酶Arg117位自熔點(diǎn)缺失突變——穩(wěn)定性提高將酶分子表面正電荷改變成負(fù)電荷——對精氨酸專一性提高4木糖異構(gòu)酶特點(diǎn)：四聚體，45000，金屬離子輔助因子缺點(diǎn)：熱失活降低固定化壽命原因：兩個(gè)二聚體相對欠穩(wěn)定，幾個(gè)lys高糖下易糖化；gly中斷穩(wěn)定的螺旋結(jié)構(gòu)改造：Gly70S;Gly74T;Ala73S—半衰期93上升114h

1993年,美國科學(xué)家ArnoldFH首先提出酶分子的定向進(jìn)化的概念，并用于天然酶的改造或構(gòu)建新的非天然酶。蛋白質(zhì)定向進(jìn)化概念的提出體外定向進(jìn)化的意義理論上，蛋白質(zhì)分子蘊(yùn)藏著很大的進(jìn)化潛力，很多功能有待于開發(fā)，這是酶的體外定向進(jìn)化的基本先決條件。所謂酶的體外定向進(jìn)化，又稱實(shí)驗(yàn)分子進(jìn)化，屬于蛋白質(zhì)的非合理設(shè)計(jì)，它不需事先了解酶的空間結(jié)構(gòu)和催化機(jī)制，通過人為地創(chuàng)造特殊的條件，模擬自然進(jìn)化機(jī)制(隨機(jī)突變、重組和自然選擇)，在體外改造酶基因，并定向選擇出所需性質(zhì)的突變酶。酶的體外定向進(jìn)化技術(shù)極大地拓展了蛋白質(zhì)工程學(xué)的研究和應(yīng)用范圍，特別是能夠解決合理設(shè)計(jì)所不能解決的問題，為酶的結(jié)構(gòu)與功能研究開辟了嶄新的途徑，并且正在工業(yè)、農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥等領(lǐng)域逐漸顯示其生命力。

人為地創(chuàng)造特殊的進(jìn)化條件，模擬自然進(jìn)化機(jī)制，在體外對基因進(jìn)行隨機(jī)突變，從一個(gè)或多個(gè)已經(jīng)存在的親本酶（天然的或者人為獲得的）出發(fā)，經(jīng)過基因的突變和重組，構(gòu)建一個(gè)人工突變酶庫，通過一定的篩選或選擇方法最終獲得預(yù)先期望的具有某些特性的進(jìn)化酶。定向進(jìn)化技術(shù)定向進(jìn)化的原理定向進(jìn)化的原理在待進(jìn)化酶基因的PCR擴(kuò)增反應(yīng)中，利用TaqDNA聚合酶不具有3’->5’校對功能的性質(zhì)，配合適當(dāng)條件，以很低的比率向目的基因中隨機(jī)引入突變，構(gòu)建突變庫，憑借定向的選擇方法，選出所需性質(zhì)的優(yōu)化酶(或蛋白質(zhì))，從而排除其他突變體。定向進(jìn)化的基本規(guī)則是“獲取你所篩選的突變體”。定向進(jìn)化=隨機(jī)突變+選擇。前者是人為引發(fā)的，后者雖相當(dāng)于環(huán)境，但只作用于突變后的分子群，起著選擇某一方向的進(jìn)化而排除其他方向突變的作用，整個(gè)進(jìn)化過程完全是在人為控制下進(jìn)行的隨機(jī)突變的策略易錯(cuò)PCR技術(shù)(error-pronePCR)DNA改組(DNAshuffling)：由美國Stemmer于1994年首次提出一項(xiàng)體外重組技術(shù)隨機(jī)引發(fā)重組(RPR)1998年,Arnold提出了一種有效的新方法交錯(cuò)延伸技術(shù)(StEP)：由Zhao等提出,是一種簡化的DNAshuffling技術(shù)易錯(cuò)PCR易錯(cuò)PCR（errorpronePCR）是指在擴(kuò)增目的基因的同時(shí)引入堿基錯(cuò)配，導(dǎo)致目的基因隨機(jī)突變。連續(xù)易錯(cuò)PCR(sequentialerrorpronePCR)策略。即將一次PCR擴(kuò)增得到的有用突變基因作為下一次PCR擴(kuò)增的模板，連續(xù)反復(fù)地進(jìn)行隨機(jī)誘變。DNA改組和外顯子改組DNA改組(DNAshuffling)又稱有性PCR(sexualPCR)，原理如圖所示。

外顯子改組(exonshuffling類似于DNA改組，與但與其不同，它是靠同一種分子間內(nèi)含子的同源性帶動(dòng)，而DNA改組不受任何限制，發(fā)生在整個(gè)基因片段上。體外隨機(jī)引發(fā)重組

體外隨機(jī)引發(fā)重組(randompriminginvitrorecombination,RPR)以單鏈DNA為模板，配合一套隨機(jī)序列引物，先產(chǎn)生大量互補(bǔ)于模板不同位點(diǎn)的短DNA片段，由于堿基的錯(cuò)配和錯(cuò)誤引發(fā)，這些短DNA片段中也會(huì)有少量的點(diǎn)突變，在隨后的PCR反應(yīng)中，它們互為引物進(jìn)行合成，伴隨組合，再組裝成完整的基因長度。所謂隨機(jī)引物是含有各種可能排列順序的寡核苷酸片段的混合物，它可以與任意核苷酸序列雜交，起到聚合酶反應(yīng)引物的作用。交錯(cuò)延伸

交錯(cuò)延伸(staggerextensionprocess,StEP)在PCR反應(yīng)中把常規(guī)的退火和延伸合并為一步,縮短其反應(yīng)時(shí)間，從而只能合成出非常短的新生鏈，經(jīng)變性的新生鏈再作為引物與體系內(nèi)同時(shí)存在的不同模板退火而繼續(xù)延伸。此過程反復(fù)進(jìn)行，直到產(chǎn)生完整的基因長度。定向進(jìn)化的選擇策略1、定向進(jìn)化中，突變具有隨機(jī)性，但通過選擇特定方向的突變限定了進(jìn)化趨勢，加之控制實(shí)驗(yàn)條件，限定突變種類，降低突變率，縮小突變庫的容量，這不僅減少了工作量，更重要的是加快了酶在某一方向的進(jìn)化速度。2、通常,篩選方法必須靈敏,至少與目的性質(zhì)相關(guān)。另有一些其他的篩選方法，如加入能產(chǎn)生可見光信號的底物或利用綠色熒光蛋白的熒光性質(zhì)等。高通量的篩選體系酶的篩選酶的篩選可分為選擇培養(yǎng)基篩選法和檢測培養(yǎng)基篩選法。選擇培養(yǎng)基篩選法通過添加或減少某種成分使目的菌株獲得生長優(yōu)勢，而其它菌株的生長受到抑制，通過多次的篩選分離最終得到目的菌株。單一碳源的選擇性培養(yǎng)基，使能夠利用反應(yīng)底物的微生物獲得生長優(yōu)勢而大量增殖，無法利用反應(yīng)底物的微生物由于無法獲得營養(yǎng)生長受到抑制，從而得到所需的目的菌株?；パa(bǔ)的方法，即在有營養(yǎng)缺陷的培養(yǎng)基上篩選能合成該種營養(yǎng)物質(zhì)的菌株。檢測培養(yǎng)基篩選法通常是在培養(yǎng)基中加入某種試劑或化學(xué)藥物，使培養(yǎng)后發(fā)生某種可以辨別的變化，如培養(yǎng)基的透明度的變化或菌落周圍顏色的變化，由此區(qū)別不同類型或生理特性不同的微生物。這種篩選可以在檢測平板中進(jìn)行，也可以在微孔滴定板中進(jìn)行，借助一些檢測儀器很容易實(shí)現(xiàn)高通量篩選。酶的高通量篩選

基于比色法和熒光檢測的高通量篩選

基于檢測培養(yǎng)基篩選法的，生色基團(tuán)或熒光基團(tuán)的底物參加的催化反應(yīng)是最容易實(shí)現(xiàn)高通量篩選的。

通過監(jiān)測反應(yīng)過程中的顏色和熒光的變化可以有效地監(jiān)測反應(yīng)的進(jìn)行。使用比色計(jì)或熒光計(jì)檢測顯色或熒光底物，pH指示劑顯色反應(yīng)和熒光共振能量轉(zhuǎn)移還可以實(shí)現(xiàn)高通量實(shí)時(shí)檢測?；诒壬ê蜔晒鈾z測的高通量篩選

顯色或熒光底物的高通量篩選大部分熒光和顯色底物都帶高酸度的苯酚或苯胺離去基團(tuán)，當(dāng)前廣泛應(yīng)用的是以硝基苯和傘形酮衍生物作為底物的檢測方法?；谶@種技術(shù)的檢測方法簡單快捷，結(jié)果準(zhǔn)確容易實(shí)現(xiàn)數(shù)字化，可以做到實(shí)時(shí)監(jiān)控，得到了廣泛的應(yīng)用。但這類底物通常不夠穩(wěn)定，反應(yīng)特異性差，反應(yīng)速度快，比普通底物高出幾個(gè)數(shù)量級，不適用于一些難轉(zhuǎn)化的和難合成的反應(yīng)以及粗酶催化的反應(yīng)和一些條件劇烈的反應(yīng)，如高溫，高的pH值等?；诒壬ê蜔晒鈾z測的高通量篩選

pH指示劑顯色高通量篩選許多水解反應(yīng)伴隨pH的變化，根據(jù)反應(yīng)介質(zhì)和反應(yīng)平衡常數(shù)選擇合適的pH指示劑可以準(zhǔn)確的檢測水解反應(yīng)速率。pH指示劑顯色技術(shù)被廣泛地用于腈水解酶和酯水解酶等水解酶的篩選QuickE法通過pH指示劑的顯色反應(yīng)監(jiān)測互為對映體底物的水解速率，根據(jù)水解速率的差異來評價(jià)酶的立體選擇性。這一技術(shù)最近被用于熒光假單胞菌酯酶定向進(jìn)化中突變體的篩選，得到了立體選擇性明顯提高的突變體QuickE示意圖基于反應(yīng)熱力學(xué)變化紅外檢測的高通量篩選所有的物質(zhì)都可以發(fā)射紅外線，光電平面聚焦陣列紅外檢測器可以靈敏地檢測反應(yīng)過程中的熱量變化（檢測波長范圍3-5μm，溫度變化10-100mK）。放熱反應(yīng)在紅外成像中表現(xiàn)為“熱”點(diǎn)，相反吸熱反應(yīng)表現(xiàn)“冷”點(diǎn)，通過對“熱”點(diǎn)或“冷”點(diǎn)的分辨，可以檢測反應(yīng)的進(jìn)行與否。紅外檢測技術(shù)是一種新穎的有發(fā)展前途的高通量篩選技術(shù)，它不需要生色基團(tuán)或熒光基團(tuán)的加入，避免了比色和熒光檢測方法的局限性，但是這種技術(shù)目前還無法進(jìn)行定量，只能檢測催化活性較高的酶，對酶活的進(jìn)一步研究還需借助傳統(tǒng)方法，方法本身還需要進(jìn)一步的發(fā)展和完善。借助復(fù)雜的儀器設(shè)備的高通量篩選

高效液相色譜,質(zhì)譜和毛細(xì)管電泳也被用來檢測反應(yīng)速度，但是作為一種高通量篩選技術(shù)，這些方法測試成本較高，而且每天每臺儀器最高只能檢測幾百個(gè)樣品，方法的使用受到一定的限制。采用放射性同位素標(biāo)記底物進(jìn)行脂酶的篩選取得了較好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，這種方法靈敏而且準(zhǔn)確，但由于放射性其使用會(huì)受到限制無法推廣使用。酶的篩選（小結(jié)）比色和熒光檢測為代表的高通量篩選方法得到了廣泛的應(yīng)用，是當(dāng)前酶的高通量篩選的主要研究和發(fā)展方向。隨著生物催化在精細(xì)化工和醫(yī)藥行業(yè)的廣泛應(yīng)用，對手性純化合物的大量需求使手性酶的篩選成了當(dāng)前的研究熱點(diǎn)，同時(shí)產(chǎn)品價(jià)值的提高也將使得很多借助復(fù)雜儀器設(shè)備的高成本的檢測方法成為可能并將逐漸得到更多的應(yīng)用。酶性質(zhì)突變方法枯草桿菌蛋白酶E有機(jī)相活性/穩(wěn)定性易錯(cuò)PCRβ-內(nèi)酰胺酶總活力/底物專一性DNA改組枯草桿菌蛋白酶BPN′穩(wěn)定性盒式誘變對硝基苯酯酶底物專一性/有機(jī)相活性易錯(cuò)PCR/DNA改組胸腺嘧啶核苷激酶底物專一性盒式誘變?chǔ)?半乳糖苷酶底物專一性DNA改組綠色熒光蛋白熒光DNA改組核酶底物專一性易錯(cuò)PCR/DNA改組天冬氨酸酶活性與穩(wěn)定性隨機(jī)/定位誘變藥物和疫苗活性/專一性/最佳表達(dá)DNA改組酶的體外定向進(jìn)化應(yīng)用實(shí)例回本章目錄定向進(jìn)化與自然進(jìn)化的異同點(diǎn)定向進(jìn)化的實(shí)質(zhì)是達(dá)爾文進(jìn)化論在分子水平上的延伸和應(yīng)用。定向進(jìn)化是在體外模擬突變、重組和選擇的自然進(jìn)化，使進(jìn)化朝著人們需要的方向發(fā)展。兩者的不同：進(jìn)化動(dòng)力不同：保守突變非保守取代；進(jìn)化方向不同：適應(yīng)突變的積累；進(jìn)化速度不同：非常漫長只需幾年、甚至幾天；

進(jìn)化目標(biāo)不同：適應(yīng)環(huán)境超越生物學(xué)意義的要求，探索所希望的蛋白質(zhì)在順序空間的可及性。定向進(jìn)化技術(shù)Fig.1.Publicationrateofthe‘directedevolution’articlesinbiomedicalliteraturebetween1995and2004.TheanalysiswasachievedusingtheNationalInstitutesofHealthMEDLINEbibliographicdatabase.Thefigureshowsthetotalnumberofarticlespublishedeachyear,whichcontainthekeywords‘directedevolution’intheirtitles.展望

總之，具有新功能和特性的酶可以通過從大量未知的自然種系中尋找以及對現(xiàn)有的天然酶進(jìn)行改造，對現(xiàn)有的天然酶進(jìn)行改造可能更加合適。我們相信，隨著基因工程技術(shù)、蛋白質(zhì)工程技術(shù)以及高通量篩選技術(shù)的迅速發(fā)展，定向進(jìn)化技術(shù)將成為獲得新酶的一個(gè)有效快捷的手段，這將為工業(yè)生產(chǎn)提供更多性能優(yōu)良的酶制劑。附1酶的穩(wěn)定性

1.酶穩(wěn)定的分子原因

1）共價(jià)鍵：

肽鍵（peptidebond）

——穩(wěn)定蛋白質(zhì)和酶主鏈的核心力量。

二硫鍵（disulfidebond）

——由兩個(gè)Cys的側(cè)鏈-SH氧化而成，是某些蛋白質(zhì)維持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的主要因素。2）非共價(jià)鍵：疏水相互作用（hydrophobicinteraction）:

是維持蛋白質(zhì)分子穩(wěn)定的主要的作用力。氫鍵（hydrogenbond）：是穩(wěn)定蛋白質(zhì)分子的空間結(jié)構(gòu)，特別是二級結(jié)構(gòu)的重要力量。靜電相互作用（electrostaticinteraction）：又稱離子鍵、鹽鍵、鹽橋，是正負(fù)電荷間的作用力。對酶分子穩(wěn)定性有關(guān)的鹽鍵大部分形成于分子表面上。范德華力：在電中性分子之間的非共價(jià)結(jié)合。分子間形成的范德華力越大越穩(wěn)定。金屬離子：

Ca2+、Mg2+和Zn2+等高價(jià)陽離子與多肽鏈不穩(wěn)定的彎曲部分結(jié)合，可顯著增加酶分子的穩(wěn)定性。途徑方法優(yōu)點(diǎn)不足酶分子改造核酸水平蛋白質(zhì)工程從根本上提高酶分子穩(wěn)定性操作復(fù)雜，周期長蛋白質(zhì)水平化學(xué)修飾適應(yīng)所有酶，操作簡單經(jīng)濟(jì)修飾過程破壞酶分子劑型固定化適應(yīng)所有酶，穩(wěn)定性高，可重復(fù)利用和連續(xù)生產(chǎn)載量較低，易失活交聯(lián)酶晶體穩(wěn)定性好，載量高，催化效率高成本高微環(huán)境改良穩(wěn)定劑簡單、經(jīng)濟(jì)工作量大反應(yīng)介質(zhì)適用于特殊反應(yīng)體系和酶類適合的酶類還不普遍2.穩(wěn)定酶的方法附2：酶的活性中心（activesite）

一、活性中心的概念酶的必需基團(tuán)(essentialgroup):

與酶活性有關(guān)的基團(tuán)酶的活性中心(activecenter):

由必需基團(tuán)構(gòu)成的與酶催化活性有關(guān)的特定區(qū)域.

酶分子非必需基團(tuán)必需基團(tuán)活性中心必需基團(tuán)活性中心外必需基團(tuán)結(jié)合基團(tuán)催化基團(tuán)非活性中心活性中心活性中心的重要化