細(xì)胞生物學(xué)研究方法學(xué)時優(yōu)秀公開課

第二章細(xì)胞生物學(xué)研究方法

Chapter2MethodsinCellBiologyResearch細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法Methodsforobservingcellmorphologyandstructures細(xì)胞組分的分析方法Methodsforanalyzingcellconstituents細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞工程Cellcultureandcellengineering細(xì)胞及生物大分子的動態(tài)變化Dynamicanalysisofbiologicalmacromoleculesincells用于細(xì)胞生物學(xué)研究的模式生物Modelorganismsincellbiology第一節(jié)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法各類細(xì)胞直徑的比較光學(xué)顯微鏡的分辨率

resolutionofopticalmicroscope分辨率(resolution)——區(qū)分開兩個質(zhì)點間的最小距離.對任何顯微鏡來說，最重要的性能參數(shù)是分辨率，而不是放大倍數(shù)。普通光鏡的最大分辨率是0.2μm。0.2um0.2nm0.1nm一、普通復(fù)式光學(xué)顯微鏡技術(shù)1、普通光學(xué)顯微鏡lightmicroscopeF.Zernike于1935年發(fā)明并因此獲1953年諾貝爾物理獎倒置相差顯微鏡

invertedphasecontrastmicroscope物鏡與照明系統(tǒng)顛倒，前者在載物臺之下，后者在載物臺之上，可以用于觀察培養(yǎng)皿中的活細(xì)胞。3、微分干涉顯微鏡

differentialinterferencecontrast(DIC)microscope在相差顯微鏡原理的基礎(chǔ)上，利用兩組平面偏振光的干涉，加強影像的明暗效果，能顯示結(jié)構(gòu)的三維立體投影。與相差顯微鏡相比，立體感更強集多種功能于一體的——萬能研究顯微鏡兼有明視野、相差、微分干涉、熒光、顯微攝影等功能，是高級研究儀器。5、激光共聚焦掃描顯微鏡

laserconfocalscanningmicroscope激光作光源；通過檢測器前小孔成像；掃描激光聚焦點也是瞬時成像焦點——共聚焦。分辨力為普通光鏡的1.4-1.7倍.Epi-fluoresceneConfocal熒光顯微鏡與掃描共焦顯微鏡的比較（小鼠腎小球）AlexaFluor488wheatgermagglutinin,agreen-fluorescentlectin,wasusedtolabelelementsoftheglomeruliandconvolutedtubules.Thefilamentousactinprevalentinglomeruliandthebrushborderwerestainedwithred-fluorescentAlexaFluor568phalloidin.Thenucleiwerecounterstainedwiththeblue-fluorescentDNAstainDAPI. MolecularProbesFluoCells?preparedslide#3(F24630)ZeissPlan-Neofluor40x/1.30OilZeissC-Apochromat40x/1.1WCorr梁鳳霞提供魯斯卡(1906～1988)，德國物理學(xué)家，1932年研制第一臺電子顯微鏡，1986年獲諾貝爾物理獎。二、電子顯微鏡技術(shù)

Electronmicroscopy

1、光鏡與電鏡的主要區(qū)別（1）光源不同:

可見光/紫外線--電子束（2）透鏡不同:

玻璃--電磁透鏡（3）真空（4）顯示記錄系統(tǒng)（5）分辨率:0.2um--0.2nm1、透射電子顯微鏡transmissionelectronmicroscope,TEM透射式電子顯微鏡用于觀察小于0.2μm的細(xì)微結(jié)構(gòu)，稱為亞顯微結(jié)構(gòu)（submicroscopicstructures）或超微結(jié)構(gòu)（ultramicroscopicstructures）.Figure3-20.Electronmicrographofaroot-tipcellstainedwithosmiumandotherheavymetalions.負(fù)染色技術(shù)

Negativestaining負(fù)染色是用重金屬鹽對鋪展在載網(wǎng)上的樣品進(jìn)行染色，吸去多余染料，樣品經(jīng)自然干燥后，整個載網(wǎng)上都鋪上了一薄層重金屬鹽，從而襯托出樣品的精細(xì)結(jié)構(gòu)。Figure3-29.Electronmicrographofnegativelystainedactinfilaments.Eachfilamentisabout8nmindiameterandisseen,oncloseinspection,tobecomposedofahelicalchainofglobularactinmolecules.(CourtesyofRogerCraig.)亦稱冰凍斷裂，主要用來觀察膜斷裂面的蛋白質(zhì)顆粒和膜表面結(jié)構(gòu)。冷凍蝕刻電鏡技術(shù)FreezeEtchingelectronmicroscopy2、掃描電子顯微鏡scanningelectronmicroscope,SEM20世紀(jì)60年代問世，用來觀察標(biāo)本的表面結(jié)構(gòu)目前掃描電鏡的分辨力為6~10nm。三、掃描隧道顯微鏡

scanningtunnelingmicroscope,STMBinnig和Rohere1981年發(fā)明，1986年獲獎；可觀察到原子級的圖像。X-raycrystallographyX射線衍射B.NMRspectroscopy核磁共振成像2、密度梯度離心

densitygradientcentrifugation

用介質(zhì)在離心管內(nèi)形成連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，細(xì)胞混懸液或勻漿置于介質(zhì)頂部，通過離心力場的作用使細(xì)胞分層、分離。常用介質(zhì)為氯化銫，蔗糖和多聚蔗糖分為速度沉降（velocitysedimentation）和等密度沉降（equilibriumsedimentation）

。其它生化分離方法紙色譜柱色譜親和色譜Figure3-42.SDSpolyacrylamide-gelelectrophoresis(SDS).Figure3-44.Separationofproteinmoleculesbyisoelectricfocusing.Figure3-45.Two-dimensionalpolyacrylamide-gelelectrophoresis.二、細(xì)胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)、糖等成分的顯示方法為了對某些細(xì)胞成分進(jìn)行定性和定位研究，利用染色劑可與細(xì)胞某種成分發(fā)生反應(yīng)而著色的原理加以顯示，稱為組織化學(xué)和細(xì)胞化學(xué)染色方法（histochemicalandcytochemicalstainingmethod）；如：細(xì)胞內(nèi)DNA和RNA的原位顯示

MyofibrillarATPase:IdentifyingFastandSlowFibersSuccinateDehydrogenase(琥珀脫氫酶):IdentifyingOxidativePotentialPromoter:GUS是根據(jù)免疫學(xué)原理，利用抗體同特定抗原專一結(jié)合，對抗原進(jìn)行定位測定的技術(shù)，常用的標(biāo)記物有熒光素和酶免疫熒光法（immunofluorescenttechnique）酶標(biāo)免疫法（enzyme-labeledantibodymethod）免疫細(xì)胞化學(xué)

immuno-cytochemistry二、細(xì)胞內(nèi)特異蛋白質(zhì)的定位和定性免疫熒光法酶標(biāo)免疫法利用分子探針檢測細(xì)胞內(nèi)特殊DNA序列、和RNA基因表達(dá)的方法。四、細(xì)胞內(nèi)特異核酸序列的定位和定性原位雜交（insituhybridization）人類染色體端粒DNA的熒光原位雜交照片果蠅HB基因表達(dá)的原位雜交照片五、定量細(xì)胞化學(xué)分析技術(shù)對單個細(xì)胞進(jìn)行快速定量分析分選的一門技術(shù)；流式細(xì)胞術(shù)

flowcytometry第三節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞工程與顯微操作技術(shù)活體或在體(invivo)離體或體外(invitro)

細(xì)胞培養(yǎng)

(cellculture)

就是選用最佳生存條件對活細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)和研究的技術(shù)；原代培養(yǎng)(primaryculture)：從動物機體取出進(jìn)行培養(yǎng)的細(xì)胞群。傳代培養(yǎng)(passage)：將細(xì)胞從一個培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移到另外一個培養(yǎng)瓶即稱為傳代或傳代培養(yǎng)。細(xì)胞株(cellstrain)和細(xì)胞系(cellline)一、動物細(xì)胞培養(yǎng)

cellculture二、植物細(xì)胞培養(yǎng)組織培養(yǎng)(tissueculture)：誘發(fā)產(chǎn)生愈傷組織，誘導(dǎo)再分化可培養(yǎng)出再生植株單倍體培養(yǎng)(haploidculture)：花藥或花粉培養(yǎng)獲得單倍體植株，人為加倍后可得到完全純合的個體原生質(zhì)體培養(yǎng)(protoplastculture)：兩個或多個細(xì)胞合并成一個雙核或多核細(xì)胞的過程稱為細(xì)胞融合(cellfusion)或細(xì)胞雜交(cellhybridization)基因型相同的細(xì)胞融合稱為同核體；來自不同基因型的雜交細(xì)胞稱為異核體；誘導(dǎo)方法：生物(病毒)、化學(xué)(PEG)、物理(電激、激光)。三、細(xì)胞工程——細(xì)胞融合單克隆抗體技術(shù)

monoclonalantibodytechnique英國人Kohler和Milstein1975年將兩種細(xì)胞雜交而創(chuàng)立了單克隆抗體技術(shù)，獲1984年諾貝爾獎顯微操作技術(shù)micromanipulationtechnique第四節(jié)細(xì)胞及生物大分子的動態(tài)變化一、熒光漂白恢復(fù)（fluorescencephotobleachingrecovery,FRP）技術(shù)熒光漂白恢復(fù)技術(shù)(fluorescencerecoveryafterphotobleaching,FRAP)二、熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)

fluorescenceresonanceenergytransfer三、單分子技術(shù)

singlemoleculetechniques光鑷（Opticaltweezers）磁鑷（magnetictweezers）原子力顯微鏡（atomicforcemicroscopy）Howdomusclesproduceworks?研究生物大分子在細(xì)胞內(nèi)合成、分布、定位等；一般用3H，14C，32P，35S，135I，45Ca等；放射性同位素標(biāo)記→切片或涂片→曝光→觀察五、放射自顯影技術(shù)

radioautography135I四、酵母雙雜交

yeasttwo-hybridsystem研究蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)之間的相互作用。線蟲果蠅擬南芥第四節(jié)用于細(xì)胞生物學(xué)研究的模式生物大腸桿菌酵母小鼠作業(yè)題名詞：