羅氏實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀課件

實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀一、實(shí)時(shí)熒光定量PCR的原理熒光定量PCR通過熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性的探針，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，實(shí)時(shí)在線監(jiān)控反應(yīng)過程，結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對結(jié)果進(jìn)行分析，計(jì)算待測樣品的初始模板量。熒光定量PCR儀熒光定量PCR儀是一種帶有激發(fā)光源和熒光信號(hào)檢測系統(tǒng)的PCR儀，通常配有電腦系統(tǒng)及相應(yīng)的分析軟件。

定量PCR技術(shù)的產(chǎn)生1992年由Higuchi等人第一次報(bào)告：使用EB內(nèi)插染料法插至雙鏈DNA，經(jīng)改裝的帶有冷CCD的PCR儀檢測樣品的熒光強(qiáng)度PCR循環(huán)=雙鏈DNA=染料=熒光后來用與雙鏈DNA有更強(qiáng)結(jié)合力的SYBRGreenI取代EB

羅氏產(chǎn)品介紹以及與同類產(chǎn)品之間的對比一、LC1.5和LC2.0LightCycler熒光定量PCR系統(tǒng)

LC1.5LC2.0Lightcycler1.5結(jié)構(gòu)分析以空氣加熱及冷卻迅速改變溫度帶有極高表面積/容量比例的密封20l毛細(xì)管加熱線圈可容納32個(gè)樣品的卡盤將熒光儀定位的分檔器發(fā)動(dòng)機(jī)將樣品置于光學(xué)儀上的分檔器發(fā)動(dòng)機(jī)熱室風(fēng)扇濾器免維護(hù)的LED光源光學(xué)倍增管熱力學(xué)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：1、空氣加熱2、毛細(xì)管反應(yīng)體系優(yōu)點(diǎn):1、升降溫速度快（0.05℃-20℃/秒），2、體系均一，不存在邊緣現(xiàn)象3、把反應(yīng)體系縮小到0-20ul，節(jié)省試劑成本實(shí)現(xiàn)快速PCR光學(xué)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：1、免維護(hù)的LED冷光源，壽命長達(dá)2萬小時(shí)以上2、光學(xué)倍增管（Rodenstock）3、多達(dá)6通道（LC2.0）和3通道（LC1.5）實(shí)時(shí)檢測優(yōu)點(diǎn)：1、毛細(xì)管光學(xué)特性將光線散射、衍射降至最低，避免LED功率低的問題2、免維護(hù)，帶自動(dòng)檢驗(yàn)功能3、輕易實(shí)現(xiàn)內(nèi)標(biāo)、內(nèi)對照及多重PCRLightCycler

結(jié)構(gòu)分析激發(fā)光源

Rodenstock-LED（發(fā)光二極管）

冷光源，免維護(hù)，開機(jī)可以馬上進(jìn)行操作。

檢測系統(tǒng)光學(xué)倍增管(PMT)靈敏度高，寬檢驗(yàn)范圍,背景低，無邊緣效應(yīng)

加熱方式空氣加熱管間差小，熱傳導(dǎo)速率20℃/秒，溫控變化準(zhǔn)確（0.05-20℃/秒）。

反應(yīng)體系

兩種石英玻璃毛細(xì)管體系(20ul和100ul)

光學(xué)性好，反應(yīng)體系小，節(jié)約試劑成本,適合多種用途。檢測光路范圍

530nm,555nm,610nm,640nm,670nm,710nm.六個(gè)波長，并解決相關(guān)熒光素?zé)晒飧蓴_問題PCR領(lǐng)域最聰明的革新–LightCycler熒光定量PCR系統(tǒng)超高速

30至40分鐘完成PCR過程實(shí)時(shí)在線監(jiān)測收集每一循環(huán)的數(shù)據(jù)并立即顯示于聯(lián)機(jī)電腦上高靈敏在一個(gè)基因組當(dāng)量中可檢測出單基因拷貝范圍廣可檢測10－1010拷貝線性范圍，無需稀釋樣品開放性全開放，成為國內(nèi)外試劑廠家的首選開發(fā)平臺(tái)六個(gè)熒光通道輕易實(shí)現(xiàn)內(nèi)標(biāo)、內(nèi)對照或多重PCR最小化

定量反應(yīng)體積降至10－20ul，費(fèi)用低廉靈活性

支持水解探針、雜交探針及

SYBRGreenI閉管分析

消除污染風(fēng)險(xiǎn)Lightcycler的分析模式適用于所有的通用探針及染料分析模式：

SYBRGreenI（熒光染料）TaqMan（水解探針）Molecularbeacon（分子信標(biāo)）Lightcycler上開發(fā)獨(dú)有的分析模式：HybridizationProbeFormat（雜交探針）SimpleProbe（單探針）

SYBR-GreenI檢測模式

SYBRGreenI能選擇性地與雙鏈DNA結(jié)合，在外界光源激發(fā)下產(chǎn)生強(qiáng)烈熒光。在PCR過程中，SYBRGreenI可與新合成地雙鏈DNA結(jié)合，產(chǎn)生地?zé)晒庑盘?hào)強(qiáng)度與雙鏈DNA含量成正比，熒光檢測在每一循環(huán)的延期后進(jìn)行。SYBRGreenI與非特異性雙鏈DNA（如引物二聚體）結(jié)合產(chǎn)生的干擾可通過融解曲線分析而得到解決。

分子信標(biāo)（MolecularBeaconProbe）獨(dú)特的頸環(huán)結(jié)構(gòu)，由非特異的頸和特異的環(huán)組成，探針的5’端標(biāo)記熒光分子，3’端標(biāo)記一個(gè)吸收或淬滅熒光的分子。自身環(huán)化時(shí)儀器檢測不到熒光，在PCR反應(yīng)的退火階段，探針因與模板鏈雜交而打開，使5’端熒光分子與3’端吸收或淬滅熒光的分子分開，儀器就會(huì)檢測到熒光信號(hào)。每一個(gè)循環(huán)，隨著PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的增加，熒光信號(hào)會(huì)增強(qiáng)，從而根據(jù)熒光信號(hào)的增強(qiáng)來計(jì)算PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的增加量。

雜交探針（HybProbe）檢測模式

設(shè)計(jì)與檢測區(qū)互補(bǔ)的分別帶有不同染料標(biāo)記的一對寡核苷酸（既雜交探針），在與擴(kuò)增的DNA片斷雜交時(shí)，兩種染料互相接近。其中供體熒光染料受外來光源激發(fā)后，將能量傳遞給附近的受體染料，既發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET），從而釋放出受體染料分子的發(fā)射波長熒光信號(hào)。熒光信號(hào)的強(qiáng)度和DNA的產(chǎn)量成正比。其他非特異性產(chǎn)物由于不會(huì)與探針雜交，因而不產(chǎn)生信號(hào)干擾。

AnnealingElongationEndofElongationDenaturationFluoresceinLCRedforsequencespecificdetectionofDNA雜交探針檢測－羅氏專利性技術(shù)

專用于SNP基因分型和突變檢測的SimpleProbeSimpleProbe作為一種獨(dú)特的雜交探針只含有一條寡核苷酸探針，能夠特異性的與目的基因上含有SNP位點(diǎn)的靶序列結(jié)合。探針與靶序列結(jié)合后，釋放出能夠被檢測到的熒光信號(hào)，通過對熔點(diǎn)曲線分析中探針釋放的熒光信號(hào)強(qiáng)度的分析，可以得到對目的基因的多態(tài)位點(diǎn)的準(zhǔn)確分析結(jié)果。Denaturationphase:SimpleProbefreeinsolution;emissionofreporterdyeisquenchedAnnealingphase:Fluorescencefromreporterdyeincreaseswhenprobeisannealedtoit‘scomplementarytarget5‘3‘-pQR3‘5‘primer5‘3‘-pQRNewProbeFormat:SimpleProbeFormat

-高效低成本的新型探針R=Reporter(Fluorescein)Q=Quencher熒光定量PCR儀的部分應(yīng)用醫(yī)學(xué)相關(guān)研究

疾病的臨床早期診斷病原體的含量檢測合理用藥分子水平的療效研究疾病的發(fā)病監(jiān)控研究腫瘤相關(guān)基因腫瘤、耐藥基因的檢測研究組織或培養(yǎng)細(xì)胞中mRNA的表達(dá)水平－各種處理對細(xì)胞mRNA含量變化的影響－比較染病組織與正常組織中各種mRNA含量差異DNA或RNA的轉(zhuǎn)染量與實(shí)驗(yàn)結(jié)果關(guān)系的研究基因分型及SNP分析轉(zhuǎn)基因動(dòng)物及植物研究配套功能強(qiáng)大的分析軟件：

（1）絕對定量（具“單點(diǎn)定標(biāo)”功能）（2）相對定量（可進(jìn)行效率校正）（3）自動(dòng)基因分型（SNP）（4）顏色干擾校正獨(dú)特的熔點(diǎn)曲線分析功能，可進(jìn)一步作PCR后分析：---檢測非特異擴(kuò)增并作矯正---鑒別基因型而又無需采用測序凝膠---檢測點(diǎn)突變，并可利用雙色檢測及顏色補(bǔ)償軟件在同一反應(yīng)中分析較復(fù)雜的突變

為什么使用DNase-Free&RNase-Free的光學(xué)玻璃毛細(xì)管?玻璃反應(yīng)管可加快熱傳導(dǎo)速率.毛細(xì)管增加表面積/體積比，確?？諝夂头磻?yīng)成分之間的溫度迅速平衡，溫度均一.縮短了PCR反應(yīng)時(shí)間，特別是熒光激發(fā)的時(shí)間，保證了反應(yīng)成分的穩(wěn)定性，尤其是熒光染料的穩(wěn)定性?？s小反應(yīng)體系，降低檢測成本。光學(xué)玻璃毛細(xì)管的材料適合熒光訊號(hào)的測定，類似光纖的形狀，保證熒光訊號(hào)的準(zhǔn)確捕獲。沒有邊緣效應(yīng).LC1.5與同質(zhì)產(chǎn)品的對比項(xiàng)目ROCHE

LightCycler1.5ABI

ABI7300

MJOPTICONI

備注

光源

LED（發(fā)光二極管）冷光源，免維修，開機(jī)可以馬上進(jìn)行操作，壽命>20000小時(shí)。鹵素?zé)?。壽命短，需預(yù)熱，壽命2000小時(shí)。LED（發(fā)光二極管）,每一個(gè)孔位一個(gè)獨(dú)立的激發(fā)光源和檢測裝置。LightCycler光源無需定期更換，穩(wěn)定方便，光路相同，樣本誤差最小，節(jié)約成本。加熱方式

空氣加熱，溫控變化準(zhǔn)確（±0.4℃）半導(dǎo)體加熱制冷（溫控±0.5℃）半導(dǎo)體加熱制冷（溫控±0.5℃）LightCycler變溫速度快，溫控精確。升降溫速度熱傳導(dǎo)速率20℃/秒，（0.05-20℃/秒)熱傳導(dǎo)速率2.5℃/秒熱傳導(dǎo)速率2.5℃/秒LightCycler升降溫速度快，并可調(diào)節(jié)運(yùn)行時(shí)間

30－40分鐘

2－3小時(shí)

1.5－2.5小時(shí)

LightCycler檢測時(shí)間短，快速出結(jié)果，應(yīng)用最靈活單點(diǎn)定標(biāo)功能軟件可支持單點(diǎn)定標(biāo)功能無無LightCycler每次實(shí)驗(yàn)節(jié)約反應(yīng)管和反應(yīng)試劑4－5份，且單點(diǎn)擬合確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果反應(yīng)管反應(yīng)體系(定量)石英玻璃毛細(xì)管10-20ul薄壁塑料管50ul－100ul專用薄壁塑料管50ul－100ul石英玻璃管熒光檢測靈敏度好，導(dǎo)熱快,試劑用量省項(xiàng)目ROCHE

LightCycler1.5ABI

ABI7300

MJOPTICONI

備注

光路波長及熒光接收模式530nm,640nm,710nm.并解決相關(guān)熒光素?zé)晒飧蓴_問題，光電雜合模式4通道，無顏色補(bǔ)償功能,CCD鏡頭模式(需使用Rox染料進(jìn)行校正,占用一個(gè)通道,實(shí)際只有3個(gè)通道可用)1通道，無顏色補(bǔ)償功能,96個(gè)LED光源分別檢測LightCycler檢測波長經(jīng)過優(yōu)化，檢測范圍廣泛，通道間相距較遠(yuǎn)，干擾最小，而且通過顏色補(bǔ)償功能可將干擾降到最低程度檢測方式

實(shí)時(shí)檢測在線觀測（每一循環(huán)光強(qiáng)度變化，溫度變化，反應(yīng)時(shí)間均可觀測）實(shí)時(shí)檢測在線觀測實(shí)時(shí)檢測在線觀測LightCycler可實(shí)時(shí)檢測整個(gè)PCR過程，也能在PCR運(yùn)行中根據(jù)試驗(yàn)需要進(jìn)行實(shí)驗(yàn)條件的調(diào)節(jié),使用靈活.試劑定量方法Hybridizationprobes(雜交探針):(定量和熔點(diǎn)曲線分析，擴(kuò)增范圍100-1000bp）·TaqMan探針·SYBRGREENI·分子航標(biāo)TaqMan探針（定量，解鏈曲線分析,擴(kuò)增范圍50-150bp〕SYBRGREENI·分子航標(biāo)TaqMan探針（定量，解鏈曲線分析,擴(kuò)增范圍50-150bp〕SYBRGREENI·分子航標(biāo)LightCycler使用的熒光檢測模式最多，對于各種臨床檢測和科研實(shí)驗(yàn)，應(yīng)用最為廣泛動(dòng)力學(xué)范圍10X7X7XLightCycler檢測線性范圍廣泛，無需特別處理樣本

LC2.0與同質(zhì)產(chǎn)品的對比項(xiàng)目ROCHE

LightCycler2.0ABI

ABI7500

MJOPTICONⅡ備注

反應(yīng)管反應(yīng)體系(定量)石英玻璃毛細(xì)管10-100ul薄壁塑料管50ul－100ul專用薄壁塑料管50ul－100ul石英玻璃管熒光檢測靈敏度好，導(dǎo)熱快,試劑用量省光路波長及熒光接收模式六通道，530nm,560nm,610nm,640nm,670nm,710nm.并解決相關(guān)熒光素?zé)晒飧蓴_問題，光電雜合模式五通道，無顏色補(bǔ)償功能,CCD鏡頭模式(使用的探針染料增加)2通道，無顏色補(bǔ)償功能,96個(gè)LED光源分別檢測LightCycler檢測波長經(jīng)過優(yōu)化，檢測范圍廣泛，通道間相距較遠(yuǎn)，干擾最小，而且通過顏色補(bǔ)償功能可將干擾降到最低程度二、LC480LightCycler?480實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)高靈敏可檢測單拷貝基因

動(dòng)力學(xué)范圍廣可檢測10－1010個(gè)拷貝

高重復(fù)性重復(fù)性高，CV＜0.3％

高分辨率輕松區(qū)分1000拷貝以下2倍濃度差異

高速40分鐘完成40個(gè)PCR循環(huán)

技術(shù)創(chuàng)新采用Therma-BaseTM熱循環(huán)專利技術(shù)和先進(jìn)的光學(xué)檢測系

統(tǒng)，徹底消除邊緣效應(yīng)，保持穩(wěn)定優(yōu)異的檢測結(jié)果。

靈活分析模式多樣，絕對定量，相對定量，融解曲線分析等幾乎適用所有的檢測模式（SYBRGreenⅠ，TaqmanProbe，Hybprobe，SimpleProbe等）

模塊化可互換的96孔，384孔加熱模塊，用戶可以自助更換模塊，不需要工程師到場

自動(dòng)化平臺(tái)配以LIMS系統(tǒng)及自動(dòng)進(jìn)樣機(jī)械臂，可實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)程操作及全

自動(dòng)化運(yùn)作

用戶界面友好軟件直觀簡潔，易操作

LightCycler?480系統(tǒng)主要特點(diǎn)LightCycler?480系統(tǒng)主要參數(shù)溫度控制37℃－95℃最大升溫速率4.8℃最大降溫速率2.5℃激發(fā)光源標(biāo)準(zhǔn)氙燈檢測裝置冷CCD濾鏡激發(fā)波長（nm）：450，483，523，558，615發(fā)射波長（nm）：500，533，568，610，640，670軟件功能絕對定量、Tmcalling、含效率校正的相對定量、基因分型、產(chǎn)物鑒定等。

創(chuàng)新的PCR熱循環(huán)模塊設(shè)計(jì)Therma-BaseTM是一個(gè)內(nèi)壁布滿燈芯狀毛細(xì)管結(jié)構(gòu)的腔體，通過一系列的冷凝合蒸發(fā)，Therma-BaseTM高效地傳遞熱量，從而實(shí)現(xiàn)整板最大的溫度均一性。Therma-BaseTM核心優(yōu)勢優(yōu)異的空間溫度均一性快速、準(zhǔn)確的溫度調(diào)控40個(gè)循環(huán)＜40分鐘(384孔板)先進(jìn)獨(dú)特的光學(xué)系統(tǒng)

LC480系統(tǒng)使用寬光譜、高強(qiáng)度的氙燈作為光源。激發(fā)光經(jīng)過多次反射后形成與孔板大小相同、光強(qiáng)均一的光柱，有效消除邊緣效應(yīng)。激發(fā)波長和發(fā)射波長的任意組合，使得多種熒光染料和檢測模式可用于目前所有的實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)。LC480光學(xué)系統(tǒng)的核心優(yōu)勢：

－最靈活地選擇熒光染料及檢測模式

－整板數(shù)據(jù)的精確捕獲

－強(qiáng)大的多重PCR能力

多檢測通道支持所有的檢測模式

LightCycler?480系統(tǒng)支持目前所有檢測模式的使用，包括雜交探針、SYBRGreenIDNA結(jié)合染色、單探針、水解探針和分子信標(biāo)等等。多色熒光檢測系統(tǒng)，提供五色激發(fā)通道（450nm,483nm,523nm,558nm,615nm）和六色熒光檢測通道（500nm,533nm,568nm,610nm,640nm,670nm）,并具有顏色補(bǔ)償功能；可自由選擇，輕松實(shí)現(xiàn)多重或多色PCR。

公認(rèn)的性能獨(dú)特的軟件

基于用戶公認(rèn)的LC480軟件，新的LC480軟件采用羅氏獨(dú)特的算法來進(jìn)行高度精確、自動(dòng)化的數(shù)據(jù)分析。而且，新軟件還提供了許多新的的特性，讓用戶能夠輕松、省時(shí)地處理高通量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

LC480軟件設(shè)計(jì)宗旨是為了用戶需求量身定做。支持絕對定量、融解曲線分析、相對定量和自動(dòng)基因分型等功能。

LC480軟件的核心優(yōu)勢：采用公認(rèn)的優(yōu)秀算法來分析數(shù)據(jù)友好的用戶界面，簡單的快捷方式，便于進(jìn)行高通量樣品編輯及數(shù)據(jù)處理。軟件模塊化，用戶可根據(jù)自己的研究情況選擇性安裝。模塊系統(tǒng)概念LightCycler?480在系統(tǒng)初始配置的基礎(chǔ)上，還可根據(jù)客戶的特別要求，通過在系統(tǒng)中添加各種先進(jìn)的軟件分析模塊進(jìn)行系統(tǒng)升級(jí)，滿足用戶不同階段的研究需求。目前可提供的系統(tǒng)模塊包括：

－定性檢測

－絕對定量分析

－相對定量分析

－統(tǒng)計(jì)分析工具

－基因分型研究良好的兼容性

LightCycler?480可順利實(shí)現(xiàn)與現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)聯(lián)結(jié)，包括LIMS或是與自動(dòng)裝載微孔板的工作站聯(lián)用實(shí)現(xiàn)全流程的自動(dòng)化操作。

LightCycler?480系統(tǒng)增強(qiáng)流程管理及數(shù)據(jù)管理的能力：實(shí)現(xiàn)真正的自動(dòng)化流程現(xiàn)代化的軟件設(shè)計(jì)思路，可與LIMS連接兼容性符合數(shù)據(jù)管理要求（21CFR-11條款）LightCycler?480系統(tǒng)自動(dòng)化裝板過程

LightCycler480與ABI7900HT對比LightCycler480ABI7900HTPCR專利Roche擁有臨床和科研領(lǐng)域PCR專利ABI從Roche僅獲得科研領(lǐng)域PCR使用授權(quán)光源

氙光源，光源發(fā)光波長更廣范，強(qiáng)度更強(qiáng)，使得靈敏度達(dá)到最大化，通過折疊光路系統(tǒng)，激發(fā)光垂直射入每個(gè)反應(yīng)孔位，使各孔位光強(qiáng)均一化，解決邊緣效應(yīng)。氬離子激光光源，頂部激發(fā)光，各孔位有光程差，具有邊緣效應(yīng)，需加入校正試劑光路波長

450nm、483nm、523nm、558nm、615nm五色熒光488nm（單一激發(fā)光波長，對很多熒光素不適用）檢測系統(tǒng)

CCD成像系統(tǒng)，500nm、533nm、568nm、610nm、640nm、670nm六個(gè)檢測通道，具有顏色補(bǔ)償功能，解決熒光素干擾問題。CCD成像系統(tǒng)，通過光柵在500～660nm連續(xù)檢測。無顏色補(bǔ)償功能。（采用普通TaqMan探針技術(shù)只能進(jìn)行雙色或三色實(shí)驗(yàn)）加熱方式

采用therma-base專利技術(shù)的半導(dǎo)體加熱，解決模塊加熱的邊緣效應(yīng)，保證每個(gè)孔位受熱的均一性。半導(dǎo)體加熱，熱傳導(dǎo)最高速率3℃/秒，加熱模塊具有邊緣效應(yīng)，中心與周邊孔位受熱不均一加熱模式

*96孔/384孔模塊式加熱。*加熱模塊更換簡便，樣本加熱模塊與相應(yīng)熱蓋成套更換，溫控效果更佳，無需進(jìn)行熒光素校正。*384孔模塊升(降)溫最高速率6.3(3.5)℃/s*96孔模塊升(降)溫最高速率4.8(2.5)℃/s*標(biāo)準(zhǔn)模塊(96/384)和快速模塊(96)。*96/384模塊更換時(shí)只更換樣本模塊，使用同一熱蓋，更換模