酶促反應動力學實驗課件

實驗五酶促反應動力學實驗(Experimentsonenzymekinectics)

朱欣婷

生化教研室朱欣婷1.觀察底物濃度對酶促反應速度的影響。2.觀察抑制劑對酶促反應速度的影響。3.掌握用雙倒數(shù)作圖法測定堿性磷酸酶的km值。

生化教研室朱欣婷

酶促反應動力學:影響酶促反應速度(V)的因素:研究酶促反應的速度以及影響此速度的各種因素的科學。1.底物濃度[S]2.酶的濃度3.溫度4.pH5.酶的激活劑6.酶的抑制劑

生化教研室朱欣婷[S]與V的關系:米-曼氏方程Vmax--最大反應速度Km--米氏常數(shù)當V＝1/2Vmax時，Km＝［S］

Km值的物理意義:即Km值是當酶反應速率達到最大反應速率一半時的底物濃度。

生化教研室朱欣婷Km和Vmax值的測定(1)測定不同底物濃度的反應初速率，以V-[S]作 圖可以得到Vmax，再從1/2Vmax，可求得相應的 [S]，即Km值。Vmax?Vmax[S]vKm

生化教研室朱欣婷(2)雙倒數(shù)作圖法：將米氏方程式兩側取雙倒 數(shù)，以1/V-1/[S]作圖，得出一直線.Km和Vmax值的測定

生化教研室朱欣婷1.競爭性抑制曲線圖

競爭性抑制劑與酶的底物結構相似,與底物競爭酶的活性中心,從而阻礙酶與底物的結合.特點:（1）V下降，發(fā)生抑制（2）Vmax不變（3）Km增大，親和力下降

生化教研室朱欣婷2.非競爭性抑制曲線圖

抑制劑與酶活性中心以外的必需基團結合,不影響酶與底物的結合,底物與抑制劑之間沒有競爭關系.特點:（1）V下降，發(fā)生抑制（2）Vmax減?。?）Km不變

生化教研室朱欣婷3.反競爭性抑制曲線圖特點:(1)V下降，發(fā)生抑制(2)Vmax減小(3)Km減小

生化教研室朱欣婷C6H5NH3C-NH3C-CC-NH2C=O

H3C-NOH+

C6H5NH3C-NH3C-CC-N=

C=O

H3C-NOK3Fe(CN)6OH-4-氨基安替比林醌衍生物O-P=OONaONa磷酸苯二鈉+

H2OAKPOHHO-P=OONaONa+

酚醌衍生物為紅色,根據(jù)紅色深淺測出光密度值,計算不同底物濃度時酶的反應速度（以產(chǎn)物的生成量表示）,以1/V-1/[S]雙倒數(shù)作圖，獲得Km值。

生化教研室朱欣婷添加試劑（兩人一組，1人按照p45，另1人按照p50的要求量取溶液）37攝氏度水浴準確保溫15分鐘立即加入堿性溶液1.10ml終止反應0.3%4-氨基安替比林1.00ml0.5%鐵氰化鉀2.00ml每步充分混勻,室溫放置10分鐘以0管調(diào)零,波長510nm比色

生化教研室朱欣婷[計算公式]1.計算出無抑制劑和有抑制劑時各管中底物濃度S.2.計算出無抑制劑和有抑制劑時各管的反應速度V.反應速度用產(chǎn)物的生成量來表示:每ml酶液在37℃反應15分鐘產(chǎn)生酚的量[S]=C基質液×V基質液/V總產(chǎn)物生成量=A測/A標×C標酚×V標酚×1ml/0.1ml

生化教研室朱欣婷[作圖]1/[S]1/V-1/Km

根據(jù)圖獲得Km,并判斷磷酸氫二鈉為何種抑制劑.時間:儀器型號:儀器編號:作圖者:1/Vmax

生化教研室朱欣婷1.兩人一組，一人做無抑制劑的，另一人做有抑制劑的實驗。2.取樣量準確,保溫準確，加樣順序要一致，每步均混勻。3.同一組實驗用相同的比色計。4.作圖時,實驗點不在同一條直線上時,盡量使各點平均分布在直線的兩側,兩圖畫在同一坐標紙上,便于判斷。

生化教研室朱欣婷1.米氏常數(shù)（Km）有無單位？