第三部分細胞培養(yǎng)與細胞融合詳解演示文稿

第三部分細胞培養(yǎng)與細胞融合詳解演示文稿現(xiàn)在是1頁\一共有71頁\編輯于星期四優(yōu)選第三部分細胞培養(yǎng)與細胞融合現(xiàn)在是2頁\一共有71頁\編輯于星期四3第一部分植物細胞分離與培養(yǎng)1、物理方法2、化學方法3、酶法一、植物細胞的分離現(xiàn)在是3頁\一共有71頁\編輯于星期四41、物理方法將疏松的愈傷組織放入液體培養(yǎng)基中，經(jīng)搖床不斷振動，使細胞分散。若向細胞懸浮液中吹入脈沖壓縮氣體，細胞分散的更好。2、化學方法是在細胞懸浮培養(yǎng)中加入草酸鹽（能結(jié)合細胞間質(zhì)中果膠鈣的鈣離子）、秋水仙素（0.1mmol/L）或2,4-D或水解乳蛋白（對細胞分散有一定的作用）。3、酶法利用果膠酶和纖維素酶使細胞分離。現(xiàn)在是4頁\一共有71頁\編輯于星期四5單細胞培養(yǎng)：平板培養(yǎng)、看護培養(yǎng)、液體淺層培養(yǎng)、微室培養(yǎng)（微滴培養(yǎng)）等據(jù)培養(yǎng)基形態(tài)：分為固體培養(yǎng)與液體培養(yǎng)（懸浮培養(yǎng)）細胞固定化培養(yǎng)：

二、植物細胞的培養(yǎng)現(xiàn)在是5頁\一共有71頁\編輯于星期四6此法適用于難于培養(yǎng)的植物種類

優(yōu)點：簡便、成功率高缺點：不能在顯微鏡下直接觀察現(xiàn)在是6頁\一共有71頁\編輯于星期四7優(yōu)點：可以連續(xù)觀察細胞的分化和發(fā)育；缺點：通氣性差，水分難保持，pH易變動。

現(xiàn)在是7頁\一共有71頁\編輯于星期四8一）、懸浮培養(yǎng)(suspensionculture)

定義：是指將單個游離細胞或小細胞團在液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)增殖的技術(shù)。懸浮培養(yǎng)的過程現(xiàn)在是8頁\一共有71頁\編輯于星期四9一是增加培養(yǎng)細胞與培養(yǎng)液的接觸面，改善營養(yǎng)供應(yīng)；二是在振蕩條件下可避免細胞代謝產(chǎn)生的有害物質(zhì)在局部積累而對細胞自身產(chǎn)生毒害；三是振蕩培養(yǎng)可以適當改善氣體的交換；1、懸浮培養(yǎng)的優(yōu)點：現(xiàn)在是9頁\一共有71頁\編輯于星期四10懸浮培養(yǎng)物分散性良好，細胞團較小；均一性好，細胞形狀和細胞團大小大致相同；細胞生長迅速（2～3天加倍）。2、一個成功的懸浮細胞培養(yǎng)體系必須滿足怎樣的條件？現(xiàn)在是10頁\一共有71頁\編輯于星期四113、懸浮細胞培養(yǎng)方法

分披培養(yǎng)法

半連續(xù)培養(yǎng)法

連續(xù)培養(yǎng)法現(xiàn)在是11頁\一共有71頁\編輯于星期四12起始愈傷組織的質(zhì)量；接種細胞密度；培養(yǎng)條件：方式、溫度；繼代周期。4、影響懸浮細胞生長的因素有哪些？現(xiàn)在是12頁\一共有71頁\編輯于星期四13定義：即把細胞固定在一種惰性基質(zhì)上，細胞不能運動而培養(yǎng)液可在細胞間流動以供應(yīng)營養(yǎng)。按照其支持物不同可以分為兩大類：

A、包埋式固定化培養(yǎng)系統(tǒng)：瓊脂、瓊脂糖、藻酸鹽、聚丙烯酰胺；B、附著式固定化培養(yǎng)系統(tǒng)：尼龍網(wǎng)、聚氨酯泡沫、中空纖維。二）、細胞固定化培養(yǎng)

固定化細胞培養(yǎng)特點（見P112)現(xiàn)在是13頁\一共有71頁\編輯于星期四14流化床生物反應(yīng)器：細胞包裹在膠粒、泡沫顆粒中，通入空氣使固定化細胞懸浮于反應(yīng)器中。填充床生物反應(yīng)器：細胞固定在膠粒、泡沫顆?；蜻B續(xù)的多個網(wǎng)中，細胞固定不動，通過流動的培養(yǎng)液傳質(zhì)。常見的幾種固定化培養(yǎng)系統(tǒng)出口進口填充床生物反應(yīng)器出口進口流化床生物反應(yīng)器現(xiàn)在是14頁\一共有71頁\編輯于星期四15膜生物反應(yīng)器：－－常見的是中空纖維和螺線式卷繞反應(yīng)器，傳質(zhì)效率低，易阻塞，產(chǎn)物收獲較困難，投資大。細胞細胞營養(yǎng)物入口營養(yǎng)物入口營養(yǎng)物出口營養(yǎng)物出口營養(yǎng)物質(zhì)中空纖維反應(yīng)器螺線式卷繞反應(yīng)器現(xiàn)在是15頁\一共有71頁\編輯于星期四16三、植物細胞培養(yǎng)的應(yīng)用

植物細胞含有人類所需的成分，包括初生代謝物（蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂肪等）和次生代謝物（多酚類、香精油、生物堿、樹脂等），傳統(tǒng)提取分離這些物質(zhì)由于資源短缺和需求量的加大，難以滿足需求，通過細胞培養(yǎng)生產(chǎn)植物產(chǎn)品成為解決的有效途徑。

現(xiàn)在是16頁\一共有71頁\編輯于星期四171、生產(chǎn)藥用代謝產(chǎn)物生物堿（吡啶、喹啉、嗎啡）、蛋白質(zhì)類（氨基酸、植物抗生素、胰島素）、酚類化合物（黃酮類、單酚類、醌類）、萜類化合物（三萜皂甙、甾體皂甙、單萜、倍半萜、二萜）等。豆杉細胞紫杉醇（抗癌藥物）紫草細胞紫草寧（燒傷、痔瘡）例子：苦瓜細胞胰島素聚合草愈傷組織L-谷氨酰胺現(xiàn)在是17頁\一共有71頁\編輯于星期四182、生產(chǎn)天然食品、食品添加劑色素（胡蘿卜素、葉黃素、單寧）、甜味劑（甜菊苷）、香料物質(zhì)、飲料（可可堿、咖啡堿）等；3、生產(chǎn)殺蟲劑、殺菌劑萬壽菊細胞中獲得農(nóng)藥噻吩烷；除蟲菊的愈傷組織中得到除蟲菊脂；香草細胞中分離到魚藤酮殺蟲劑等；4、生產(chǎn)飼料、精細化工產(chǎn)品桑細胞培養(yǎng)養(yǎng)蠶飼料銀膠菌細胞培養(yǎng)橡膠現(xiàn)在是18頁\一共有71頁\編輯于星期四191、兩步培養(yǎng)技術(shù)（使用兩個反應(yīng)器）四、細胞培養(yǎng)中提高代謝產(chǎn)物的技術(shù)(1)第一個用于細胞生物量的累積，即盡可能快的使細胞量增長，用維持培養(yǎng)基；(2)第二個用于次級代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)，即誘發(fā)和保持次生代謝旺盛并積累相應(yīng)代謝產(chǎn)物，一般用生產(chǎn)培養(yǎng)基。現(xiàn)在是19頁\一共有71頁\編輯于星期四202、固定化培養(yǎng)技術(shù)

應(yīng)用淀粉、瓊脂、瓊脂糖、藻酸鈉、聚丙烯酰胺等作載體，將細胞固定在珠狀膠囊或各種形狀的支持物上。含CaCl2的培養(yǎng)基蓋子空氣出口海藻酸鈉+細胞懸浮液噴嘴無菌空氣入口現(xiàn)在是20頁\一共有71頁\編輯于星期四21

在培養(yǎng)體系中加入水溶性和脂溶性有機物，或是具有吸附作用的多聚化合物（如大孔樹脂等），使培養(yǎng)體系形成上、下兩相，細胞在水相中生長和合成次生物質(zhì)，次生物質(zhì)分泌出來轉(zhuǎn)到有機相中。3兩相培養(yǎng)技術(shù)(2)前提條件：a添加的有機物無毒害作用

b產(chǎn)物溶于有機物或被其吸收

c兩相易分離，有利于產(chǎn)物回收

d有機物等不吸收培養(yǎng)基中的有效成分現(xiàn)在是21頁\一共有71頁\編輯于星期四22(1)誘導(dǎo)劑：

可引起代謝途徑改變或代謝強度改變的物質(zhì),

如無機離子、真菌提取液、葡聚糖等。

作用機理:

可以調(diào)節(jié)代謝進程某些酶的活性,并對某些關(guān)鍵酶在轉(zhuǎn)錄水平上進行調(diào)節(jié)。4加入誘導(dǎo)劑及前體物現(xiàn)在是22頁\一共有71頁\編輯于星期四23作用：消除關(guān)鍵酶的阻礙、阻斷內(nèi)源性中間體的分隔和有效貯存，大大提高次生代謝物的產(chǎn)量。(2)前體物煙草：加入天仙子胺，則尼古丁產(chǎn)量降低而新煙堿含量大大提高現(xiàn)在是23頁\一共有71頁\編輯于星期四24第二部分

動物細胞分離與培養(yǎng)

在活體內(nèi)，動物細胞的形態(tài)與其功能密切相關(guān)。如肌細胞呈纖維狀，便于收縮；神經(jīng)細胞發(fā)出許多分支，便于形成網(wǎng)絡(luò)；紅細胞呈圓盤狀，便于氣體交換；上皮細胞呈不規(guī)則狀，便于覆蓋在器官表面相互擠壓?，F(xiàn)在是24頁\一共有71頁\編輯于星期四25原代培養(yǎng)（primaryculture):將組織取出來后，先用胰蛋白酶等使組織分散成單個細胞，然后配制成一定濃度的細胞懸浮液，再將該懸浮液放入培養(yǎng)瓶中，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，這個過程稱為原代培養(yǎng)。現(xiàn)在是25頁\一共有71頁\編輯于星期四26雞胚原代細胞：在無菌條件下采取9－10日齡雞胚↓除去頭(或僅除去喙和眼)、爪和內(nèi)臟，并剪成塊↓用Hanks液等充分沖洗↓剪將其剪成lmm大小的碎塊↓加入Hanks液或其他洗液，充分沖洗↓約4倍量的0.25％胰酶，并調(diào)整pH至7.6－7.8↓37℃水浴中感作30分鐘，每10分鐘輕輕搖動一次↓吸棄上層胰酶溶液↓用洗液輕洗2次后↓吸管充分吹打，直至形成均勻的細胞懸液↓準備細胞計數(shù)↓單層細胞培養(yǎng)現(xiàn)在是26頁\一共有71頁\編輯于星期四27傳（繼）代培養(yǎng)（secondaryculture,passage,split):細胞在培養(yǎng)瓶中貼壁生長。隨著細胞的生長和增殖，培養(yǎng)瓶中的細胞越來越多，需要定期地用胰蛋白酶使細胞從瓶壁上脫離下來，配制成細胞懸浮液，分裝到兩個或兩個以上的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，這稱為傳代培養(yǎng)?，F(xiàn)在是27頁\一共有71頁\編輯于星期四28在離體條件下，細胞一般表現(xiàn)為三種形態(tài)：（1）貼壁依賴型（anchorage-dependent)細胞；（2）非貼壁依賴型（anchorage-independent)細胞：也稱為懸浮型細胞，包括來源于血液的細胞和許多腫瘤細胞。（3）兼性貼壁細胞：主要是一些細胞系，如CHO細胞?，F(xiàn)在是28頁\一共有71頁\編輯于星期四29一、動物細胞體外培養(yǎng)的方法懸浮培養(yǎng)貼壁培養(yǎng)固定化培養(yǎng)大規(guī)模培養(yǎng)法現(xiàn)在是29頁\一共有71頁\編輯于星期四30類似于微生物發(fā)酵培養(yǎng)，但對機械剪切力敏感，常采用轉(zhuǎn)瓶和搖瓶培養(yǎng)方式。缺點：培養(yǎng)細胞密度低且易發(fā)生變異1、懸浮培養(yǎng)現(xiàn)在是30頁\一共有71頁\編輯于星期四312、貼壁培養(yǎng)貼壁培養(yǎng)

指必須將細胞帖附在固體介質(zhì)表面上（帶適量正電荷）才能進行細胞培養(yǎng)的方式，包括成纖維型細胞（如肌細胞)、上皮型細胞(如皮膚表皮細胞)。細胞貼壁培養(yǎng)過程

貼壁因子吸附于培養(yǎng)表面、細胞與表面接觸、細胞貼附于培養(yǎng)表面和細胞在培養(yǎng)表面上擴展等幾個過程?，F(xiàn)在是31頁\一共有71頁\編輯于星期四32細胞貼壁的過程：現(xiàn)在是32頁\一共有71頁\編輯于星期四33貼壁培養(yǎng)正常細胞在生長過程中隨著細胞數(shù)量不斷增多，生長空間日趨減少，細胞相互接觸匯合成片，呈現(xiàn)接觸抑制現(xiàn)象（Contactinhibition），而惡性細胞則無接觸抑制現(xiàn)象，因此接觸抑制可作為區(qū)分正常與癌細胞標志之一。癌細胞則由于營養(yǎng)成分的消耗和細胞代謝產(chǎn)物的影響而發(fā)生密度抑制（Densityinhibition）現(xiàn)在是33頁\一共有71頁\編輯于星期四34容易更換培養(yǎng)基；可采用灌注培養(yǎng)；方便產(chǎn)物表達；方便調(diào)節(jié)培養(yǎng)液與細胞的比例；易于觀察等。細胞貼壁生長優(yōu)點現(xiàn)在是34頁\一共有71頁\編輯于星期四35滾瓶系統(tǒng)培養(yǎng)

操作簡單，重復(fù)性好，但單位體積提供細胞生長的表面積小，產(chǎn)量低，監(jiān)測難。微載體培養(yǎng)

細胞貼附在微載體表面生長成細胞單層，而微載體懸浮于培養(yǎng)基中，綜合了單層培養(yǎng)與懸浮培養(yǎng)的優(yōu)點。貼壁培養(yǎng)細胞培養(yǎng)方法現(xiàn)在是35頁\一共有71頁\編輯于星期四363、固定化細胞培養(yǎng)技術(shù)固定化細胞培養(yǎng)（immobilizationculture)是指采用吸附（固體吸附劑）、共價貼附（與固相載體結(jié)合）、共價交連（用試劑處理形成細胞絮結(jié)）、包埋（將細胞包埋在多孔材料內(nèi)）和微囊化等方法將細胞固定在支持物上，或形成細胞絮結(jié)，或?qū)⒓毎度胛⒛一蚋叻肿泳酆衔锏木W(wǎng)絡(luò)中進行培養(yǎng)。該方法對貼壁依賴性細胞與非貼壁依賴性細胞均適用。

現(xiàn)在是36頁\一共有71頁\編輯于星期四374、大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)

動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)（large-scaleculturetechnique)是指在動物細胞生物反應(yīng)器中大量地培養(yǎng)動物細胞以獲得生物制品的技術(shù)。主要包括：微載體（microcarrier)培養(yǎng)技術(shù)中空纖維(hollowfiber)培養(yǎng)技術(shù)微囊化(micro-encapsulation)技術(shù)

現(xiàn)在是37頁\一共有71頁\編輯于星期四38（1）微載體培養(yǎng)技術(shù)微載體是指直徑在60-250μm的微珠、能夠適用于貼壁細胞生長，細胞貼壁于微載體上，微載體(和細胞)懸浮于培養(yǎng)基中，細胞在微載體表面逐漸生長成單層。優(yōu)點：是表面積與體積比大、可攪拌、便于顯微觀察、占用空間小、易放大；具有單層培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)的特點；缺點：是培養(yǎng)液用量大。玻璃微珠現(xiàn)在是38頁\一共有71頁\編輯于星期四39微載體的主要特性微載體的大?。和ǔＶ睆皆?00-200微米之間。微載體的密度：在慢速（40-50rpm)攪拌下，一般為1.03-1.05g/cm3微載體的表面電荷：表面電荷密度應(yīng)適中，太低不利于細胞貼附；太高則有細胞毒性?，F(xiàn)在是39頁\一共有71頁\編輯于星期四40微載體的種類以交連葡聚糖為基質(zhì)的微載體：DEAE-交連葡聚糖微載體、cytodex2微載體、dormacell微載體、cytodex3微載體等。以塑料為基質(zhì)的微載體：聚苯乙烯微載體、聚苯烯酰胺微載體。明膠(gelatin)微載體以玻璃為基質(zhì)的微載體以纖維素為基質(zhì)的微載體（DE-52、DE-53）液膜微載體（形成聚賴氨酸微液珠）大孔微載體（載體內(nèi)部有大孔互相連通）現(xiàn)在是40頁\一共有71頁\編輯于星期四41（2）中空纖維培養(yǎng)技術(shù)中空纖維培養(yǎng)技術(shù)由Knazek于1972年研制成功。空心纖維的材料是聚砜或聚丙烯等高分子物質(zhì)。纖維壁為半透膜。數(shù)百或數(shù)千條纖維捆成一束并集中開口，培養(yǎng)液從管腔流過，細胞貼附在纖維外壁生長。現(xiàn)在是41頁\一共有71頁\編輯于星期四42（3）微囊化技術(shù)微囊化培養(yǎng)由Lim等于1981年提出，其原理是采用一層親水性的半透膜將細胞包圍在珠狀的微囊內(nèi)，因而降低了培養(yǎng)液對細胞的剪切力，培養(yǎng)密度高。目前采用最多的是多聚賴氨酸/海藻酸法（PLL/ALG法），通過氯化鈣成囊，再用檸檬酸液化。缺點：成囊技術(shù)較難，成功率約50%。現(xiàn)在是42頁\一共有71頁\編輯于星期四43二、動物細胞體外生長的要求環(huán)境要求營養(yǎng)要求溫度pH值氣體滲透壓葡萄糖氨基酸無機鹽維生素動物血清等CO2培養(yǎng)箱現(xiàn)在是43頁\一共有71頁\編輯于星期四441）、溫度：不同來源的細胞，其培養(yǎng)的最適溫度不同。例如，昆蟲及魚類細胞25-28度，哺乳動物細胞一般為37度；細胞對低溫的耐受力比高溫強。溫度除直接影響細胞生長外，還與培養(yǎng)液的pH值有關(guān)，溫度低時CO2溶解性增加，從而影響pH。環(huán)境要求現(xiàn)在是44頁\一共有71頁\編輯于星期四452）、pH值：動物細胞培養(yǎng)最適pH值為，低于6.8或高于7.6均對細胞產(chǎn)生嚴重影響，甚至導(dǎo)致細胞死亡；一般原代培養(yǎng)的細胞對pH值要求嚴格，細胞系對一定范圍的pH值改變有抵抗力。酚紅是常用的指示劑，用來檢測pH的變化：紅色--pH7.4，橙色--pH7.0，黃色--pH6.5，藍紅色--pH7.6，紫色--pH7.8。現(xiàn)在是45頁\一共有71頁\編輯于星期四463）、氣體：細胞在培養(yǎng)初期對溶氧要求較少，但在快速增殖（對數(shù)增長期或指數(shù)增長期）要求有較多的溶氧。4）、滲透壓：培養(yǎng)液的滲透壓一般保持在與體液相同的水平，對細胞較為適宜。例如，生理鹽水或平衡鹽溶液?，F(xiàn)在是46頁\一共有71頁\編輯于星期四47動物細胞培養(yǎng)營養(yǎng)要求高，培養(yǎng)液的主要成分：葡萄糖、氨基酸、無機鹽、維生素和動物血清等。分天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基和無血清培養(yǎng)基。營養(yǎng)要求現(xiàn)在是47頁\一共有71頁\編輯于星期四481）、天然培養(yǎng)基：來自動物的體液或組織液，早期廣泛采用。例如：血清、血漿、和組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）等；優(yōu)點：營養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好，符合細胞生長的要求；缺點：成分不確定，來源復(fù)雜、有限，不能做到標準化，易發(fā)生支原體污染?，F(xiàn)在是48頁\一共有71頁\編輯于星期四49血清中含有：①多種蛋白質(zhì)（白蛋白、球蛋白、鐵蛋白等）；②多種金屬離子；③激素；④促貼附物質(zhì)，如纖粘蛋白、冷析球蛋白、膠原等；⑤各種生長因子；⑥轉(zhuǎn)移蛋白；⑦其它不明成分?，F(xiàn)在是49頁\一共有71頁\編輯于星期四50血清種類及來源：(1)胎牛血清(2)犢牛血清：犢牛出生后，不給吮乳，盡早由頸動脈無菌放血。(3)牛、馬、羊血清：通常由頸靜脈采取，或屠宰時由頸動脈放血采取。(4)其它血清：如兔血清和雞血清等，

現(xiàn)在是50頁\一共有71頁\編輯于星期四512）、合成培養(yǎng)基：根據(jù)動物的體液成份和細胞生長的需要，由各種營養(yǎng)物質(zhì)組合而成，如MEM、DMEM、RPMI1640等。優(yōu)點：能夠標準化生產(chǎn)，組分和含量相對固定，成本低；缺點：不能完全滿足細胞生長與增殖的需要。因此，在培養(yǎng)時，一般在培養(yǎng)液中加入一定量（10-15%）的血清，為細胞提供促貼壁因子或促生長因子。3）、無血清培養(yǎng)基現(xiàn)在是51頁\一共有71頁\編輯于星期四52第三部分細胞融合

細胞融合（cellfusion）是20世紀60年代創(chuàng)立的，是指在一定條件下，將兩個或多個細胞融合在一個細胞的過程，又稱細胞雜交。現(xiàn)在是52頁\一共有71頁\編輯于星期四53注意事項：動物細胞因沒有細胞壁，可以直接融合；植物細胞和微生物細胞具有細胞壁不能直接融合，需除去細胞壁后獲得原生質(zhì)體（protoplast）,而后再進行融合，又稱原生質(zhì)體融合?，F(xiàn)在是53頁\一共有71頁\編輯于星期四54一、細胞融合的方法：生物法——仙臺病毒法化學法——PEG等物理法——電融合法現(xiàn)在是54頁\一共有71頁\編輯于星期四551、生物法——仙臺病毒法

原理：病毒被膜具有凝聚細胞的能力，它一邊黏連一個細胞的表面，另一邊黏連另一個細胞的表面，從而使兩個細胞在病毒的作用下靠近發(fā)生凝結(jié)，誘導(dǎo)細胞的融合?，F(xiàn)在是55頁\一共有71頁\編輯于星期四562、化學法主要包括：鹽類融合法（NaNO3）高Ca2+和高pH值誘導(dǎo)法聚乙二醇（PEG）融合法PEG與高Ca2+和高pH值結(jié)合融合法現(xiàn)在是56頁\一共有71頁\編輯于星期四571）、鹽類融合法（NaNO3）的原理：

鹽（如NaNO3）能中和原生質(zhì)體表面的電荷，促進原生質(zhì)體的聚集，誘導(dǎo)細胞的融合。鹽類融合劑種類硝酸鹽類：NaNO3、KNO3、Ca(NO3)2氯化物類：NaCl、CaCl2

、MgCl2

、BaCl2葡聚糖硫酸鹽類：葡聚糖硫酸鉀、葡聚糖硫酸鈉現(xiàn)在是57頁\一共有71頁\編輯于星期四582）、聚乙二醇（PEG）融合法PEG的作用機理：

PEG分子具有輕微的負極性，與具有正極性基團的物質(zhì)形成氫鍵，在原生質(zhì)體之間形成分子橋，使原生質(zhì)體發(fā)生粘連進而促使原生質(zhì)體的融合?，F(xiàn)在是58頁\一共有71頁\編輯于星期四59PEG誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合過程現(xiàn)在是59頁\一共有71頁\編輯于星期四60PEG誘導(dǎo)融合的優(yōu)點與缺點優(yōu)點：融合成本低，勿需特殊設(shè)備；

融合子產(chǎn)生的異核率較高；

融合過程不受物種限制。缺點：

融合過程繁瑣；

PEG可能對細胞有毒害?，F(xiàn)在是60頁\一共有71頁\編輯于星期四613、物理法—電融合法

原理：

改變原生質(zhì)體質(zhì)膜表面的電荷和氧化還原電位發(fā)生改變，使異種原生質(zhì)體粘合并發(fā)生質(zhì)膜瞬間破裂，進而質(zhì)膜開始連接，直到閉合成完整的膜，形成融合體?，F(xiàn)在是61頁\一共有71頁\編輯于星期四62細胞電融合過程現(xiàn)在是62頁\一共有71頁\編輯于星期四63融合過程：?細胞膜的接觸：電場通電后，電流即通過原生質(zhì)體而不是通過溶液，使原生質(zhì)體極化而產(chǎn)生偶極子，從而使原生質(zhì)體緊密接觸排列成串；?膜的擊穿：高頻直流脈沖使原生質(zhì)膜擊穿，導(dǎo)致兩個緊密接觸的細胞融合在一起?，F(xiàn)在是63頁\一共有71頁\編輯于星期四64電融合優(yōu)點：不存在對細胞的毒害問題；融合效率高，重復(fù)性強；融合技術(shù)裝置精巧，操作簡便?？稍陲@微鏡下觀察或錄像融合過程，免去PEG誘導(dǎo)后的洗滌過程，誘導(dǎo)過程可控性強。現(xiàn)在是64頁\一共有71頁\編輯于星期四65二、細胞融合類型對稱融合（symmetricfusion）：即兩個完整的細胞或原生質(zhì)體融合。非對稱融合（asymmetricfusion）：利用物理或化學方法使某親本的核或細胞質(zhì)失活后再進行融合?，F(xiàn)在是65頁\一共有71頁\編輯于星期四66核或細胞質(zhì)失活的方法：物理方法：常采用射線處理，如X射線、γ射線等，使細胞核失活；化學處理：

核失活－碘乙酰胺、碘乙酸；

細胞質(zhì)失活－羅丹明（能抑制線粒體的氧化磷酸化過程）?，F(xiàn)在是66頁\一共有71頁\編輯于星期四67三、影響細胞或原生質(zhì)體融合的因素：⊙首先，細胞或原生質(zhì)體質(zhì)量；⊙其次，融合方法：

PEG誘導(dǎo)法：PEG規(guī)格、純度，作用時間

電誘導(dǎo)法：細胞或原生質(zhì)體密度、交流電壓、交變電場的振幅頻率、交變電場的處理時間、直流高頻電壓、脈沖寬度、脈沖次數(shù)。現(xiàn)在是67頁\一共有71頁\編輯于星期四68四、體細胞雜種的鑒定形態(tài)鑒定：根據(jù)雙親的形態(tài)學性狀觀察進行鑒定。細胞學鑒定：細胞器鑒定、染色體鑒定（如核型）。生化鑒定：同功酶鑒定。分子鑒定：RFLP鑒定、RAPD標記鑒定。現(xiàn)在是68頁\一共有71頁\編輯于星期四69幾種細胞融合成功的例子融合生物種類細胞來源成功年代煙草兩個種間葉——葉1972甘藍——青菜葉——根1972大