同濟(jì)實(shí)驗(yàn)課件色譜hplc

高效液相色譜

highperformanceliquidchromatography,HPLC液相色譜的柱效高效液相色譜儀分配色譜液固色譜離子交換色譜尺寸排斥色譜高效液相色譜

流動相是液體的色譜法稱為液相色譜法liquidchromatography,LC。在液相柱色譜中，采用顆粒十分細(xì)的高效固定相，并采用高壓泵輸送流動相，全部工作通過儀器來完成。這種色譜法稱為高效液相色譜法。液相色譜平板色譜柱色譜紙色譜薄層色譜離子交換柱色譜等特點(diǎn)1.與氣相色譜法比較，液相色譜法不受試樣揮發(fā)度和熱穩(wěn)定性的限制，非常適合于分離生物大分子，離子性化合物，不穩(wěn)定的天然產(chǎn)物以及其它各種高分子化合物等。2.液相色譜中的流動相不僅起到使試樣沿色譜柱移動的作用，而且與固定相一樣，與試樣發(fā)生選擇性的相互作用，這就為控制改善分離條件提供了一個(gè)額外的可調(diào)因素。高效液相色譜法包括四種基本類型:分配色譜partitionchromatography吸附色譜adsorptionchromatography,又稱液固色譜liquid-solidchromatography離子交換色譜ionexchangechromatography尺寸排斥色譜sizeexclusionchromatography,又稱凝膠色譜gelchromatography液相色譜的柱效液相色譜的速率理論I和III項(xiàng)分別表示渦流擴(kuò)散項(xiàng)和分子擴(kuò)散項(xiàng)。在液相色譜中，由于組分在液體中的擴(kuò)散系數(shù)比在氣相中小45個(gè)數(shù)量級，因此在液相色譜中，III通?？梢院雎圆挥?jì)。IV項(xiàng)為固定相傳質(zhì)阻力。II項(xiàng)是在流動區(qū)域內(nèi)，流動相的傳質(zhì)阻力。它指出流動相通過同一流路時(shí)，在接近固定相表面的流速比在流動中間的要慢一些。V項(xiàng)是在流動相停滯區(qū)域內(nèi)的傳質(zhì)阻力。以上各種傳質(zhì)阻力都將導(dǎo)致譜峰展寬。液相色譜中的柱外譜帶展寬發(fā)生在填充柱本身以外區(qū)域的譜帶展寬，稱為柱外譜帶展寬。柱外包括流動相攜帶溶質(zhì)通過管柱的進(jìn)樣系統(tǒng)，檢測區(qū)域和體系的各種組件的連接管道。由于流動相在管壁鄰近處的流速明顯地快于管中心區(qū)域的流速，從而導(dǎo)致柱外譜帶展寬。在氣相色譜中，柱外展寬很大程度上取決于縱向擴(kuò)散。而在液相色譜中，縱向擴(kuò)散明顯減慢，常常不被人們注意。柱外效應(yīng)對板高的總影響Hex

可用下式表示:高效液相色譜儀高壓輸液系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)分離系統(tǒng)檢測系統(tǒng)附屬裝置:梯度洗脫，自動進(jìn)樣及數(shù)據(jù)處理裝置等。高壓輸液系統(tǒng)有足夠的輸出壓力，使流動相能順利地通過顆粒很細(xì)的色譜柱，通常其壓力范圍為2540MPa。輸出恒定的流量，其流量精度應(yīng)在1%2%之間。輸出流動相的流量范圍可調(diào)，對分析儀器一般為3mL·min-1;制備儀器為1020mL·min-1。壓力平穩(wěn)，脈動小。高壓輸液系統(tǒng)由儲液罐，高壓輸液泵，過濾器，壓力脈動阻力器等組成，核心部件是高壓輸液泵。高壓泵應(yīng)具有如下性能:進(jìn)樣系統(tǒng)柱外的譜帶擴(kuò)寬現(xiàn)象會造成柱效顯著下降，尤其是用微粒填料時(shí)，更為嚴(yán)重。柱外的譜帶展寬通常發(fā)生在進(jìn)樣系統(tǒng)，連接管道及檢測器中。常用的進(jìn)樣方式有三種:直接注射進(jìn)樣:操作簡便，并可獲得較高的柱效，但這種方式不能承受高壓。停留進(jìn)樣:是在高壓泵停止供液，體系壓力下降的情況下，將試樣直接加到柱頭。這種進(jìn)樣方式操作不便，重現(xiàn)性差，僅在不得已時(shí)才采用。高壓六通閥進(jìn)樣:優(yōu)點(diǎn)是進(jìn)樣量的可變范圍大，耐高壓，易于自動化;缺點(diǎn)是容易造成譜峰柱前擴(kuò)寬。色譜柱在高效液相色譜中，色譜柱一般采用優(yōu)質(zhì)不銹鋼管制作。在早期，填充劑粒度大2075m,柱管徑一般為2mm，柱長50100cm。近年來，由于高效微型填料310m的普遍應(yīng)用，考慮管壁效應(yīng)對柱效的影響，故一般采用管徑粗45mm，長度短1050cm的色譜柱。液相色譜柱的填充一般采用勻漿法。具體操作是先將填料配成懸浮液，在高壓泵的作用下快速將其壓入裝有洗脫液的色譜柱內(nèi)，經(jīng)沖洗后，即可備用。檢測系統(tǒng)用于液相色譜中的檢測器，除應(yīng)該具有靈敏度高，噪音低，線性范圍寬，響應(yīng)快，死體積小等特點(diǎn)以外，還應(yīng)對溫度和流速的變化不敏感。為了將譜帶展寬現(xiàn)象減小到最低，檢測池的體積一般小于15L，當(dāng)接微型柱時(shí)應(yīng)小到15L以下。兩類基本類型的檢測器:溶質(zhì)性檢測器:它僅對被分離組分的物理或物理化學(xué)特性有響應(yīng)。如紫外，熒光，電化學(xué)檢測器等?？傮w檢測器:它對試樣和洗脫液總的物理或物理化學(xué)性質(zhì)有響應(yīng)，屬于這類檢測器的有視差折光，介電常數(shù)檢測器等。液相色譜檢測器性能附屬系統(tǒng)液相色譜儀的附屬系統(tǒng)通常包括脫氣，梯度洗脫，再循環(huán)，恒溫，自動進(jìn)樣，餾分收集以及處理等裝置。梯度洗脫裝置是一種極重要的附屬裝置。這種洗脫方式是將兩種或兩種以上不同性質(zhì)但可以互溶的溶劑，隨著時(shí)間改變而按一定比例混合，以連續(xù)改變色譜柱中沖洗液的極性，離子強(qiáng)度或pH等，從而改變被測組分的相對保留值，提高分離效率，加快分離速度。很明顯，液相色譜中的梯度洗脫和氣相色譜中的程序升溫相似。分配色譜液液色譜:固定相是通過物理吸附的方法將液相固定液涂在載體表面。為了防止固定液的流失，流動相需要預(yù)先用固定液飽和，這種方法除了較麻煩外，還不能用于梯度洗脫。鍵合相色譜的固定相是通過化學(xué)反應(yīng)將有機(jī)分子鍵合到載體或硅膠表面上。這樣不僅解決了固定相的流失問題，而且使固定相的功能得以改善，成為高效液相色譜中占壓倒優(yōu)勢的一種方法。分配色譜法是四種液相色譜法中應(yīng)用最廣的一種，類似于溶劑萃取?；瘜W(xué)鍵合固定相在分配色譜中，鍵合固定相一般采用硅膠為基體，利用硅膠表面的硅醇基Si-OH與有機(jī)分子之間成鍵，即可得到各種性能的固定相。一般說來，在分配色譜中鍵合的有機(jī)基團(tuán)主要有兩類:1.疏水基團(tuán)，如不同鏈長的烷烴C8和C18和苯基等;2.極性基團(tuán)，如丙氨基-C3H6NH2，氰乙基-C2H4CN，二醇-C3H6OCH2CHOHCH2OH，氨基-[CH2]3NH2等。正相液相色譜:固定相為極性，流動相為非極性的液相色譜。反相液相色譜:固定相為非極性，流動相為極性的液相色譜。反相鍵合固定相色譜:鍵合有疏水基團(tuán)的固定相的液相色譜。正相鍵合固定相色譜:鍵合有極性基團(tuán)的固定相的液相色譜。固定相和流動相的選擇烷烴<

醚<酯<酮<醛<酰胺<胺<醇<水選擇柱子的類型有三種方式:第一，固定相的極性與分析物質(zhì)的極性粗略匹配，用極性明顯不同的流動相洗脫;第二，流動相的極性與分析物質(zhì)的極性相匹配，用極性明顯不同的固定相;第三，固定相與分析物質(zhì)的極性極為相似，僅由流動相極性差異使分析物質(zhì)沿柱移動。由此，反相鍵合相色譜法多采用水-乙醇或水-乙氰體系，分離那些不或微溶于水但溶于醇類或其它與水混溶的有機(jī)溶劑的物質(zhì)。各類分析物質(zhì)的極性:溶質(zhì)分析物質(zhì)，固定相和流動相三者之間分子的作用力改善分辨率有三個(gè)途徑:即改變n,k

和。其中k

在很大程度上取決于流動相的組分，在實(shí)驗(yàn)中又最易調(diào)節(jié)，是改善分辨率的首選方法。雖然k值最佳范圍在25之間，但對復(fù)雜組分而言，可擴(kuò)大到0.520。分配色譜中最常用的溶劑的極性描述是由Snyder

提出的極性指數(shù)p。參數(shù)p是用物質(zhì)在三種溶劑中的溶解度來度量。二氧六環(huán)–低偶極質(zhì)子的接受體硝基甲烷–高偶極質(zhì)子的接受體乙醇–高偶極質(zhì)子的給予體在反相色譜中，提出了四溶劑最佳操作:甲醇，乙腈，四氫呋喃和水正相色譜的四溶劑:乙醚，氯仿，三氯甲烷和n-己烷。洗脫物的流出順序在反相鍵合相色譜中，極性大的組分先流出，極性小的后流出。在正相鍵合相色譜中，極性弱的組分先流出色譜。反相鍵合相色譜的保留機(jī)制可用所謂疏溶劑作用理論來解釋。把非極性的烷基鍵合相看作是在硅膠表面覆蓋了一層鍵合的十八烷基的分子毛。這種分子毛有強(qiáng)的疏水性。當(dāng)用極性溶劑為流動相來分離含有極性官能團(tuán)的有機(jī)化合物時(shí)，一方面，分子中的非極性部分與固定相表面上的疏水烷基之間產(chǎn)生締合作用，使它在固定相得到保留;另一方面，被分離物的極性部分受到極性流動相的作用，使它離開固定相，減少保留。反相鍵合相色譜的優(yōu)點(diǎn)通過改變流動相，容易調(diào)節(jié)k和;用單柱和流動相就能分離非離子化合物，離子化合物和可電離化合物;以便宜的水作為流動相的主體，以價(jià)格適宜且易純化的甲醇為有機(jī)改性劑;保留時(shí)間隨溶質(zhì)的疏水性增加而增加，常?？梢灶A(yù)言洗脫順序;色譜柱平衡快，適宜梯度洗脫。反相鍵合色譜正相鍵合相色譜法正相鍵合相色譜法是通過改變有機(jī)端極性官能團(tuán)的性質(zhì)，獲得了與未鍵合的硅膠填料十分不同的選擇性。在鍵合時(shí)，大多數(shù)酸性硅醇基被極性弱于它的氰基或氨基之類的官能團(tuán)所取代，減小了拖尾。同時(shí)極性鍵合相對流動相組成的變化響應(yīng)較快，特別有利于梯度洗脫。正相液相色譜可以分離烷烴和類脂，以及糖類，在水溶液中不穩(wěn)定的化合物必須用正相鍵合相色譜法進(jìn)行分離。液固色譜固定相保留機(jī)制流動相應(yīng)用固定相液固色譜的固定相是固體吸附劑，故又稱吸附色譜。在高效液相色譜中，常用的固定相是硅膠和氧化鋁。它們對試樣的保留時(shí)間順序大致如下:

醛酮醇胺砜亞砜酰胺羧酸硅膠的表面終端為硅醇或硅氧烷鍵。保留機(jī)制當(dāng)流動相M進(jìn)入色譜柱后，它便以單分子層形式占據(jù)吸附劑上的活性點(diǎn)。當(dāng)試樣分子X被流動相帶入柱后，在遷移過程中，發(fā)生如下交換吸附反應(yīng):Xm

+nMad

=Xad

+nMm式中下標(biāo)ad和m分別表示在吸附劑上和在流動相中。從上式可以看出，吸附劑表面上發(fā)生了試樣分子和流動相分子間的競爭吸附。吸附劑吸附試樣的能力，主要取決于吸附劑的比表面積和理化性質(zhì)，試樣分子的組成和結(jié)構(gòu)以及洗脫液的性質(zhì)等。流動相在吸附色譜中，使k

和

最佳化的有效變數(shù)是流動相的組成。在吸附色譜中，洗脫液的極性強(qiáng)度更多使用的是洗脫劑的強(qiáng)度參數(shù)0,0越大，表示洗脫劑的極性越強(qiáng)。0表示每單位面積吸附劑表面上溶劑的吸附能。在吸附色譜中選擇溶劑系統(tǒng)的方法與分配色譜中類似。即選擇兩個(gè)共存的溶劑，其中一個(gè)的強(qiáng)度參數(shù)0很大，另一個(gè)0則很小。然后通過改變這兩種溶劑的體積，以獲得適宜的k值。一般而言，0每增加0.05個(gè)單位，k

值就要降低34倍，使適當(dāng)改變k

值成為可能。不過0不能像p’那樣隨著兩溶劑的體積比而線性變化。當(dāng)遇到譜峰重疊時(shí)，可大致固定k

為常數(shù)，而改變?nèi)軇?qiáng)度相對強(qiáng)的一種溶劑，以改變，這樣常常可以改善所需要的分辨率。應(yīng)用液固色譜的分離對象與分配色譜可以相互替代，但主要還是互補(bǔ)。液固色譜最適宜分離那些溶解在非極性溶劑中，具有中等相對分子質(zhì)量且為非離子型的試樣。液固色譜也能分離那些具有相同極性基團(tuán)但數(shù)量不同的試樣。液固色譜特別適于分離異構(gòu)體。離子交換色譜和離子色譜離子色譜法ionchromatography,IC是一種離子交換色譜方法ion-exchangechromatography,IEC

。離子交換色譜法特別適于分離離子化合物，有機(jī)酸和有機(jī)堿等能電離的化合物和能與離子基團(tuán)相互作用的化合物。也可應(yīng)用于生物物質(zhì)的分離，如氨基酸，核酸，蛋白質(zhì)，藥物及它們的代謝物，維生素的混合物，食品防腐劑，血清等的分離。離子交換平衡離子交換色譜的柱填料是一種帶電荷官能團(tuán)的固定基質(zhì)。固定基質(zhì)上帶-SO3-等負(fù)電荷的稱為陽離子交換劑，帶-NCH33+等正電荷的稱為陰離子交換劑。為保持交換劑的電中性，基質(zhì)上還存在帶相同電荷數(shù)但正負(fù)號相反的離子，稱為反離子。在離子交換過程中，流動相中存在被分析離子與反離子之間發(fā)生競爭吸附。如果被分析離子為單價(jià)，則它與反離子之間的交換過程，可用下列平衡表示:陰離子交換:B+Y-+X-

B+X-

+Y-Kxy陽離子交換:A-M++Z+

A-Z+

+M+KZM陽離子交換反應(yīng)的平衡常數(shù)為:KZM

=[A-Z+]

[M+]/[A-M+

][Z+

]固定相離子交換劑的基質(zhì)有三大類:合成樹脂聚苯乙烯，纖維素和硅膠。流動相離子交換色譜通常在水介質(zhì)中進(jìn)行，為了增加帶有較大有機(jī)基團(tuán)的分子的溶解度，可采用水-乙醇混合溶劑作為流動相，有時(shí)甚至全部采用有機(jī)溶劑。在離子交換色譜中，常通過改變流動相中反離子的種類和濃度及流動相的pH等來控制k值，改變選擇性?？傮w來說，pH增加，在陽離子交換色譜上試紙保留值降低，而在陰離子交換色譜上試樣保留值增加，這主要是與有關(guān)組分的解離度有關(guān)。一般說來，最好將pH選在酸堿的pKa值附近。離子色譜法1雙柱離子色譜或抑制型離子色譜在分離柱與電導(dǎo)檢測器之間增加一根抑制柱，柱中填充的離子交換樹脂所帶電荷與分離柱相反。經(jīng)分離后的流出液首先通過抑制柱，進(jìn)行抑制反應(yīng)，除去洗脫劑中離子，在進(jìn)入電導(dǎo)檢測器中檢測，獲得扣除流動相背景的電導(dǎo)值。優(yōu)點(diǎn)是降低了流動相的總離子含量，提高檢測試樣離子的靈敏度。缺點(diǎn)在于抑制柱必須再生，并且由于抑制柱的存在而使色譜峰展寬，導(dǎo)致分辨率下降。單柱離子色譜或非抑制型離子色譜

它只有一根分離柱，不用抑制柱，故流動相直接由分離柱流到電導(dǎo)檢測器。單柱離子色譜法一方面是采用低濃度洗脫液，以降低洗出液的本底電導(dǎo)，另一方面是采用低容量的離子交換樹脂，使保留值保持不變。單柱離子色譜法因減少了抑制柱帶來的死體積，分離效率高，且能用普通HPLC儀改裝。主要缺點(diǎn)是難以在高電導(dǎo)介質(zhì)中測定低含量試樣粒子。離子色譜法2離子排斥色譜離子排斥色譜可以通過離子交換劑中的氫離子將弱酸的鹽轉(zhuǎn)換成相應(yīng)的酸來分離弱酸的鹽。同理，也可采用羥基型的陰離子交換劑分離弱堿的鹽。主要應(yīng)用在鑒定和測定許多酸性物質(zhì)，如牛奶，咖啡，酒及許多其它商業(yè)產(chǎn)品。在分離羧酸時(shí)，是以稀HCl溶液為洗脫劑，以銀離子形式的陽離子交換樹脂柱為抑制柱，并用電導(dǎo)檢測器檢測。銀離子與氯離子反應(yīng)除去了沖洗劑中的氯離子。被分析的物質(zhì)中未離解的酸，因不帶電荷被排斥于離子交換劑之外。尺寸排斥色譜

size-exclusionchromatography原理色譜柱填料和流動相應(yīng)用原理

尺寸排斥色譜也稱為凝膠色譜。與其它液相色譜方法不同，它是基于試樣分子的尺寸和形狀不同來實(shí)現(xiàn)分離的。凝膠色譜的填充劑是凝膠。它是一種表面惰性，含有許多不同尺寸的孔穴或立體網(wǎng)狀物質(zhì)。用這種填料填充的柱子的總體積VA

為:VA

=Vg+Vi+Vo式中Vg

是填料骨架的體積;Vi是填料孔體積;Vo

是填料顆粒之間的體積?？左w積Vi中的溶劑稱為固定相，而在粒間體積Vo中的溶劑稱為流動相。凝膠的孔穴大小與被分離的試樣的大小相當(dāng)。對于那些太大的分子，由于不能進(jìn)入孔穴而被排斥，所以隨流動相移動而最先流出。小分子則完全相反，它能滲入大大小小的孔隙中而完全不受排斥，所以最后流出。中等大小的分子則可滲入較大的孔隙中，但受到較小孔隙的排斥，所以介乎上述兩種情況之間。特點(diǎn)保留時(shí)間是分子尺寸的函數(shù)，因此有可能提供分子結(jié)構(gòu)的某些信息。保留時(shí)間短，譜峰窄，容易檢測，可用靈敏度較低的檢測器。固定相與分子間的作用力極弱，趨于零，即柱子不能很強(qiáng)地保留分子，因此柱壽命長。不能分辨分子大小相近的化合物。一般說來，分子量的差別需要10%以上時(shí)才能得到分離，所以這個(gè)方法不能分離復(fù)雜的混合物。它主要用來獲得分散性聚合物的相對分子質(zhì)量分布情況。色譜柱填料和流動相色譜柱用凝膠填料分為有機(jī)和無機(jī)兩大類。前者如交聯(lián)聚苯乙烯，后者如多孔硅膠和多孔玻璃等。一般來說，有機(jī)凝膠的柱效較高，但熱穩(wěn)定性，機(jī)械強(qiáng)度和化學(xué)惰性較差，易老化，且使用條件要求高；無機(jī)凝膠的柱效稍差，但可長期使用，性能穩(wěn)定。選擇流動相的主要依據(jù)是:在分離溫度下具有低的粘度。其沸點(diǎn)通常比柱溫高2050°C。能完全溶解試樣。溶劑與檢測器匹配，以使檢測器提供較高的靈敏度。必須考慮流動相對凝膠的影響。例如:聚苯乙烯型的凝膠不能用丙酮，乙醇作流動相。應(yīng)用凝膠過濾色譜:用水溶劑和親水填料，分離水溶性試樣；凝膠滲透色譜:以非極性有機(jī)溶劑和疏水填料，分離在極性小的有機(jī)溶劑中溶解的物質(zhì)。主要用來分離相對分子質(zhì)量高2000的化合物，如有機(jī)聚合物，硅化物以及從低分子量物質(zhì)或鹽中分離天然產(chǎn)物等。隨著填充劑的發(fā)展，也在水或非水系統(tǒng)中分離有機(jī)或者無機(jī)小分子化合物。通過測定相對分子量和相對分子質(zhì)量分布來鑒定高聚物?？捎糜谘芯烤酆蠙C(jī)理，選擇聚合工藝及條件，并考察聚合材料在加工和使用過程中相對分子質(zhì)量的變化等。在未知物的剖析中，凝膠色譜作為一個(gè)預(yù)分離手段，再配合其它分離方法，能有效地解決各種復(fù)雜的分離問題。超臨界流體色譜supercriticalfluidchromatography,SFC物