常用液相色譜柱的規(guī)范化使用與保養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程

******GMP文件******GMP文件第第1頁共8文件題目文件題目常用液相色譜柱的標(biāo)準(zhǔn)化使用與保養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程文件編號及版本號SOP-QC-000-00起草人起草日期年月日復(fù)制份數(shù)審核人審核日期年月日頒發(fā)部門質(zhì)量治理部批準(zhǔn)人批準(zhǔn)日期年月日生效日期年月日分發(fā)部門 質(zhì)量治理部、質(zhì)控室編訂依據(jù) 有用中藥藥品檢驗檢測技術(shù)指南目的：標(biāo)準(zhǔn)液相色譜柱的使用與治理；液相色譜柱標(biāo)準(zhǔn)化老化與再生；剖析液相色譜柱常見問題與解決方法。延長色譜柱使用壽命，降低色譜柱使用本錢。提高分析人員液相色譜柱使用與維護水平。范 圍：適用于使用高效液相色譜儀的儀器分析操作人員及相關(guān)治理人員。責(zé) 任：設(shè)備員、液相操作人員、質(zhì)控主管、質(zhì)量治理部經(jīng)理、質(zhì)量受權(quán)人。內(nèi) 容：定義液相色譜柱：指用于液相色譜分別的柱形固定相，由柱管、壓帽/卡套、篩板〔濾片〕、填料、接頭等組合而成，可用于液相色譜分析與制備。以提高色譜柱柱效和延長其使用壽命的處理過程。運載溶劑：指色譜柱生產(chǎn)廠商在柱出廠測試合格后飽和于色譜柱內(nèi)的適宜溶劑，以利于運輸保存，多與保存溶劑一樣。保存條件：指色譜柱生產(chǎn)廠商依據(jù)不同柱類型及其色譜柱填料的制備、鍵合、裝填、高壓包括凈化程序、凈化溶劑和保存溶劑、保存條件。保存溶劑：用于保存色譜柱并指定了溶劑組成與比例的溶液。反相色譜柱：以鍵合非極性基團的載體為填充劑填充而成的色譜柱。常見的載體有硅膠、聚合物復(fù)合硅膠和聚合物等。常用的填充劑有十八烷基硅烷鍵合硅膠、辛基硅烷鍵合硅膠和苯基鍵合硅膠等。正相色譜柱：用硅膠填充劑，或鍵合極性基團的硅膠填充而成的色譜柱，常見的填充劑有硅膠、氨基鍵合硅膠和氰基鍵合硅膠等。氨基柱〔-NH2〕：可以同時用于正相條件和反相條件，但多用于正相色譜條件。使用時需劑多用正相溶劑，例如：正己烷-乙腈〔99：1〕]。液相色譜柱的使用及保養(yǎng)文件題目

常用液相色譜柱的標(biāo)準(zhǔn)化使用與保養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程

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SOP-QC-000-00C8C8所以柱使用前需重飽和與老化。假設(shè)老化方法不正確或時間不夠，極易導(dǎo)致色譜柱在使用較短時間后即產(chǎn)生分別度下降、峰形變差、峰拖尾等柱效降低的狀況。需依據(jù)色譜柱不同類型選擇不同飽和與老化方法。老化老化前預(yù)備：預(yù)備穎的超純水及色譜級乙腈或甲醇，沖洗色譜儀器系統(tǒng)，保證儀器系統(tǒng)管路干凈。將色譜柱反向連接，不接檢測器。用水-有機相〔90：10～95:5，以0.3ml/min～0.6ml/min流速沖洗20min～30min〔目的是沖洗出柱入口端無機雜物與篩板孔雜物，使篩板正常?！?01095:5，以0.3ml/min～0.6ml/min流速沖洗20min～30min〔目的是沖洗出柱出口端無機雜物與篩板孔雜物，使篩板正常。2.1.1.430℃～4〔901～95:50.6ml/min4h〔目的是充飽和色譜柱，去除柱內(nèi)空氣。2.1.1.5〔10：9～5:9，以0.3ml/mi～0.6ml/min流速沖洗2h120min〔95:5→0:100〕0.3ml/min～0.6ml/min；100%0.3ml/min～0.6ml/min1h1001ml/min1h〔不同品牌色譜柱需區(qū)分對待。使用相平衡過渡:依據(jù)水相-有機相的比例，首先調(diào)整水-有機相的比例接近流淌相水相-有1ml/min30min用流淌相平衡，必需先用90%以上水進展預(yù)平衡30min以上，否則，會導(dǎo)致緩沖鹽在柱內(nèi)析出結(jié)晶，嚴(yán)峻時會將柱永久不行逆地損壞。然后更換成制并經(jīng)0.45μm濾膜過濾，超聲脫氣后的流淌相，按檢測方法平衡至少1h，待基線穩(wěn)定后，開頭進樣檢測。維護與保養(yǎng)柱首次使用，在進樣完成后需馬上對色譜柱進展凈化和有機溶劑飽和。方法是：用9010～95:，以0.6ml/min流速沖洗1h9010～95:5，以1ml/min流速沖洗30min〔或者承受溶劑梯度變化至100120min以上；最終用1001ml/min1h1001h再重復(fù)上述凈化程序〔但個別品牌C8C18色譜柱不耐受純水沖洗者例外。色譜柱使用幾次，均正常后，運行完畢凈化處理程序可簡化為：用水-有機相〔90：文件題目

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SOP-QC-000-001095:5，以1ml/min流速沖洗1h以上；再用1001ml/min流速沖洗30min當(dāng)供試品溶液中含有肯定量外表活性劑，屢次進樣后，由于外表活性劑會在篩板及硅膠外表形成表面膜，導(dǎo)致峰變寬、拖尾甚至分叉。此時，處理方法如下：將色譜柱反向連接，不接檢測器，用乙腈90：10～95:5，以0.6ml/min流速沖洗2h；再用100%乙腈，以0.6ml/min流速沖洗1h，901～95:5，以1ml/min流速沖洗1h以上；再1001ml/min1h凈化完畢，假設(shè)次日不再使用，選擇柱說明書中保存條件規(guī)定的保存溶劑沖洗10倍柱體積以上，可取下色譜柱，用封頭螺絲密封，交色譜柱治理人員入庫保存于防塵環(huán)境下，備案。有機相901～95:5，以0.6ml/min流速沖洗1h以上再用100%有機溶劑，以1ml/min洗30min以上；然后調(diào)整水-有機相的比例接近流淌相水相-有機相的比例，以1ml/min流速沖洗30min；1hpH值不能超過色譜柱pH范圍，過酸簡潔使鍵合相變態(tài)，過堿則易導(dǎo)致硅膠溶解柱床塌陷。常見故障處理與色譜柱再生當(dāng)色譜柱使用較長時間之后，就可能發(fā)生柱壓上升、分別度不好、柱效降低、峰形不好等狀況，這時就需要依據(jù)故障緣由對色譜柱進展清堵與再生，以延長色譜柱的使用壽命。具體緣由及處理方法如下：色譜峰分叉、禿峰等，需要進展清堵與彈性復(fù)原處理?！泊朔椒ㄟm合于任何類型有一樣故障的色譜柱的處理，不同的是溶劑要與相應(yīng)類型色譜柱匹配?！持饕幚矸椒ㄈ缦拢阂话銧顩r下，將色譜柱反接，不接檢測器，用純水或水-有機相〔多用甲醇、乙腈〕〔95:5〕以0.6ml/min流速沖洗約4h；再正向連接，接或不接檢測器，用純水或水-有機相〔多用甲醇、乙腈95:5〕以0.6ml/min流速沖洗約1；再提高流速至1.0ml/min沖洗1h，觀看柱壓變〔色譜柱進口5%左右的硝酸溶液超聲處理20min左右，再用純水超聲20min左右。用小勺清理掉柱進口污染的局部填料，再將用乙醇調(diào)和后的相應(yīng)的硅膠裝入柱入口〔也可用已經(jīng)報廢的同類柱中的填料替代〕，用平面不銹鋼小鏟壓緊填平至略高出柱管口，但量不宜太多，否則，壓得太緊柱壓會上升，然后裝上清洗過的篩板，留意篩板安裝方向必需與原裝一樣，最終緊固?！捕嘤眉状?、乙腈95:5〕以0.3ml/min流速沖洗約4h；再換成甲醇以0.5ml/min流速沖洗約2h；〔多用甲醇、乙腈95:5〕以2h0.5ml/min1h1ml/min文件題目

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SOP-QC-000-001h〔或乙腈〕1ml/min1h；最終2h，進樣測試即可。特別說明：如不是特別狀況，按其他方法可行，則最好不要反沖色譜柱和拆卸篩板。柱效降低：主要特征性現(xiàn)象有柱壓根本正常，但消滅拖尾峰、禿峰、分叉峰、前延峰、峰變寬、基線漂移、理論板數(shù)降低、分別度降低等。需要進展再生處理，具體方法如下：一般狀況下，順接色譜柱，按如下溶劑挨次及條件沖洗：95%水-5%甲醇〔或乙腈〕〔1.0ml/mi，1h以上10％甲醇〔1.0ml/min，1h以上；100％乙晴1.0ml/mi，1h以上；75％-25％異丙醇〔0.5ml/mi，10倍柱體積以上；10％異丙醇〔0.5ml/mi，10倍柱體積以上100％二氯甲烷0.5ml/mi10倍柱體積以上100％正己烷0.5ml/mi10上，依據(jù)實際狀況可無視100%異丙醇0.5ml/min20倍柱體積以上95%水-5%甲醇〔或乙腈〕〔0.5ml/min，30min1.0ml/min，102h進樣測試。在沖洗過程中，隨時關(guān)注柱壓變化，確保不超過4000psi；假設(shè)超出，可通過降低流速，上升柱溫來調(diào)整。假設(shè)上述方法效果不抱負，可按如上溶劑挨次和條件，先反接色譜柱沖洗；再順接色100%1ml/min2h；1ml/min30min；2h特別說明：再生過程必需隨時關(guān)注柱壓變化，柱壓過高易導(dǎo)致硅膠變形與開裂及鍵合相極性端連接挨次紊亂，同時要保證再生時間足夠。當(dāng)分析簡單樣品時間過長，尤其是中藥分析，假設(shè)消滅柱壓正常而色譜峰形變差，分別度降低時可嘗試如下方法再生先用5%甲醇〔或乙腈〕-95%水，將色譜柱反向連接，以1ml/min沖洗60min以上；再用四氫呋喃〔或丙酮〕以0.5ml/min沖洗60min以上〔去除脂類〕；再用65%甲醇〔或乙腈〕-35%水，以流速1ml/min沖洗60min；然后用純甲醇或乙腈沖洗30min1ml/min流速沖洗約30min；最終用流淌相平衡2h，進樣測試即可。特別提示：再生時最好選擇不具備在線脫氣的獨立泵送系統(tǒng)色譜儀器進展，以防正相溶劑損壞脫氣機密封膜或分子篩及比例閥等儀器周密部件。警告：無論何時，必需保證色譜柱柱床不枯槁，尤其是進樣檢測和柱沖洗過程中不能讓流淌相長時間〔30min以上〕走空，否則易使色譜柱枯槁且?guī)氪罅繋缀鯚o法排出的氣泡，甚至否則，易導(dǎo)致柱床機械性損壞，則再無再生可能。正相色譜柱的老化處理與使用保養(yǎng)程序購氨基柱老化處理及使用根本程序如下：文件題目

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SOP-QC-000-00假設(shè)在正相條件下使用：老化用正己烷-乙腈〔99：1〕0.5ml/min50使用依據(jù)待分析用正相流淌相極性選用極性相近的氯仿或二氯甲烷以一樣的流速沖洗101h以上，確保柱壓掌握在6000Psi基線平穩(wěn)后，進樣檢測。假設(shè)要使用的流淌相中含有緩沖鹽類，在使用流淌相平衡之前，先用不含緩沖鹽的同比例流淌相過渡，沖洗約10倍柱體積，避開緩沖鹽在分析柱內(nèi)析出。維護與保養(yǎng)0.5ml/min30；再用甲醇，1ml/min10；0.5ml/min10體積。假設(shè)使用的分析用流淌相中含有緩沖鹽類，分析完畢需先用不含緩沖鹽的同比例流淌相沖洗約30凈化完畢，假設(shè)次日不再使用，選擇柱說明書中保存條件規(guī)定的保存溶劑[一般用正己烷-乙腈〔99：1〕]沖洗10倍柱體積以上，可取下色譜柱，用封頭螺絲密封，交色譜柱治理人員入庫保存于防塵環(huán)境下，備案。重在正相條件下使用時，重復(fù)上述過程即可，時間可適當(dāng)削減一半左右。常見故障處理與色譜柱再生〔質(zhì)量較差的乙醚、四氫呋喃等溶劑中含有少量不互溶，必需用異丙醇過渡。當(dāng)使用氨基柱進展酸性物質(zhì)分析時，酸性物質(zhì)溶液有質(zhì)子存在，會使略帶負電荷的氨基官能團質(zhì)子化，導(dǎo)致使用一段時間后被測成分保存性質(zhì)有所轉(zhuǎn)變或柱效下降。這時，建議按0.5ml/min500.5ml/min500.5ml/min102h，進樣檢測即可。假設(shè)上述方法不湊效，可嘗試按以下程序沖洗與再生：0.5%～1.0％NH350%乙腈-50%1.0ml/min5～10文件題目

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SOP-QC-000-00NH350%乙腈-50%1.0ml/min5～10NH3NH3〔0.1％〕2h2.2.1.2在反相條件下使用：操作和維護與C18柱根本一樣，但需留意，沖洗溶劑中有機相不10%。老化用正己烷-乙腈〔99：1〕0.5ml/min30使用依次以0.5ml/min的流速，用等量的氯仿→異丙醇→甲醇→甲醇-水〔50：50〕分別沖洗柱子100.5ml/minpH11.030〔留意pH值切不行超過11.馬上用水以0.5ml/min的流速沖洗柱子約30最終換成反相流淌相平衡1h〔備注：假設(shè)要使用的反相流淌相中含有緩沖鹽類，在10pH值范圍及流淌相中水的比例，pH值越低越易發(fā)生鍵合相水解，流淌相中水的比例越高也越易發(fā)生鍵合相水解。最抱負的pH范圍在pH3.0-7.011.0〕維護與保養(yǎng)反相條件下使用完畢，凈化處理程序同C18柱,但需留意，沖洗溶劑中有機相不能10%。凈化完畢，先用甲醇以0.5ml/min的流速沖洗柱子約10倍柱體積；然后用異丙0.5ml/min10；最終用色譜柱說明書中規(guī)定的正相保存溶劑[一般用正己烷-乙腈〔99：1〕1ml/min10條件規(guī)定的保存溶劑沖洗10庫保存于防塵環(huán)境下，備案。常見故障處理與色譜柱再生在反相條件下使用時，-NH2鍵會水解，尤其是在該柱子pH范圍以外，在極端酸性和堿性條件下柱效會下降很快，所以故障率較高。假設(shè)消滅柱壓增高柱效降低等狀況，建議承受如下方法處理：假設(shè)流淌相含有緩沖鹽，先以流淌相比例的水-有機溶劑，以檢測分析時同流速沖301.0ml/min500.5ml/min100.6ml/min100.5ml/min101.0ml/min10體積，密封保存或用流淌相平衡2h左右〔假設(shè)流淌相含有緩沖鹽，需先用與流淌一樣比例的水-有機相以1.0ml/min流速沖洗約30min，進樣檢測即可。文件題目

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SOP-QC-000-0095％水-5％1.0ml/min流速沖洗約10THF〔四氫呋喃，以0.6ml/min流速沖洗約1095％乙腈1.0ml/min1095％乙腈-5％0.2-0.5mL/min夜；流淌相平衡2h〔假設(shè)流淌相含有緩沖鹽，需先用與流淌一樣比例的水-有機相以1.0ml/min流速沖洗約30min，進樣檢測即可。親水性色譜柱親水性色譜是正相色譜的一個變種。 HILICHPLCColumn親水性色譜柱是以超純硅膠為基質(zhì)，外表鍵合有二氧化硅(silica，弱酸性)，氰基〔cyano，弱酸性〕,二羥基〔diol，中性〕，二丙基乙酰胺〔valpromide，弱堿性丙基酰胺〔Venusil，弱堿性氨〔amino，弱堿性〕,吡弱堿性〕等親水基團的極性固定相。可用于正相、反相和親水液相色譜，是代替氨基柱和硅膠柱的最正確選擇。與傳統(tǒng)硅膠柱相比，具有更好的重現(xiàn)性和柱壽命。HILICHPLCColumn親水性色譜柱分別機理目前還存在著爭議，主要包括以下三個方面：安排機理、離子交換、偶極-偶極相互作用。而更多的試驗現(xiàn)象則說明HILIC的保存機理包含氫鍵作用、偶極作用和靜電作用等多種次級效應(yīng)，很難將其區(qū)分開來。HILICHPLCColumn親水性色譜柱適合于分別在反相色譜柱上不保存的極性化合物，尤其是對強極性堿性化合物的保存力量強，因此，其成為爭論藥物代謝、藥物覺察和組合化學(xué)科學(xué)的首選，尤其適用于LC-MS及LC-ELSD〔eg.水楊酸、糖類等。其檢測靈敏度可比使用反相色譜柱提高10～1000倍。其使用與保養(yǎng)根本同正相色譜柱。老化承受水-乙腈〔50:50〕以0.4～0.8ml/min流速，沖洗至少50倍柱體積進展一次預(yù)平衡；再用水-乙腈〔30:70〕以檢測條件流速，沖洗約10倍柱體積進展二次預(yù)平衡。使用用初始流淌相條件按檢測方法沖洗約20倍柱體積進展初始平衡；然后進樣1至2針，進展進樣平衡；再用初始流淌相條件按檢測方法沖洗約20倍柱體積，進展最終平衡；進樣檢測。維護與保養(yǎng)分析完畢后，首先用水-乙腈(90:10)以0.4～0.8ml/min30〔洗出強極性物質(zhì)〕；再用水-乙腈〔50:50〕以0.4～0.8ml/min流速，沖洗至少50倍柱體積〔洗出中等極性物質(zhì)〕；再用水-乙腈〔10:90〕以0.4～0.8ml/min流速，沖洗至少30倍柱體積〔洗出弱極性物質(zhì)及飽和色譜柱〕；假設(shè)次日不再使用，選擇柱說明書中保存條件規(guī)定的保存溶劑沖洗10倍柱體積以文件題目

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SOP-QC-000-00上，可取下色譜柱，用封頭螺絲密封，交色譜柱治理人員入庫保存于防塵環(huán)境下，備案。〔保存溶劑多為90%乙腈溶液，多保存于10℃左右環(huán)境中〕。特別留意：進樣檢測時，必需要保證流淌相中至少含有40%左右的有機相〔以乙腈多用〕。流淌相中假設(shè)需使用添加劑時，一般避開添加離子對試劑，推舉使用醋酸銨、甲酸銨以提高進樣重現(xiàn)性，但要慎重使用磷酸鹽等無機鹽，以避開沉淀在柱內(nèi)析出〔因其在較高濃度有機溶劑下難溶〕?？梢允褂玫话悴唤ㄗh使用甲酸等低分子量低黏性酸，且濃度多用0.