模式微生物基因組學(xué)

模式微生物基因組學(xué)第1頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五1原核生物如大腸桿菌（Escherichiacoli）和枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis），單細(xì)胞真核生物如啤酒酵母菌（Saccharomycescerevisiae）都被作為傳統(tǒng)的模式生物，這是因為它們結(jié)構(gòu)簡單、功能復(fù)雜、在實驗系統(tǒng)中具有內(nèi)在的優(yōu)勢。第2頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五E.coli

的非致病實驗菌株（K-12）被列為最早的全基因組測序?qū)ο螅谠诉z傳學(xué)、分子生物學(xué)、生物技術(shù)、尤其是DNA重組技術(shù)領(lǐng)域是首選的模式生物。B.subtilis

是第一個進(jìn)行全基因組測序的革蘭氏陽性菌（1997），并且被作為研究生物化學(xué)、生理學(xué)、系統(tǒng)發(fā)育的遺傳學(xué)范例。第3頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五S.cerevisiae

具有真核細(xì)胞的所有基本功能，并且人類疾病30％的陽性克隆與酵母同源，對S.cerevisiae基因產(chǎn)物的生物學(xué)作用做準(zhǔn)確的測定是極其重要的一步，這有助于我們提高對遺傳學(xué)上更復(fù)雜的、不易研究的多細(xì)胞動物的認(rèn)識。第4頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五基因組序列信息表明，超過30％的開放閱讀框（ORFs），包括E.coli的染色體和B.subtilis

的染色體沒有實際的功能。在S.cerevisiae中大約6000個預(yù)測基因中的三分之一仍被歸為未知細(xì)胞功能的閱讀框。第5頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五因此，除了基因組結(jié)構(gòu)分析以外，其它的系統(tǒng)研究得到的信息對大量的序列數(shù)據(jù)歸類于生物學(xué)上有意義的位置是十分必要的。功能遺傳學(xué)和相關(guān)的高通量綜合技術(shù)學(xué)和方法學(xué)（例如，DNA微陣列、全基因組突變、雙向凝膠電泳、雙雜交系統(tǒng)、蛋白微陣列）試圖在轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)、代謝組學(xué)、內(nèi)部作用組學(xué)的細(xì)胞區(qū)域中確定新的基因。第6頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五

用功能基因組學(xué)方法分析和綜合技術(shù)闡明模式生物的細(xì)胞區(qū)域生物信息學(xué)計算機建模DNA微陣列質(zhì)譜噬菌體展示雙雜交系統(tǒng)蛋白質(zhì)芯片2D二維電泳質(zhì)譜第7頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五2Escherichiacoli（大腸桿菌）：模式真細(xì)菌

E.coli作為原核生物學(xué)中的模式實驗生物，它的地位是無可比擬的。E.coli是最具特征的可自由生長的單細(xì)胞生物，并且它已用于研究細(xì)胞過程的生物學(xué)模式，如DNA的復(fù)制和修復(fù)、轉(zhuǎn)錄、代謝途徑、應(yīng)激反應(yīng)、信號傳導(dǎo)和遺傳學(xué)規(guī)律。第8頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五

盡管遺傳學(xué)研究已有幾十年，但E.coliK-12基因組中編碼4,288個蛋白的38%的基因仍然不清楚生物學(xué)功能。這表明我們的認(rèn)知還存在嚴(yán)重的不足，甚至是對于那些已被很好地研究過的模式生物。第9頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五2.1Escherichiacoli(大腸桿菌)基因組E.coli

序列數(shù)據(jù)除了使全基因組功能分析的方法成為可能，同時也揭示了一些新的基因?；蚪M序列的生物信息學(xué)分析也已經(jīng)預(yù)測了一些結(jié)構(gòu)和調(diào)控元件，這些是各種生物化學(xué)途徑或細(xì)胞機制方面知識所不能預(yù)見的。在搜索序列相似性的基礎(chǔ)上，芳香族化合物，如苯酚丙酸鹽的降解途徑的未知步驟被其他四個假定的mhp基因所揭示。第10頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五在基因組序列確定之前，mhp基因是已經(jīng)存在的，但沒有被鑒定。保守序列單元的出現(xiàn)確定了其中的一個mhp基因可能是由操縱子編碼的代謝途徑的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子。序列研究揭示了第二個以前沒有認(rèn)識到的操縱子，該操縱子含有一些類似于假單胞菌（Pseudomonas）基因，能夠降解芳香族化合物，如甲苯、苯、聯(lián)苯。第11頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五假設(shè)的操縱子由三個基因組成，包括能夠打開芳香環(huán)和氧化C1,C2的1,2-雙加氧酶，一個類似于二氫-1,2-雙加氧酶的開放閱讀框和基因編碼的鐵氧化還原蛋白還原酶。第12頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五2.2E.coli

轉(zhuǎn)錄組學(xué)全基因組核酸序列使研究者們能夠應(yīng)用cDNA方法或者基于寡核苷酸的微陣列分析方法，根據(jù)特異性刺激物、遺傳變異或者生理紊亂來評價基因組轉(zhuǎn)錄圖。第13頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五熱激應(yīng)答

熱激應(yīng)答，有時一般也稱作應(yīng)激應(yīng)答，是一種內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的機制。這種機制是由活細(xì)胞在對溫度升高不適應(yīng)的情況下顯示出來的。這種進(jìn)化學(xué)上保守的分子對熱反應(yīng)的應(yīng)答是一種限制性蛋白－熱激蛋白－誘導(dǎo)合成的。除了熱激外，其他不利的生理條件，如暴露在乙醇中或轉(zhuǎn)入重金屬，都能引起熱激蛋白產(chǎn)量的提高。第14頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五在過熱條件下，熱激蛋白除了防止細(xì)胞蛋白變性和聚集外，也表現(xiàn)出一些對普通的生理生長所必要的功能，如輔助糾正多聚結(jié)構(gòu)的組裝，使新翻譯的多肽折疊到它們自然的三級結(jié)構(gòu)。因此，熱激蛋白通常更多地被稱為分子陪伴。第15頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五在細(xì)菌中，細(xì)胞對熱激的反應(yīng)首先在E.coli中被發(fā)現(xiàn)并得到細(xì)致地研究。由于熱激反應(yīng)的保守性，它已被作為一種模式系統(tǒng)來研究其他原核生物（如古菌）的調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。盡管微陣列提供了E.coli中對應(yīng)于溫度升高時的一系列潛在的參與者，但需要用與基因表達(dá)圖譜相結(jié)合的其他方法給出一個完整的描述：細(xì)胞是如何整合和調(diào)控這些功能，對環(huán)境應(yīng)激產(chǎn)生一致和快速的適應(yīng)反應(yīng)。第16頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五細(xì)胞代謝生長的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析盡管我們已經(jīng)知道一些與特定的生物合成或者代謝過程（如色氨酸生物合成）相關(guān)的必要的操縱子或基因，但不是出于這一目的的其它的基因在還沒有發(fā)展更綜合更全面的實驗方法之前還沒有被鑒定，這些基因影響著某些代謝行為或者受到某些代謝行為的影響。第17頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五E.coli的色氨酸操縱子是分析的最透徹的細(xì)菌生物合成操縱子之一。色氨酸操縱子的五個基因（依次是trpE、trpD、trpC、trpB、trpA）編碼分支酸轉(zhuǎn)化為色氨酸途徑的酶。色氨酸操縱子的轉(zhuǎn)錄受抑制蛋白TrpR的抑制調(diào)控，也受一種稱為轉(zhuǎn)錄弱化作用的完全不同的調(diào)節(jié)模式的抑制調(diào)控。第18頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五功能基因組學(xué)，主要體現(xiàn)在微陣列介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄圖，允許我們看到的不僅僅是微生物生理的某一焦點方面，如色氨酸代謝、特異性基因或調(diào)節(jié)子如何與基因表達(dá)的所有其他方面相互作用；而且還提供了一個觀察基因組表達(dá)的視窗，如細(xì)胞在葡萄糖上生長的生理能力。第19頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五功能基因組學(xué)的價值在一項分析基因組表達(dá)的研究中得到了證實，即E.coli在含0.2％葡萄糖的基本培養(yǎng)基上和在含0.2％的肉湯培養(yǎng)基上對數(shù)生長后期的基因組表達(dá)。E.coli細(xì)胞在含葡萄糖的富營養(yǎng)培養(yǎng)基上的生長速度（世代時間[G]=25min）是含葡萄糖的基本培養(yǎng)基的兩倍（G=57min）第20頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五DNA陣列表明，某些功能上的基因轉(zhuǎn)錄的差異性與兩種生長條件下細(xì)胞生理性狀一致，因此提供了依賴于基因表達(dá)和生物合成調(diào)節(jié)子全面調(diào)節(jié)的生長速率研究。與119個（占所有標(biāo)注基因的2.8％）在富營養(yǎng)培養(yǎng)基上生長的基因相比，225個（占所有標(biāo)注基因的5.2％）在含葡萄糖的基本培養(yǎng)基上生長的基因有很高的表達(dá)水平（比例≥2.5倍）。第21頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五

影響生長速度的開放閱讀框被分成以下幾種功能類型：

1、翻譯裝置；2、氮代謝；3、氨基酸生物合成；4、維生素、輔助因子、輔基、載體的生物合成；5、核苷酸生物合成；6、脂肪酸生物合成和降解；7、碳源和能源代謝；8、細(xì)胞過程和整體調(diào)節(jié)子。第22頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五

在以葡萄糖為碳源和能源的豐富培養(yǎng)基上E.coli生長的標(biāo)志性特征是快速的生長速度，生物合成途徑的停止，大分子合成基因，最顯著的是蛋白質(zhì)合成基因表達(dá)的增多。所有這些生理方面的特征在基因組表達(dá)水平通過利用全基因組序列信息和使用DNA陣列技術(shù)得以揭示。微陣列分子也揭示了在基本葡萄糖培養(yǎng)基上生長的細(xì)胞，其碳和能量代謝基因的表達(dá)量是豐富培養(yǎng)基上生長時的4倍。第23頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五利用綜合的轉(zhuǎn)錄圖譜，我們能夠開始對這些未分類的基因根據(jù)它們與相似的或相關(guān)的基因共調(diào)節(jié)來描述一項假定的功能。此外，從微陣列實驗中得到的可測試的假設(shè)可能提供證據(jù)來證實未知基因的生物學(xué)功能。因此，基于微陣列的轉(zhuǎn)錄圖譜為進(jìn)一步研究特征性模式生物如E.coli提供了進(jìn)一步的動力。第24頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五NtrC（氮調(diào)節(jié)蛋白C）調(diào)節(jié)子微陣列遺傳學(xué)技術(shù)具有很多優(yōu)勢，它能夠在特異性調(diào)節(jié)蛋白轉(zhuǎn)錄控制下檢測所有的基因和操縱子。DNA微陣列技術(shù)促進(jìn)了多基因網(wǎng)絡(luò)的出現(xiàn)，如Ntr（氮調(diào)節(jié)）系統(tǒng)，它能根據(jù)E.coli細(xì)胞的生理狀態(tài)信息執(zhí)行一項細(xì)胞功能，通過吸收環(huán)境中可利用的氨得到氮，從而進(jìn)行氨基酸生物合成。第25頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五

對外部有限的氮的分子反應(yīng)是在氮調(diào)節(jié)蛋白C(NtrC)的控制下基因轉(zhuǎn)錄的活化。NtrC蛋白激活δ54-基因的轉(zhuǎn)錄，氮的吸收控制（Nac）蛋白通過激活氮限制條件下δ70-基因的轉(zhuǎn)錄，從而作為NtrC和δ70-操縱子的適配器。細(xì)胞以這種方式整合各組基因和操縱子的表達(dá)以獲得全面的適應(yīng)反應(yīng)。這種多基因條件導(dǎo)致了基因產(chǎn)物的表達(dá)，這些產(chǎn)物能夠允許細(xì)胞利用環(huán)境中任何殘留的氨，然后轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌牡?，從而在氮限制條件下能夠最小化生長。第26頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五為了完全揭示E.coli的NtrC/Nac調(diào)節(jié)子，Zimmer和他的同事們（2000）使用DNA微陣列將NtrC激活基因過表達(dá)的突變株的整體轉(zhuǎn)錄水平與具有ntrC無效等位基因菌株中的整體轉(zhuǎn)錄水平相比較。盡管氮的網(wǎng)絡(luò)已經(jīng)在E.coli中得到很深入的研究，但綜合的基因表達(dá)圖譜鑒定了許多新的NtrC調(diào)節(jié)子。第27頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五這些新的與ATP特異性結(jié)合的操縱子轉(zhuǎn)運腐胺（potFGHI）、寡肽（oppABCDF）、二肽（dppABCDF）、核苷酸（nupC）和D-丙氨酸/D-絲氨酸/甘氨酸（cycA）的次級離子共轉(zhuǎn)運。其他一些新鑒定的NtrC/Nac-控制基因，包括幾個編碼假定蛋白（ycdGHIJKLM,yeaGH,yedL）操縱子，再次證明了微陣列表達(dá)圖譜對于在某些細(xì)胞功能中說明未知基因的能力。第28頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五從全基因組的角度檢測NtrC/Nac調(diào)節(jié)子表明，NtrC控制了大約2％的E.coli基因，其中大部分是底物轉(zhuǎn)運的操縱子。這些基因的假定功能強調(diào)了E.coli在清除環(huán)境中含氮化合物的能力，作為抵御氮饑餓的第一道防線。第29頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五2.3E.coli蛋白組學(xué)除了基因組結(jié)構(gòu)分析和轉(zhuǎn)錄組學(xué)特征分析使用陣列技術(shù)外，蛋白組學(xué)分析依然是功能研究的重要組成，因為蛋白組學(xué)分析能夠觀察到基因表達(dá)的最基本水平。與蛋白組學(xué)分析相關(guān)的中心問題是序列分析預(yù)測的開放閱讀框的可靠性，蛋白質(zhì)的物理特征是否與那些開放閱讀框預(yù)測的一致。而且，已測序生物的蛋白組學(xué)的研究揭示了重要的特征，這些特征僅從基于基因組序列的理論蛋白組學(xué)是推斷不出的。第30頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五

其它的信息包括生物體內(nèi)蛋白的豐度，后翻譯修飾，蛋白水解。蛋白組學(xué)分析的方法通常包括雙向凝膠電泳（2-DE），然后是用N-末端測序或質(zhì)譜的點鑒定。已有的全基因組序列對從雙向凝膠中提取的蛋白種類進(jìn)行快速鑒定很重要。第31頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五僅是基因組序列不能對最終在細(xì)胞中產(chǎn)生的翻譯產(chǎn)物在生化特性和功能上提供一個全面準(zhǔn)確的描述。除了個別存在差異，大部分情況下，由實驗得到的等電點值和分子量值與基因組序列預(yù)測得到的值相當(dāng)一致。觀察值和預(yù)期值之間的偏差可能由基因組序列的高度加工蛋白或錯譯造成。第32頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五用轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，蛋白表達(dá)和豐度的主要差異能在不同的細(xì)胞狀態(tài)下測得。在Link和他的同事們的研究報道中，作者分別在最低限度的葡萄糖培養(yǎng)基中的指數(shù)生長期和豐富培養(yǎng)基中的穩(wěn)定生長期檢測了E.coli蛋白組的動態(tài)特性。2-DE分析不能全面的分析細(xì)胞的蛋白組學(xué)，幾個在豐富培養(yǎng)基上穩(wěn)定生長期早期鑒定的高豐度的蛋白質(zhì)在葡萄糖最低限度培養(yǎng)基上生長的細(xì)胞中沒有觀察到。第33頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五這些蛋白質(zhì)是：⑴色氨酸酶（TnaA），用于色氨酸的降解和合成；⑵半乳糖結(jié)合蛋白（MglB），在半乳糖轉(zhuǎn)運入細(xì)胞的過程中起作用；⑶饑餓誘導(dǎo)蛋白（Dps），它與DNA形成了穩(wěn)定的復(fù)合物，因此保護(hù)DNA不被氧化毀壞。這項研究表明了一個生物學(xué)原則：細(xì)胞改變它們的蛋白成分以適應(yīng)變化的環(huán)境條件。第34頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五此外，還表明，更綜合的分析方法，如最近發(fā)展的基因組學(xué)和蛋白組學(xué)的方法，正在改變我們觀察活細(xì)胞的方法，甚至改變對已經(jīng)被很好地描述過的模式生物的認(rèn)識，如E.coli。蛋白組學(xué)能夠被用來加強和支持由基因組序列分析提供的預(yù)測信息。第35頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五2.4E.coli的模式代謝：計算機代謝組學(xué)近來的基因組科學(xué)的重要目標(biāo)是將細(xì)胞的核苷酸序列信息與生理功能相聯(lián)系。由于從基因組序列和功能研究得到的大量數(shù)據(jù)還在不斷的積累，迫切需要能夠在硅片上建立系統(tǒng)的闡述和發(fā)展復(fù)雜而完整的細(xì)胞系統(tǒng)的代表或數(shù)學(xué)模型。第36頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五圖：用已有基因組序列、生理生化數(shù)據(jù)重建微生物代謝網(wǎng)絡(luò)

以基因組序列為框架，再結(jié)合生理生化實驗數(shù)據(jù)，能夠在芯片上構(gòu)建代謝途徑的信息第一步，利用現(xiàn)有的相關(guān)基因組數(shù)據(jù)，生理生化數(shù)據(jù)重新構(gòu)建微生物的代謝圖譜。第二步，給代謝功能限制條件。第三、四步中，在細(xì)胞水平限制條件，以縮小符合要求的表型范圍。通過這些步驟來預(yù)測代謝表現(xiàn)（例如，可以預(yù)測基因刪除后對細(xì)胞和生物化學(xué)結(jié)果的影響）。第37頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五

這些研究表明：代謝行為的計算機分析能夠簡化生長實驗的設(shè)計和報告基因敲除的鑒定。此外，芯片分析可能會有助于鑒定丟失的（例如，假定的）或者不正確的功能分配，這些功能分配從基因組序列注釋中得到。然而，這一領(lǐng)域的最新研究還處于初期，這種計算機模式和計算機模擬需要反復(fù)的實驗研究來改進(jìn)芯片模式。第38頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五3Bacillussubtilis:革蘭氏陽性菌的典范Bacillussubtilis是革蘭氏陽性菌中最具特色的典型。它是一種需氧的桿狀菌，能夠形成內(nèi)生孢子，在土壤和水中普遍存在。Bacillussubtilis和它關(guān)系相近的菌具有商業(yè)意義，因為它們具有代謝多樣性，尤其是它們產(chǎn)生胞外水解酶（如，淀粉酶和蛋白酶）的能力，這些水解酶能夠降解多糖、核酸、脂質(zhì)。降解產(chǎn)物將作為生物體的碳源。第39頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五

除了大分子水解酶的產(chǎn)生，Bacillussubtilis在營養(yǎng)饑餓的條件下開始次級代謝途徑，如抗生素（如surfactin、fengycin、difficidin）的產(chǎn)生。營養(yǎng)性缺乏的條件使細(xì)菌可形成很獨特的結(jié)構(gòu)——化學(xué)物質(zhì)、輻射和干旱抗性的芽孢，這種條件下細(xì)菌生長難以重建。這些生理特征和遺傳操縱的特征導(dǎo)致Bacillussubtilis成為研究革蘭氏陽性菌的模式實驗生物。它的全基因組序列在1997年發(fā)表，是第一個得到全基因組序列的革蘭氏陽性真細(xì)菌。第40頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五3.1B.subtilis基因組在已經(jīng)完成測序的基因組中，即使是研究透徹的模式物種，在全部預(yù)測能編碼蛋白的基因中也有30％～60％不能根據(jù)序列的同源性來劃分其功能。B.subtilis也不例外，它有42％的基因功能是未知的。盡管幾十年來進(jìn)行著大量的研究，但B.subtilis中只有約1，200個基因（約30％）的功能有實驗證明，這說明我們要完全了解B.subtilis的生理特征，必須在發(fā)現(xiàn)和確認(rèn)新基因功能方面付出更多的努力。第41頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五土壤微生物，如B.subtilis，在進(jìn)化中得到復(fù)雜的調(diào)控系統(tǒng)以快速應(yīng)對周圍多變的環(huán)境條件和脅迫。細(xì)胞對環(huán)境壓力適應(yīng)性的調(diào)節(jié)在很大程度上受雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的影響，該途徑在原核生物中廣泛存在。雙組分調(diào)控系統(tǒng)包括一個傳感蛋白激酶和與它同源的應(yīng)激因子。在B.subtilis中，利用與已知蛋白序列的相似性，37個傳感蛋白激酶和34個編碼應(yīng)激因子的基因已經(jīng)被確定。第42頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五

微生物經(jīng)常面臨著許多環(huán)境壓力的脅迫（如溫度、濕度或可用營養(yǎng)物質(zhì)的變化）。B.subtilis的基因組序列表明，有43個溫度休克蛋白和總應(yīng)激蛋白在細(xì)菌適應(yīng)環(huán)境變化中起到重要作用。這些蛋白和它們在大腸桿菌中的同源蛋白有很高的相似性，說明革蘭氏陰性菌和陽性菌的細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)在進(jìn)化上是保守的。第43頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五ABC轉(zhuǎn)運蛋白是B.subtilis中確定的功能最多的一組蛋白（Kunstetal.,1997），反映了兩大類細(xì)菌外莢膜的結(jié)構(gòu)差異。另外一些ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運蛋白可能增強了B.subtilis抗毒害的能力。B.subtilis基因組中預(yù)測共有77種ABC轉(zhuǎn)運蛋白，已經(jīng)通過克隆基因?qū)λ鼈冇猩钊氲牧私?。?4頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五E.coli和B.subtilis全基因組的測定，可全面地研究它們相關(guān)的基因組多樣性。這種比較基因組的分析提出了一個觀點，即可能在10億多年前，真細(xì)菌進(jìn)化分為革蘭氏陰性和陽性兩大類。盡管在基因組大小上B.subtilis（4.2Mb）和E.coli（4.6Mb）類似，并且預(yù)測的B.subtilis基因約有1，000種（25％）和E.coli完全同源，但在基因的功能和操縱子結(jié)構(gòu)上兩個基因組之間存在一些明顯的差異。第45頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五和E.coli不同的是，許多B.subtilis基因參與次生代謝物如抗生素的合成。B.subtilis將近有4％的基因編碼大量的多功能酶，這些酶和鏈霉菌參與抗生素合成的蛋白質(zhì)序列相似?；蚪M序列分析還清楚表明至少有10種原噬菌體或原噬菌體的痕跡，說明噬菌體侵染在遺傳信息空間傳遞上起了重要作用。第46頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五通過觀察氨基酸和嘌呤合成基因來研究兩個基因組在基因組織方面的差異，顯示一些E.coli合成精氨酸和嘌呤的基因分散在染色體上，而在B.subtilis的同源基因則整合在操縱子上。E.coli和B.subtilis的基因組中大量未知基因功能的確定將使我們更深入的了解這些模式物種的進(jìn)化、生理以及功能分化。第47頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五3.2B.subtilis轉(zhuǎn)錄組學(xué)B.subtilis的全基因測序完成以來，人們建立了許多系統(tǒng)的功能分析來描繪不同生長條件、環(huán)境脅迫或抗逆、遺傳突變情況下基因的功能和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。下面我們將討論基于微陣列技術(shù)的B.subtilis熱休克反應(yīng)的功能分析，雙組分調(diào)控系統(tǒng)和B.subtilis在不同環(huán)境下的生長。這些研究說明了功能基因組如何為B.subtilis的生理學(xué)提供充足的實驗證據(jù)。第48頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五B.subtilis中的熱休克B.subtilis遇到不同的限制其生長的環(huán)境壓力，如熱休克、滲透壓和機械壓力時，激活大量應(yīng)激調(diào)節(jié)子基因來反應(yīng)，這些調(diào)節(jié)子受一種轉(zhuǎn)錄因子σB調(diào)節(jié)，同時轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子HrcA或CtsR調(diào)控另外一些熱誘導(dǎo)基。第49頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五轉(zhuǎn)錄因子σB是革蘭氏陽性菌的總應(yīng)激σ因子。代謝、環(huán)境壓力或饑餓情況下σB因子的活化是應(yīng)激調(diào)節(jié)子誘導(dǎo)中重要的一步。許多總應(yīng)激基因的轉(zhuǎn)錄在植物依賴σA啟動子下發(fā)生，但是遇到壓力或饑餓依賴σB因子途徑就會急劇增強。發(fā)現(xiàn)新的受σB調(diào)節(jié)的基因并且確定其功能將有助于我們了解總抗逆調(diào)節(jié)子在B.subtilis抗逆適應(yīng)中起到的生理作用。第50頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五DNA微陣列包含了約4,100個已知的B.subtilis開放閱讀框中將近90％的PCR擴(kuò)增片斷，它用來檢測熱休克的整體轉(zhuǎn)錄水平。在這項研究中，培養(yǎng)的B.subtilis細(xì)胞從37℃（最佳生長溫度）轉(zhuǎn)到48℃（熱休克溫度）來引發(fā)熱休克反應(yīng)。從生長在兩個不同溫度的細(xì)胞中提取總RNA，用帶有兩種熒光的反轉(zhuǎn)錄酶標(biāo)記，然后在B.subtilis的微陣列中做差異顯示。第51頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五

在基因組水平分析，B.subtilis整個復(fù)雜的熱休克反應(yīng)在單個微陣列實驗中就可闡明：超過10％的基因表達(dá)在熱激下呈現(xiàn)明顯的上調(diào)，同時超過5％的轉(zhuǎn)錄水平激活的基因表達(dá)量上升至少3倍。微陣列實驗確定了70種已知或之前假定的依賴σB因子總抗逆調(diào)控元在轉(zhuǎn)錄水平上誘導(dǎo)，通過鑒定另外72種調(diào)控元包括24個編碼設(shè)想的保守蛋白或無已知同源蛋白的基因，更綜合地確定龐雜的σB調(diào)節(jié)系統(tǒng)。將這些功能未確定的基因劃分為σB調(diào)控元是因為它們的蛋白行使幫助細(xì)胞抵抗不利的環(huán)境或代謝壓力的功能。第52頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五

假定的依賴σB因子的啟動子中相同的序列與新鑒定的熱誘導(dǎo)基因相近，有力地支持了轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)譜的數(shù)據(jù)?；谖㈥嚵械霓D(zhuǎn)錄表達(dá)技術(shù)的局限性在于這種方法只說明了基因在某一特定的細(xì)胞途徑中存在，因此需要詳細(xì)的功能分析來確定這些蛋白在抗逆適應(yīng)性中的確切功能。B.subtilis陣列技術(shù)也用于研究對乙醇應(yīng)激的整體轉(zhuǎn)錄水平反應(yīng)，確定依賴σB因子的抗逆現(xiàn)象，最受關(guān)注的是胞質(zhì)外σW因子的誘導(dǎo)以及抗鹽反應(yīng)中的整個調(diào)控元。第53頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五雙組分調(diào)控系統(tǒng)

原核生物、低等真核生物和植物中的一類重要的適應(yīng)性反應(yīng)系統(tǒng)由兩類信號傳導(dǎo)蛋白組成：感受胞外刺激的傳感組氨酸激酶和在轉(zhuǎn)錄水平上介導(dǎo)適應(yīng)性反應(yīng)的同源反應(yīng)調(diào)節(jié)基因。雙組分調(diào)控系統(tǒng)作為基本的應(yīng)激相伴機制使得物種檢測到環(huán)境變化并對之作快速反應(yīng)。第54頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五

該調(diào)控系統(tǒng)通過控制蛋白質(zhì)磷酸化的變化來調(diào)節(jié)目的基因的表達(dá)。信號接受使膜結(jié)合的組氨酸激酶將ATP上的磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到高度保守的組氨酸殘基上的能力發(fā)生變化，該殘基一般在激酶的磷?；D(zhuǎn)移－二聚體結(jié)構(gòu)域。組氨酸上的磷酸基團(tuán)隨后轉(zhuǎn)移到同源反應(yīng)調(diào)節(jié)基因的天冬氨酸殘基上，使得后者與目標(biāo)啟動子的親和力增強。第55頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五B.subtilis的基因組測序已經(jīng)表明大量假定的雙組分調(diào)控系統(tǒng)的存在：37個傳感激酶和34個反應(yīng)調(diào)節(jié)基因已被確定，其中30個激酶－應(yīng)激調(diào)節(jié)基因組合在B.subtilis的染色體上相近排列。誘導(dǎo)這些雙組分調(diào)控系統(tǒng)的環(huán)境信號還未知，因此通過適當(dāng)?shù)卮碳ぜ?xì)胞來確定它們的目標(biāo)基因顯得很困難。第56頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五為解決這個問題，Ogura和他的伙伴（2001）在一個多拷貝質(zhì)粒（pDG148）中，將應(yīng)激調(diào)節(jié)基因置于受IPTG誘導(dǎo)的啟動子控制下，然后在B.subtilis突變株中過量表達(dá)，破壞它們的同源傳感激酶基因。應(yīng)激調(diào)節(jié)基因的過量表達(dá)預(yù)期的結(jié)果是看到缺乏特定環(huán)境信號和同源傳感激酶而無法磷酸化時目標(biāo)基因表達(dá)情況的改變。利用DNA微陣列分析確定了應(yīng)激調(diào)節(jié)基因的過量表達(dá)在基因組轉(zhuǎn)錄水平上的影響。第57頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五生長和成孢過程中B.subbtilis的全局性基因表達(dá)

厭氧呼吸

細(xì)菌經(jīng)常遇到外界含氧量水平的上下波動。與嚴(yán)格的需氧或者厭氧生物相比，兼性細(xì)菌在細(xì)胞代謝過程中如果遇到外界氧含量變化，它們就會通過感應(yīng)氧壓來進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)。細(xì)菌通過改變潛在基因的表達(dá)或者調(diào)節(jié)蛋白活性來適應(yīng)氧化還原環(huán)境的改變。第58頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五一直以來都認(rèn)為B.subtilis是嚴(yán)格需氧的生物，它以碳（以簡單碳水化合物或者有機酸的形式）作為能源來生長和生物合成細(xì)胞元件。然而，研究證明，B.subtilis能夠在缺氧條件下呼吸，它們以硝酸鹽或亞硝酸鹽為最終的電子受體，或者在缺少外界電子受體的情況下進(jìn)行發(fā)酵。第59頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五從硝酸鹽到氨的異化還原過程需要兩種酶，膜結(jié)合的硝酸鹽還原酶（由narGHJI操縱子編碼）和依賴于NADH的亞硝酸鹽還原酶（由nasDEF操縱子編碼）。延胡索酸鹽/硝酸鹽還原調(diào)節(jié)子（FNR）是無氧條件下誘導(dǎo)的能夠調(diào)節(jié)narGHJI操縱子表達(dá)的轉(zhuǎn)錄活化子。雙組分信號轉(zhuǎn)換系統(tǒng)，ResD/ResE，它能在氧受限的情況下通過激活fnr轉(zhuǎn)錄子，從而在調(diào)節(jié)控制無氧呼吸的途徑中起重要作用。第60頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五在沒有硝酸鹽和亞硝酸鹽存在時，在無氧條件下B.subtilis不能很好地利用葡萄糖生長，但在培養(yǎng)基中加入丙酮酸鹽后B.subtilis的生長得到很好地改善。目前尚不知道無氧條件下基因表達(dá)的整體變化情況。為了在基因水平上揭示無氧基因表達(dá)的代謝和遺傳控制機制，包含有4,020個開放閱讀框的B.subtilis全基因組微陣列被用于檢測在指數(shù)生長期有氧和無氧條件下基因表達(dá)不同的模式。第61頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五

從有氧到無氧的轉(zhuǎn)變，誘導(dǎo)或者抑制了幾百個不同細(xì)胞功能的基因，包括碳代謝、電子轉(zhuǎn)移、離子轉(zhuǎn)運、抗生素產(chǎn)生以及壓力適應(yīng)應(yīng)答。最突出的是包含了以下這些基因的表達(dá)：⑴ydjL，編碼了一個能夠產(chǎn)生2,3-丁二醇脫氫酶的基因。⑵ytkA，該基因在影響壓力應(yīng)答基因dps的上游；第62頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五⑶未知區(qū)域yolIJK，它編碼了一個能夠產(chǎn)生類似于aspartyl蛋白酶（YolJ）和二硫鍵氧化還原酶的基因。其他一些未知基因的mRNA的量在某些無氧條件下會優(yōu)先得到顯著提高。當(dāng)B.subtilis在硝酸鹽或亞硝酸鹽上生長時，YkzH和ykjA基因能夠得到高水平的轉(zhuǎn)錄。第63頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五然而，ywcJ和yumD基因的轉(zhuǎn)錄水平在沒有丙酮酸鹽存在的發(fā)酵條件下，能夠提高30－50倍。還有一些未知基因簇，yjlCD和yxxG-yxiM，能夠在硝酸鹽和亞硝酸鹽異化還原過程中和沒有丙酮酸鹽的發(fā)酵生長過程中被負(fù)調(diào)節(jié)。盡管微陣列表達(dá)譜分析用于探究基因功能只是探索性的，但報道的結(jié)果至少能對以前沒有注釋功能類別的基因建議一些可能的功能。第64頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五B．subbtilis中的硝酸鹽和亞硝酸鹽的信號基因表達(dá)譜是對narGHJI（硝酸鹽還原酶）、narK（硝酸鹽排出蛋白）、fnr（球狀厭氧呼吸調(diào)節(jié)子）和hmp（生理功能未知的被公認(rèn)的黃血色素），以及nasDEF（硝酸鹽還原酶）、cydABCD（細(xì)胞色素氧化酶和ABC膜轉(zhuǎn)運蛋白）、sbo-alb（一種未知蛋白subtilosin）、ywiD（生理功能未知）、ywiC（生理功能未知）的一種極好的誘導(dǎo)。第65頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五在葡萄糖培養(yǎng)基中低效率發(fā)酵生長的特點是pdhAB（丙酮酸脫氫酶）表達(dá)量的減少和lctPE(L-乳酸透性酶和L－乳酸脫氫酶)表達(dá)量的顯著增加。整體轉(zhuǎn)錄譜（globaltranscriptionalprofiling）顯示B.subtilis中控制厭氧呼吸的調(diào)控線路是動態(tài)的和復(fù)雜的，在這個調(diào)控線路中還包含了一些特定專門調(diào)節(jié)硝酸鹽厭氧呼吸的基因和另一些在發(fā)酵生長中發(fā)揮根本性影響的基因。第66頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五孢子形成歷史上，科學(xué)家們之所以對B.subtilis如此的感興趣以至于將它作為一種實驗?zāi)Ｊ缴?，很大程度上是因為這種細(xì)菌可以經(jīng)歷孢子形成的過程，而這種過程往往是對饑餓的高度特化的適應(yīng)性反映。在細(xì)菌中，孢子形成代表了一種相對簡單的實驗可追蹤的發(fā)育過程，它能導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變。第67頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五由于孢子形成是一個復(fù)雜的分化過程，所以它需要一個錯綜復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)去協(xié)調(diào)基因表達(dá)和復(fù)雜的形態(tài)變化。這一過程需要一系列受到多重調(diào)控的δ轉(zhuǎn)錄因子的活性。經(jīng)過許多實驗室的數(shù)十年的研究，和孢子形成有關(guān)的主要基因已經(jīng)被分離和鑒定，其中包括控制B.subtilis進(jìn)入孢子形成的轉(zhuǎn)錄活化蛋白和抑制蛋白Spo0A。第68頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五

圖：對微陣列得到的586個Bacillussubtilis基因的轉(zhuǎn)錄圖譜進(jìn)行分級分析，這些基因的表達(dá)水平依賴于Spo0A。具有相似表達(dá)圖譜的基因歸為一類。如圖所示，這些基因共分為三大類：（1）依賴于Spa0A但是不依賴于σF表達(dá)的基因；（2）表達(dá)受到Spo0A阻遏的基因（3）受σF控制或者一些能夠形成孢子的下游轉(zhuǎn)錄因子控制的基因。每一大類的代表基因均在圖右側(cè)表明。紅色和綠色分別代表高低不同的mRNA表達(dá)水平。第69頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五3.3B.subtilis蛋白組學(xué)一些研究小組通過建立二維的蛋白圖譜精確定位物理位置，已經(jīng)得到了B.subtilis

基因表達(dá)的特殊模式。下面著眼于產(chǎn)孢B.subtilis細(xì)胞胞外蛋白和在外力誘導(dǎo)蛋白的分析，并介紹蛋白質(zhì)組是如何提高我們對整體細(xì)胞的認(rèn)識。第70頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五胞外蛋白組像土壤微生物那樣，B.subtilis及其相關(guān)的種分泌大量的蛋白，主要是降解酶，它們保證細(xì)菌可以從廣泛的底物中吸取營養(yǎng)物質(zhì)從而可以在復(fù)雜的連續(xù)變化的環(huán)境中生存。另外，真細(xì)菌的分泌蛋白還有其他重要的機能，比如，細(xì)胞之間的互相交流，解除環(huán)境毒素，或者降低競爭者的數(shù)量。第71頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五B.subtilis胞質(zhì)蛋白的二維圖譜顯示在對數(shù)生長期大多數(shù)的蛋白是由那些在糖酵解，三羧酸循環(huán)，氨基酸的生物合成，翻譯和蛋白量的控制中保守的持家基因所分泌的。第72頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五整體的數(shù)據(jù)顯示，B.subtilis的胞外蛋白質(zhì)組包括糖類代謝有關(guān)的酶、蛋白酶或肽酶、氨基酸代謝中有關(guān)的酶、核酸降解有關(guān)的酶、脂酶、堿性磷酸酶、磷酸二脂酶、細(xì)胞壁生物合成中的蛋白、脂蛋白（包括不同轉(zhuǎn)運系統(tǒng)中的底物結(jié)合元件）、解毒蛋白、鞭毛蛋白、推測中的轉(zhuǎn)錄因子、蛋白合成和折疊有關(guān)的蛋白（包括GroEL伴侶）、原噬菌體有關(guān)的蛋白、產(chǎn)孢特異性蛋白和13個未知功能的蛋白。第73頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五4酵母(Saccharomycescerevisiae)：高等真核生物的模型

電鏡圖片第74頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）是一種簡單的單細(xì)胞真核生物，可以作為高等真核生物的模型生物。對這個物種的研究可以使我們了解細(xì)胞生命最基本的機制，尤其是人類遺傳病的分子基礎(chǔ)。與人類相比，S.cerevisiae的基因在實驗中更容易操作，可以比較容易的刪除、突變、然后重新轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞內(nèi)、過表達(dá)、標(biāo)記并全面地對基因進(jìn)行研究。第75頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五46%的已被識別的人類蛋白在酵母的蛋白質(zhì)組中都找得到結(jié)構(gòu)同源蛋白。這些人類和酵母共有的同源蛋白都參與細(xì)胞生命中很基礎(chǔ)的活動，如DNA復(fù)制、重組和修復(fù)，RNA轉(zhuǎn)錄、翻譯，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)運和基本代謝。第76頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五比較有醫(yī)學(xué)意義的是，酵母的基因與30-40%的人類疾病相關(guān)基因有很高的序列相似性。雖然很難評估酵母和人共有的的結(jié)構(gòu)同源基因在功能上是否保守，S.cerevisiae代表了一個很寶貴的實驗系統(tǒng)，可以使我們探索還沒有被了解的人類疾病的相關(guān)基因。第77頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五酵母作為復(fù)雜真核生物實驗?zāi)Ｐ偷囊粋€潛在價值是，與人類腎性腦白質(zhì)營養(yǎng)不良（adrenoleukodystrophy）相關(guān)的ALD基因，腎性腦白質(zhì)營養(yǎng)不良是一種神經(jīng)退化性疾病，這種病人的過氧化物酶體中飽和長鏈脂肪酸的β-氧化是有缺陷的（過氧化物酶體是微體的主要類型，或者是真核細(xì)胞質(zhì)中的由膜包裹的，含有特別酶類的細(xì)胞器）。第78頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五人類ALD基因部分編碼一個ABC轉(zhuǎn)運蛋白，這種蛋白位于過氧化物酶體的膜上，與酵母細(xì)胞的兩個ORFs，Pal1p和Ykl188c，有結(jié)構(gòu)同源性。但是，因為基因序列和基因功能不是總能在不同的物種之間保持保守，所以在用模式生物，比如酵母的同源基因解釋人類疾病時仍需要謹(jǐn)慎。第79頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五4.1酵母基因組出芽酵母S.cerevisiae的全基因組序列1996年已經(jīng)測定，這項工作由來自比利時、英國、加拿大、美國、法國、德國、日本和瑞士的科學(xué)家通過國際合作完成。它的全基因組序列在1996年公布，這標(biāo)志著第一個真核生物的基因組被人類闡明。通過對16個獨立的染色體中1200萬對堿基的序列分析，人們推測約有6，247個可能的開放閱讀框負(fù)責(zé)編碼酵母細(xì)胞中的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。第80頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五S.cerevisiae基因組序列測定完成后的幾年中，根據(jù)序列和遺傳信息，幾乎所有的酵母基因都被注解。在線的酵母基因組數(shù)據(jù)庫（MYGD），可通過慕尼黑蛋白序列信息中心（MIPS）被訪問，此數(shù)據(jù)庫提供了文獻(xiàn)中記錄的已被注解的功能特征、同源性，ORF、RNA基因和其他遺傳元件的結(jié)構(gòu)、以及經(jīng)典遺傳學(xué)、生物化學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)知識。第81頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五另一個可被訪問的在線數(shù)據(jù)庫是酵母蛋白組學(xué)數(shù)據(jù)庫（YPDTM），它可作為一個關(guān)于S.cerevisiae蛋白組織信息的綜合數(shù)據(jù)資源。YPD包含了來自許多詳盡的、深入的科學(xué)文獻(xiàn)的蛋白信息。雖然關(guān)于酵母的系統(tǒng)的研究有悠久的歷史，但截止到基因組序列完成，仍有32%的由基因組序列推測得到的蛋白質(zhì)的功能還未被確定。第82頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五全基因組序列測定已被用于識別可能的新基因，這些基因在經(jīng)典的遺傳學(xué)研究中被遺漏；同時還可提供酵母16條染色體的高級組織信息，以及不同染色體上基因和其他序列元件（如，轉(zhuǎn)座子、重復(fù)區(qū)域motif）的分布特點。測序工作揭示了可觀的遺傳冗余，特別在酵母染色體的末端。如染色體Ⅲ的兩個末端區(qū)域domain的核酸序列具有較高的同源性，同時也與染色體Ⅴ和Ⅺ的末端domain同源。第83頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五通過基因組的序列可以推導(dǎo)出理論上的酵母蛋白質(zhì)組，以標(biāo)準(zhǔn)同源性為準(zhǔn)則，用信息學(xué)的方法對其蛋白質(zhì)組進(jìn)行分析后，把50%的酵母蛋白進(jìn)行了功能分類。自從酵母基因組序列的公布和功能基因組學(xué)技術(shù)的出現(xiàn)，人們在根據(jù)經(jīng)驗確定編碼新蛋白基因的功能方面取得了巨大的進(jìn)步。運用計算機手段得到的信息為實驗的進(jìn)行提供了有價值的指導(dǎo)，但我們?nèi)孕枰狣NA芯片、基因刪除和生化分析等功能研究方法，來驗證蛋白的功能。第84頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五保守的信息學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，酵母11%的蛋白質(zhì)組參與了代謝（包括發(fā)酵和氧化代謝），7%參與轉(zhuǎn)錄，6%參與翻譯，3%參與能量的產(chǎn)生和儲存，3%用于DNA復(fù)制，修復(fù)和重組?；蚪M測序也揭示了一些基因產(chǎn)物的存在，而以前人們對這些物質(zhì)是否存在并不確定。第85頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五先前對酵母染色體的研究一直認(rèn)為S.cerevisiae沒有組蛋白H1。但基因組序列的研究表明，S.cerevisiae具有全部的組蛋白，包括H1，其編碼基因位于染色體XVI。另一個例子就是基因組測序發(fā)現(xiàn)并將γ微管蛋白基因定位在染色體XII上，而在此之前，雖然酵母遺傳學(xué)家們付出了許多努力，但仍沒有找到這個基因。第86頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五4.2酵母的轉(zhuǎn)錄自從1996年公布了酵母的全基因組序列，人們對S.cerevisiae基因功能的描述有了相當(dāng)?shù)倪M(jìn)展，需要確定約1，900個ORFs的功能。許多研究都應(yīng)用高通量的基因芯片來分析酵母細(xì)胞在特定的刺激、環(huán)境變化和遺傳改變的影響下的基因組表達(dá)情況。第87頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五

在闡明基因功能的研究中，對不同的生理和發(fā)育狀態(tài)下特定基因mRNA的表達(dá)水平的分析確實是非常有力的方法。cDNA和寡聚核苷酸陣列技術(shù)不僅揭示了關(guān)于染色體復(fù)制，染色質(zhì)重組，減數(shù)分裂，孢子形成，和細(xì)胞周期調(diào)控等基本細(xì)胞活動的新的細(xì)節(jié)，還顯示了無規(guī)律的外界干擾對酵母轉(zhuǎn)錄組動態(tài)組成的影響。第88頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五金屬動態(tài)平衡的遺傳基礎(chǔ)所有的生物需要金屬離子，如鐵，銅和鋅，來進(jìn)行各種各樣的生化活動。鐵和銅在電子傳遞和許多氧化還原金屬酶中是重要的輔助因子，鋅是很多酶的催化成分，在鋅指結(jié)構(gòu)等結(jié)構(gòu)中起關(guān)鍵作用。但這些金屬離子在體內(nèi)的過量積累對細(xì)胞是有毒害作用的。為了控制細(xì)胞內(nèi)的金屬離子含量，生物如S.cerevisiae進(jìn)化出一些動態(tài)平衡調(diào)節(jié)系統(tǒng)來控制金屬離子的吸收、分布、儲存和解毒。第89頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五為了更好的理解S.cerevisiae金屬代謝的調(diào)控，Lyons和同事運用DNA微陣列和啟動子結(jié)構(gòu)的計算機分析，研究了受到轉(zhuǎn)錄因子Zap1p調(diào)控的酵母基因。轉(zhuǎn)錄因子Zap1p感應(yīng)到細(xì)胞中鋅的含量并在鋅匱乏時刺激其靶基因的表達(dá)。第90頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五

這個研究強烈暗示了46個基因是Zap1p依賴性調(diào)節(jié)方式的可能靶基因，其中含有18個編碼功能未知的蛋白。并且，MEME分析說明ZRE保守序列最可能的模塊是5’-ACCTTNAAGGT-3’。這個研究的結(jié)論拓展了某一個特定的真核轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)子的定義，提高了我們在分子水平上對鋅代謝的理解。酵母通過精確的動態(tài)平衡調(diào)節(jié)系統(tǒng)嚴(yán)格的調(diào)節(jié)鐵和銅的吸收和利用。運用DNA陣列技術(shù)的研究已經(jīng)鑒別出酵母轉(zhuǎn)錄因子Aft1p和Mac1p構(gòu)成的調(diào)節(jié)子的新的可能的靶基因。第91頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五代謝重調(diào)的功能基因組學(xué)S.cerevisiae作為模式真核細(xì)胞的重要性源于這種實驗生物本身的一些優(yōu)點。與許多具有復(fù)雜的形態(tài)和基因組的真核細(xì)胞不同，酵母可以在由實驗者控制的化學(xué)物理環(huán)境下，在特定的培養(yǎng)基上被培養(yǎng)。它的生活史和高度有效的同源重組也使S.cerevisiae很適合經(jīng)典的遺傳分析，包括基因缺失和替代。第92頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五利用酵母的基因組序列信息，S.cerevisiae基因組的2062個ORFs（多于1/3的ORFs）的精確缺失已經(jīng)成功。運用PCR擴(kuò)增的辦法，目的基因的同源部分被連接到一個經(jīng)過挑選的標(biāo)志基因（一個抗生素抗性盒）的兩端。當(dāng)這個連接體進(jìn)入酵母細(xì)胞里時，高效率的同源重組使目的基因被標(biāo)志基因替代。第93頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五對基因缺失的酵母菌株的表型研究表明，17%的缺失的ORFs對在豐富培養(yǎng)基上生長的酵母是必需的，基因缺失的菌株中40%在豐富或基本培養(yǎng)基上表現(xiàn)出可被測定的生長缺陷。在豐富培養(yǎng)基上生長不良的突變株一般在基本培養(yǎng)基上生長得也不好，很少有例外。第94頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五在另一個研究中，研究者分析了在好氧和厭氧條件下恒化培養(yǎng)的S.cerevisiae的基因組范圍的轉(zhuǎn)錄圖譜。觀察到在好氧和厭氧條件下大多數(shù)酵母基因的表達(dá)圖譜是相似的。為適應(yīng)好氧條件，只有219個基因的轉(zhuǎn)錄加強了3倍以上；而為了適應(yīng)厭氧條件，140個基因在轉(zhuǎn)錄水平上增強了3倍以上。第95頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五許多好氧和厭氧誘導(dǎo)基因的生理作用還不是很清楚，需要進(jìn)一步的研究來確定功能。比較基于微陣列的野生型的S.cerevisiae在不同生長條件下的轉(zhuǎn)錄圖譜，人們?nèi)詻]有精確描述指示代謝重規(guī)劃的轉(zhuǎn)錄調(diào)控的分子機制。需要運用影響關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子活動的遺傳突變，連同其他功能基因組的工具，來解析控制細(xì)胞生長的調(diào)控途徑和網(wǎng)絡(luò)。第96頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五基因調(diào)控中的核小體重組復(fù)合體基因表達(dá)的調(diào)控對生物系統(tǒng)的功能是基礎(chǔ)的，細(xì)胞的很多調(diào)控活動發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平。越來越明顯的是，緊縮的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的修飾是真核生物重要的調(diào)控機制，包括酵母。染色質(zhì)中重復(fù)的結(jié)構(gòu)單位是核小體，特征是200bp的DNA負(fù)超螺旋鏈纏繞到組蛋白核心上（正電荷的，富含精氨酸，組氨酸的小蛋白復(fù)合體）。第97頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五在這部分鏈上的基因被有效的包在核小體上。體內(nèi)和體外的研究已經(jīng)說明核小體抑制轉(zhuǎn)錄起始是通過防止真核RNA聚合酶Ⅱ核心酶與轉(zhuǎn)錄因子與DNA的接觸。越來越多的證據(jù)表明一些類型的多聚蛋白復(fù)合體，如保守的Swi/Snf和RSC復(fù)合體，通過以一種ATP依賴性的方式改變?nèi)旧|(zhì)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，來消除核小體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制。第98頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五染色質(zhì)結(jié)構(gòu)因子改變核小體的行為是通過改變核小體結(jié)構(gòu)，從而使轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合在它們特異識別的DNA序列上，幫助起始轉(zhuǎn)錄。關(guān)于改變?nèi)旧w結(jié)構(gòu)的復(fù)合體Swi/Snf的功能的一些基本方面還未解決，但可以平行測量整個基因組在mRNA水平上表達(dá)的高密度方法技術(shù)的發(fā)展，并為我們提供了闡明Swi/Snf功能的機會。第99頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五4.3酵母蛋白質(zhì)組學(xué)基因組測序發(fā)現(xiàn)的還未確定特征的基因可以通過評估生化活性、蛋白-蛋白相互作用和基因表達(dá)產(chǎn)物的亞細(xì)胞定位分析進(jìn)行研究。系統(tǒng)的蛋白質(zhì)組學(xué)對于闡明決定細(xì)胞功能的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)及其相互作用是必需的，在一定意義上，使基因組信息轉(zhuǎn)化為生命。第100頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五酵母蛋白的亞細(xì)胞定位雙向凝膠電泳和MS等技術(shù)已經(jīng)被應(yīng)用于確定S.cerevisiae蛋白質(zhì)組中蛋白的亞細(xì)胞分布。一個蛋白的亞細(xì)胞定位被認(rèn)為可以暗示它在細(xì)胞中的基本的分子功能，提示它的功能機制。但是，酵母中蛋白的亞細(xì)胞分布是很基礎(chǔ)的數(shù)據(jù)，直到現(xiàn)在實際上還仍未解決。第101頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五2002年，MichealSnyder和合作者第一次在蛋白質(zhì)水平上分析了一種真核生物的蛋白定位。通過高通量的對抗原決定簇所標(biāo)記的基因產(chǎn)物來進(jìn)行免疫定位后，2744個酵母蛋白（S.cerevisiae理論上的蛋白質(zhì)組的60%）的亞細(xì)胞定位已被確定。標(biāo)記酵母蛋白有兩種方法：或者將PCR擴(kuò)增的酵母ORFs定向克隆到酵母V5抗原決定簇/表達(dá)載體，或者由轉(zhuǎn)座子導(dǎo)致突變產(chǎn)生的隨機標(biāo)記。第102頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五蛋白質(zhì)組微陣列蛋白質(zhì)微陣列的設(shè)計為，將可更換的硅樹脂人造橡膠多聚物或者PDMS，其上有陣列式的微孔（直徑1.4mm，深度300μm）,放在一個標(biāo)準(zhǔn)顯微鏡載玻片上面。這種微陣列覆蓋了約1/3的載玻片的面積，一張載玻片上基本可以容納兩個微陣列。第103頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五蛋白質(zhì)通過3-glycidoxypropyltrimethoxysilane（GPTS，縮水甘油醚基丙基三甲氧基硅）交聯(lián)分子被共價連接到微孔上，然后用放射標(biāo)記的ATP（γ-33P-ATP）和17種底物[如，牛組蛋白H1、牛酪蛋白、髓磷脂堿性蛋白和酪氨酸基質(zhì)多聚體（Tyr-Glu）]在17種不同的陣列上測試體外的激酶活性。第104頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五圖酵母蛋白激酶蛋白質(zhì)芯片的制作和分析(a)蛋白質(zhì)芯片的制作：將PDMS傾倒在丙烯酸模具上，待凝固后將形成的小孔板放在載玻片上。小孔的表面被修飾，然后與蛋白質(zhì)結(jié)合。（b）使用蛋白質(zhì)芯片檢測激酶活性。圖中顯示了12中底物的磷酸化信號的圖像。第105頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五4.4酵母蛋白質(zhì)相互作用組：蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖譜

為了全面的了解在分子水平上的細(xì)胞活動，蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的研究是必不可少的。為了確定基因組測序發(fā)現(xiàn)的新蛋白的功能，一個重要的功能基因組學(xué)策略是，通過與功能已知的蛋白的相互作用來區(qū)分新蛋白。第106頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五

蛋白質(zhì)與其他生物分子的相互作用也可以提供關(guān)于其功能的一些假說和啟示。這是很重要的，因為如果大約40%的S.cerevisiae蛋白在真核細(xì)胞的進(jìn)化中是保守的闡明酵母的蛋白質(zhì)相互作用組（所有蛋白質(zhì)相互作用圖譜）可以為更復(fù)雜的真核生物的蛋白質(zhì)組提供部分的框架。傳統(tǒng)的研究大規(guī)模的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用圖譜的方法是酵母雙雜交系統(tǒng)?，F(xiàn)在高通量和超靈敏的質(zhì)譜方法開始用來識別酵母中的多蛋白復(fù)合物第107頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五計算機顯示蛋白-蛋白的相互作用網(wǎng)絡(luò)利用計算機圖像手段顯示蛋白質(zhì)相互聯(lián)系的研究，強調(diào)了酵母中蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性和聯(lián)系性。酵母的綜合作用圖譜是根據(jù)數(shù)據(jù)庫的信息繪制的，可以幫助我們了解已知和未知的蛋白的功能關(guān)系。第108頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五人們意外的發(fā)現(xiàn)一個龐大的酵母蛋白相互作用的網(wǎng)絡(luò)包括了由2358個蛋白質(zhì)相互作用聯(lián)系起來的1548個蛋白。第二大的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)只有19個蛋白。大的作用圖譜中的蛋白（1548個）在膜融合、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、細(xì)胞結(jié)構(gòu)、脂類代謝和細(xì)胞應(yīng)激性中都發(fā)揮功能。第109頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五不同的功能團(tuán)體和亞細(xì)胞空間之間有許多交叉聯(lián)系和相互作用。在巨大的網(wǎng)絡(luò)中，功能和細(xì)胞定位已知的蛋白多通過蛋白之間的相互作用聯(lián)系起來，這種聯(lián)系的63%發(fā)生在行使普通功能的蛋白之間，76%發(fā)生在位于同一個亞細(xì)胞空間的蛋白之間。第110頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五一般亞細(xì)胞空間之間的相互作用發(fā)生在核與細(xì)胞質(zhì)蛋白之間，但在蛋白質(zhì)相互作用圖譜中也能顯示出核與線粒體之間的潛在的相互關(guān)系。之蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的模型化和可視化是用來預(yù)測我們還不了解的蛋白質(zhì)的功能的非常有用的工具。第111頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五用質(zhì)譜分析酵母的多蛋白復(fù)合體

蛋白質(zhì)陣列，對蛋白質(zhì)復(fù)合體的超敏感、高通量的質(zhì)譜分析技術(shù)的出現(xiàn)極大的拓展了我們對酵母蛋白質(zhì)相互作用組的認(rèn)識。酵母雙雜交方法的局限性在于它探測到兩個蛋白的相互作用，卻不能研究更高水平上整個功能組織。真核生物的蛋白質(zhì)組可以看作是許多蛋白多聚復(fù)合物的網(wǎng)絡(luò)，這些復(fù)合物在組織的水平上行使功能，超越了兩兩之間的相互作用。目前質(zhì)譜被應(yīng)用于蛋白質(zhì)組水平上蛋白復(fù)合體的直接識別上。第112頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五利用Flag表面抗原標(biāo)記的免疫親和單步驟純化方法可以用來獲得一組酵母的“獵物”蛋白，包括100個蛋白激酶、36個磷酸酶和調(diào)節(jié)亞單位，以及86個細(xì)胞對DNA損傷反應(yīng)中起作用的蛋白。第113頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五多蛋白復(fù)合體可以被免疫沉淀，每個蛋白成分可以用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，用染色方法顯示出來并可以通過割膠回收得到。割膠得到的蛋白的酪蛋白酶消化產(chǎn)物首先用MS進(jìn)行分析，然后通過數(shù)據(jù)庫搜索算法對蛋白進(jìn)行識別。第114頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五許多亞細(xì)胞空間（如，細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞骨架、核、核仁、細(xì)胞膜、線粒體和液泡）的蛋白復(fù)合物都是利用HMS-PCI識別。除此之外，通過對酵母基因組序列的信息學(xué)分析，人們預(yù)測了一些功能還未確定的蛋白的存在，而運用HMS-PCI，許多蛋白（531個）均被識別為這些蛋白的組成成分。第115頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五酵母蛋白質(zhì)組在較高水平上的組織圖譜有兩個主要的主題：（1）復(fù)合物的成分可以處于動態(tài)變化中，（2）大多復(fù)合物不僅僅通過物理上的相互作用聯(lián)系在一起，還具有共同的調(diào)節(jié)方式，分布特點，更新或結(jié)構(gòu)。第116頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五

總之，質(zhì)譜技術(shù)可能特別適用于多蛋白復(fù)合體的解析，而綜合的雙雜交方法則不適合。比較不同的數(shù)據(jù)，說明與大規(guī)模的雙雜交研究相比，HMS-PCI方法在探測已知的多蛋白復(fù)合體時成功率平均要高3倍。MS的另一個優(yōu)點是可以檢測到含量低的蛋白，這些蛋白通常只能用表達(dá)蛋白質(zhì)組學(xué)的方法被識別?？傊?，利用MS得到的相互作用高水平的圖譜可能更好地反映酵母相互作用組的復(fù)雜性。

第117頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五5模式真核生物的比較基因組學(xué)自由生活的線蟲Caenorhabditiselegans的全基因組序列的確定是第一個真核多細(xì)胞生物的基因組。Caenorhabditiselegans的九千七百萬個堿基的基因組序列中含有19717個預(yù)測的編碼蛋白質(zhì)的基因，其中只有1877個基因已經(jīng)進(jìn)行了經(jīng)典的遺傳學(xué)和生化研究。第118頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五雖然線蟲基因組比人類基因組（3000Mb和31000個預(yù)測基因）小30倍，但Caenorhabditiselegans基因的數(shù)量只比人類的少1.6倍。通過大量的關(guān)于Caenorhabditiselegans的研究，發(fā)現(xiàn)其生命活動的許多方面在非脊椎動物和脊椎動物中是保守的。第119頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五鑒于C.elegans的進(jìn)化保守性和實驗的易處理性，它已成為理想的研究功能基因組學(xué)的模式生物。大約40%的C.elegans基因與其他生物的基因具有DNA序列同源性，所以關(guān)于它的研究對我們了解其他后生動物（多細(xì)胞動物）的生命活動具有潛在的意義。第120頁，共135頁，2023年，2月20日，星期五C.elegans和