蛋白質(zhì)組學(xué)優(yōu)秀公開課

蛋白質(zhì)組學(xué)

Proteomics

參考書目蛋白質(zhì)組學(xué)：理論與方法，錢小紅、賀福初主編，科學(xué)出版社蛋白質(zhì)組學(xué)：從序列到功能，錢小紅主編，科學(xué)出版社蛋白質(zhì)化學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué)，夏其昌等主編，科學(xué)出版社蛋白質(zhì)芯片，MarkSchena著，科學(xué)出版社教學(xué)內(nèi)容第一章序論第二章蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)和功能第三章蛋白質(zhì)組研究方法第四章蛋白質(zhì)組學(xué)研究工具—一維和二維電泳第五章蛋白質(zhì)組學(xué)研究工具—生物質(zhì)譜技術(shù)第一章序論CHAPTER1Introduction功能基因組與蛋白質(zhì)組基因研究是20世紀(jì)生命科學(xué)的主線20世紀(jì)上半葉，DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的提出；20世紀(jì)下半葉，“中心法則”的問世；20世紀(jì)90年代，全球性基因組計(jì)劃尤其是人類基因組計(jì)劃（HGP）的推進(jìn)。“后基因組時(shí)代”（postgenomeera）功能基因組學(xué)（functionalgenomics)成為研究的重心，蛋白質(zhì)組學(xué)（proteomics）則是其“中流砥柱”Andnowfor

theproteome(Nature409:747,2001)

Proteomicsingenomeland(Science291:1221,2001)一、基因組計(jì)劃的成就人類基因組計(jì)劃（HGP）：“生命登月計(jì)劃”2001.2.15、16日，國(guó)際人類基因組計(jì)劃與美國(guó)Celera公司分別在Nature、Science上公布人類基因組草圖截至2002年初，已有至少75種生物的基因組全序列測(cè)定完成基因序列數(shù)據(jù)為生命科學(xué)多層次、多分支的研究提供了豐富的寶藏二、基因組計(jì)劃的局限基因組計(jì)劃：遺傳圖、物理圖、全序列圖真核生物：基因結(jié)構(gòu)復(fù)雜；現(xiàn)有基因識(shí)別理論與技術(shù)發(fā)展的嚴(yán)重不足（ORF的確定等）基因調(diào)控：時(shí)空特異性基因與其編碼的蛋白的線性對(duì)應(yīng)關(guān)系只存在于新生肽鏈而不是最終的功能蛋白中基因是遺傳信息的源頭，但功能性蛋白才是基因功能的執(zhí)行體三、蛋白質(zhì)研究技術(shù)方法的突破二維電泳（2-DE）：大規(guī)模蛋白質(zhì)的分離大型圖像分析系統(tǒng)與軟件的發(fā)展大規(guī)模樣品處理系統(tǒng)高壓液相色譜分析（HPLC）激光解吸質(zhì)譜（LID-MS)電噴霧質(zhì)譜（ESI-MS）肽質(zhì)量指紋圖譜(PMF)與肽序列標(biāo)簽技術(shù)(PST)：準(zhǔn)確、快速、自動(dòng)化、大規(guī)模一、蛋白質(zhì)組研究的開端三、蛋白質(zhì)研究技術(shù)與基本路線蛋白質(zhì)組研究的宗旨－－將組織或細(xì)胞所有蛋白質(zhì)（至少是大部分）分離與鑒定雙向電泳（2－DE）：IPG-DALT等圖像分析系統(tǒng)：ELSIE4&8、gellabI&II等蛋白質(zhì)鑒定方法：氨基酸組成分析、序列測(cè)定、肽質(zhì)量指紋圖（peptidemassfingerprinting，PMF）、相對(duì)分子質(zhì)量精確測(cè)定、高通量分析系統(tǒng)（highthroughputsystem，HTS）與大規(guī)模樣品處理機(jī)器人、新型質(zhì)譜（massspectrometry，MS）如MALDI-TOF-MS和ESI-MS-MS等數(shù)據(jù)庫設(shè)置與檢索系統(tǒng)基本路線：樣品制備、圖像分析、蛋白質(zhì)成分的分析與鑒定蛋白質(zhì)成分的分析鑒定：氨基酸分析、肽質(zhì)量指紋圖譜、氨基酸分析與PMF聯(lián)合、序列標(biāo)簽途徑、N端Edman降解蛋白與微量測(cè)序、MS微量測(cè)序等四、蛋白質(zhì)組研究的國(guó)內(nèi)外現(xiàn)狀1.發(fā)展速度與規(guī)模研究論文數(shù)量上從1995年的1篇，到2001年的859篇參與的國(guó)家從1995年的澳大利亞，到97年的美國(guó)、丹麥、瑞士等10個(gè)國(guó)家3.研究范圍－－生命科學(xué)中一系列熱點(diǎn)領(lǐng)域蛋白質(zhì)：蛋白質(zhì)組作圖、蛋白質(zhì)組成分鑒定、蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫構(gòu)建、新型蛋白質(zhì)發(fā)掘、蛋白質(zhì)差異顯示、同工體比較基因：功能基因組計(jì)劃、基因產(chǎn)物識(shí)別、基因功能鑒定、基因調(diào)控機(jī)制分析重要生命活動(dòng)的分子機(jī)制：細(xì)胞周期、細(xì)胞分化與發(fā)育、腫瘤發(fā)生與發(fā)展、環(huán)境反應(yīng)與調(diào)節(jié)、物種進(jìn)化等醫(yī)藥靶分子尋找與分析：新型藥物靶分子、腫瘤惡性標(biāo)志、人體病理介導(dǎo)分子、病原菌毒性成分蛋白質(zhì)組作圖－早期研究的主要領(lǐng)域：超過11種；第一個(gè)完整的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫（YPD）完成，含6021種蛋白蛋白差異顯示：用于環(huán)境應(yīng)激、基因突變、病理進(jìn)程等研究蛋白連鎖圖：改進(jìn)雙雜交系統(tǒng)，用于蛋白質(zhì)組相互作用網(wǎng)絡(luò)的分析4.國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀國(guó)外研究現(xiàn)狀（1）蛋白質(zhì)組學(xué)將成為世紀(jì)最大戰(zhàn)略資源－人類基因爭(zhēng)奪戰(zhàn)的重要“戰(zhàn)場(chǎng)”。蛋白質(zhì)組學(xué)已經(jīng)成為新世紀(jì)生命科學(xué)研究的前沿（3）存在的問題方法學(xué)上：2-DE-MS的通量、靈敏度和規(guī)?；瘑栴}；酵母雙雜交技術(shù)無法快速、高效的獲取復(fù)雜蛋白質(zhì)相互作用的多維信息；蛋白質(zhì)組的生物信息學(xué)研究范圍與準(zhǔn)確率仍需提高學(xué)術(shù)上：人類組織或細(xì)胞的蛋白質(zhì)組全譜研究則基本未涉及；具體針對(duì)任一生物體或組織/細(xì)胞開展全方位的蛋白質(zhì)組相互作用網(wǎng)絡(luò)的分析鮮有報(bào)道人類蛋白質(zhì)組正式啟動(dòng)2001年成立國(guó)際人類蛋白質(zhì)組組織（HUPO），2003.12.15啟動(dòng)兩個(gè)首批行動(dòng)計(jì)劃人類肝臟蛋白質(zhì)組計(jì)劃（HLPP）由中國(guó)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院副院長(zhǎng)賀福初院士領(lǐng)導(dǎo)，16國(guó)80多個(gè)實(shí)驗(yàn)室參加。中國(guó)第一次領(lǐng)導(dǎo)重大國(guó)際協(xié)作計(jì)劃。人類血漿蛋白質(zhì)組計(jì)劃（HPPP）由美國(guó)科學(xué)家牽頭，13國(guó)47個(gè)實(shí)驗(yàn)室參加。第三屆國(guó)際人類蛋白質(zhì)組大會(huì)04.10在北京舉行。主題：蛋白質(zhì)組生命真諦的詮釋。五、蛋白質(zhì)組研究的發(fā)展趨勢(shì)及我國(guó)的應(yīng)對(duì)策略1.重大生命活動(dòng)中蛋白質(zhì)組的比較研究

選取1～2類重大生命活動(dòng)（如重大疾病）中幾個(gè)相繼的重要階段，分別進(jìn)行蛋白質(zhì)組作圖，進(jìn)行系統(tǒng)的定性、定量比較，進(jìn)而對(duì)差別蛋白進(jìn)行鑒定，然后從核酸、蛋白兩層次對(duì)差別蛋白進(jìn)行性能分析，從而確定重大生命活動(dòng)的蛋白質(zhì)組基礎(chǔ)2.1-2種組織/細(xì)胞蛋白質(zhì)組的系統(tǒng)研究

選取1～2種具有重要生物學(xué)意義或性狀、且我國(guó)已完成cDNA大規(guī)模測(cè)序的組織或細(xì)胞，制備其高分辨率蛋白質(zhì)組圖并建立其蛋白質(zhì)組圖數(shù)據(jù)庫，進(jìn)而聯(lián)合應(yīng)用其cDNA大規(guī)模測(cè)序的數(shù)據(jù)，規(guī)?；芯科涞鞍踪|(zhì)組成3.蛋白質(zhì)組的生物信息學(xué)研究

蛋白質(zhì)組成員的序列、結(jié)構(gòu)、功能及定位分類；基于生化途徑、遺傳網(wǎng)絡(luò)等，構(gòu)建蛋白質(zhì)組功能系統(tǒng)即蛋白連鎖圖；建立人或其他哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫；高等生物基因組中蛋白質(zhì)編碼基因的識(shí)別及算法研究；基因翻譯產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)、功能預(yù)測(cè)；基于蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫與知識(shí)庫的知識(shí)與規(guī)律發(fā)現(xiàn)4.蛋白質(zhì)組分析的支撐技術(shù)研究

新型蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能預(yù)測(cè)方法及程序；大規(guī)模蛋白質(zhì)相互作用分析技術(shù)；蛋白質(zhì)分析鑒定中新型質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展及應(yīng)用；基于蛋白質(zhì)序列、結(jié)構(gòu)及蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫的知識(shí)與規(guī)律發(fā)現(xiàn)理論與方法；HIS系統(tǒng)及蛋白質(zhì)組分析自動(dòng)操作系統(tǒng)等

原核及簡(jiǎn)單真核生物的蛋白質(zhì)組研究流感嗜血桿菌的蛋白質(zhì)組研究大腸桿菌的蛋白質(zhì)組研究

致病微生物的蛋白質(zhì)組研究釀酒酵母的蛋白質(zhì)組研究

下一頁流感嗜血桿菌的蛋白質(zhì)組研究

流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenzae)是第一個(gè)獲得基因組全序列的生物。瑞士的一個(gè)小組通過2D研究了流感嗜血桿菌的蛋白質(zhì)組分，在pH3-10的范圍內(nèi)鑒定了約300個(gè)蛋白質(zhì)組分，然后用有兩個(gè)尿素濃度的麥黃酮膠分離了很難分離到的5-20kDa范圍內(nèi)的蛋白質(zhì)，還鑒定了其中的80種。另外用肝素親和層析將堿性蛋白質(zhì)富集后，在pH6-11的范圍內(nèi)又鑒定了102個(gè)蛋白質(zhì)，其中許多是核酸結(jié)合蛋白尤其是核糖體蛋白。

華盛頓大學(xué)的另一個(gè)小組將雙向電泳得到的流感嗜血桿菌303個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜分析，確定了263個(gè)蛋白質(zhì)，其中大部分是外膜蛋白，以及與能量代謝和大分子合成相關(guān)的蛋白質(zhì)。另外發(fā)現(xiàn)了幾種不能在基因組中找到對(duì)應(yīng)序列的蛋白質(zhì)。令人驚奇的是，大約22%的被鑒定了的蛋白質(zhì)表現(xiàn)出與預(yù)計(jì)不同的等電點(diǎn)與分子質(zhì)量，顯示它們可能經(jīng)過了翻譯后加工。返回

大腸桿菌的蛋白質(zhì)組研究

大腸桿菌全部4000多個(gè)基因的DNA序列已被測(cè)定，人們想到如果把雙向電泳得到的蛋白質(zhì)譜與基因組分析結(jié)果聯(lián)合起來，會(huì)得到更多有用的信息。基于此想法,建立蛋白質(zhì)基因聯(lián)合數(shù)據(jù)庫，希望籍此來回答以下幾方面的問題：A.所有基因編碼的產(chǎn)物在雙向圖譜上的位置；B.各種蛋白質(zhì)的豐度；C.不同條件下各種蛋白質(zhì)表達(dá)水平及合成速率的變化；D.各種蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的定位；E.某些蛋白質(zhì)翻譯后修飾的方式及水平。

目前，大腸桿菌的聯(lián)合數(shù)據(jù)庫已更新到第六版,大約包括1600個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的數(shù)據(jù)，其中大約400個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)已與大約350個(gè)基因相對(duì)應(yīng)(有些基因可能有多個(gè)蛋白質(zhì)產(chǎn)物)。對(duì)于這些蛋白質(zhì)，這個(gè)數(shù)據(jù)庫可以提供基因名稱、蛋白質(zhì)名稱、功能范疇、Swiss-prot數(shù)據(jù)庫編號(hào)、Ｇenbank序列號(hào)、基因圖譜的位置、染色體上的轉(zhuǎn)錄方向以及一些生理信息(如在不同生長(zhǎng)條件下該蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的豐度)。返回

致病微生物的蛋白質(zhì)組研究

蛋白質(zhì)組的一個(gè)重要應(yīng)用是在闡明新抗生素作用機(jī)理的研究上。當(dāng)今，細(xì)菌對(duì)大多數(shù)抗生素都有了抗性，尋找作用于細(xì)菌內(nèi)新的靶子的研究工作已經(jīng)展開，找到了許多有效的抗菌化合物。但目前遇到的困難在于難以揭示新的化合物的作用靶子及其作用機(jī)理。有時(shí)雖在體外發(fā)現(xiàn)新化合物能夠使某種蛋白質(zhì)失活，但在體內(nèi)是否有這種現(xiàn)象和這是否是抗菌的主要機(jī)制仍然未知。

雙向電泳分析提供了一個(gè)有效手段。

例如在研究抑制核糖體類抗生素對(duì)細(xì)菌的作用機(jī)制時(shí)，對(duì)12種作用于翻譯過程的不同階段和核糖體內(nèi)不同分子的抗生素加以考察，發(fā)現(xiàn)其中8種誘導(dǎo)冷休克反應(yīng)的一系列蛋白質(zhì)，另4種誘導(dǎo)一系列熱休克反應(yīng)的蛋白質(zhì)；因此預(yù)計(jì)新的作用于核糖體的化合物也是誘導(dǎo)這兩種反應(yīng)，并且籍此可以推測(cè)大腸桿菌對(duì)冷熱的反應(yīng)發(fā)生于核糖體水平上。

蛋白質(zhì)組研究的重要優(yōu)勢(shì)在于能夠從整體水平上分析不同條件下蛋白質(zhì)譜的變化。例如作為一種差異顯示技術(shù)，這一技術(shù)已被用于比較結(jié)核分枝桿菌與牛結(jié)核分枝桿菌蛋白的不同；結(jié)果發(fā)現(xiàn)一些在基因水平上很類似的蛋白在蛋白質(zhì)水平上有很大差別，這可能部分解釋近年來牛痘作為結(jié)核病疫苗會(huì)出現(xiàn)失敗的現(xiàn)象。返回

釀酒酵母的蛋白質(zhì)組研究

利用雙向電泳技術(shù)分析酵母蛋白譜的工作早于蛋白質(zhì)組概念的提出。釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)基因組的完成及其蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫在互聯(lián)網(wǎng)上的建立,大大加速了這一工作。最新版的數(shù)據(jù)庫包括6000多頁，每頁代表一個(gè)已知或推測(cè)的酵母蛋白。它包含以下幾方面的信息：

A.以序列為基礎(chǔ)的已知和推測(cè)的酵母蛋白的特征信息，如分子質(zhì)量、等電點(diǎn)、氨基酸組成、多肽片段大小等；B.一些研究得到的關(guān)于各種蛋白質(zhì)在翻譯后加工、亞細(xì)胞定位、功能分類方面的信息；C.從以往的超過5000篇關(guān)于酵母蛋白研究的文章中獲得的有關(guān)各種蛋白質(zhì)功能、相互作用、突變表型的信息。借助數(shù)據(jù)庫的有力推動(dòng)，在雙向電泳蛋白質(zhì)譜上最明顯的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的大部分得到鑒定。

正在丹麥進(jìn)行的一項(xiàng)研究計(jì)劃分別作出野生型和將基因系統(tǒng)缺失的缺陷型酵母的雙向蛋白質(zhì)圖譜。初步的研究表明，缺失單一基因?qū)?dǎo)致的結(jié)果并不只是缺乏此基因編碼的蛋白質(zhì)，而是能導(dǎo)致其他一系列蛋白質(zhì)量的改變。一些蛋白質(zhì)減少而另一些蛋白質(zhì)增多，當(dāng)然還有一些蛋白質(zhì)被加工修飾而導(dǎo)致性狀改變。

單一基因缺失的結(jié)果總是引起蛋白質(zhì)組全局性的變化。大約20%的酵母基因缺失是致死性的，另外80%則不然，這時(shí)機(jī)體能通過調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的表達(dá)來對(duì)抗這種內(nèi)源性的變化。這種基因缺失的研究可能會(huì)告訴我們一些關(guān)于細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)分子間相互“對(duì)話”和“作用”的重要信息，如蛋白質(zhì)間的物理聯(lián)系(這些蛋白質(zhì)可能會(huì)組成蛋白質(zhì)復(fù)合物)、信號(hào)傳遞途徑，以幫助我們了解細(xì)胞是如何構(gòu)成的以及是如何協(xié)同工作的。返回多細(xì)胞真核生物的蛋白質(zhì)組研究

線蟲的蛋白質(zhì)組研究

果蠅的蛋白質(zhì)組研究

人類的蛋白質(zhì)組研究

線蟲(C.elegans)的蛋白質(zhì)組研究

利用雙向電泳技術(shù)，Bini對(duì)線蟲進(jìn)行了蛋白質(zhì)組分析。在等電點(diǎn)3.5-9和分子質(zhì)量10-200kDa的范圍內(nèi)可分辨2000個(gè)以上的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)，然后利用Edman微量測(cè)序技術(shù)對(duì)其中24個(gè)斑點(diǎn)進(jìn)行分析，得到其中12個(gè)蛋白質(zhì)的Ｎ端序列。其余的由于Ｎ端封閉而未能測(cè)出序列。

已測(cè)出的12個(gè)中有1個(gè)未能找到與其匹配的基因。另外11個(gè)與能量代謝、酸性核蛋白、Ｇ蛋白等對(duì)應(yīng)。

Ｃ.elegans的19000個(gè)基因已于1998年12月全部測(cè)出，預(yù)計(jì)會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)組的研究提供幫助。返回果蠅的蛋白質(zhì)組研究

不同性別果蠅(Ｄrosophilamelanogaster)成蟲的頭、胸、腹部的蛋白質(zhì)組圖譜已被分別作出，總共約有1200個(gè)蛋白質(zhì)被檢出。其中的大多數(shù)在頭、胸、腹中是相同的，但也發(fā)現(xiàn)了一部分其部位、性別特異的蛋白質(zhì)。返回人類的蛋白質(zhì)組研究

人類的蛋白質(zhì)組研究吸引了最多的注意力。由于人有著大量的組織、細(xì)胞類型和發(fā)育階段，對(duì)人蛋白質(zhì)組的研究主要聚焦在特異的組織、細(xì)胞和疾病上。已有的證據(jù)表明，盡管人的不同組織有著很大的功能差別，但其中的許多蛋白質(zhì)是看家蛋白，因此它們的雙向圖譜可能也是近似的。這點(diǎn)與簡(jiǎn)單生物不同，簡(jiǎn)單生物在不同的發(fā)育階段有著極不相同的蛋白質(zhì)組。

因此對(duì)于人類來說，一個(gè)高質(zhì)量的基本的雙向圖譜是非常有用的，它可以作為其他組織、細(xì)胞的參照?qǐng)D譜。人的各種組織、器官、細(xì)胞乃至各種細(xì)胞器已被廣泛研究。人的各種體液（血液、淋巴、脊髓、乳汁和尿等）都被用于研究與某些疾病的關(guān)系。

最近澳大利亞科學(xué)家利用雙向電泳技術(shù)研究眼淚中的蛋白質(zhì)與生理狀態(tài)的關(guān)系。他們發(fā)現(xiàn)了一種新的蛋白質(zhì)，這個(gè)蛋白質(zhì)非常相似于在乳腺癌細(xì)胞里高表達(dá)的另一種蛋白質(zhì)。這個(gè)發(fā)現(xiàn)可能會(huì)提供疾病診治的新的手段。在一項(xiàng)利用蛋白質(zhì)組研究技術(shù)進(jìn)行的酒精對(duì)人體毒性的研究中發(fā)現(xiàn)，乙醇會(huì)改變血清蛋白糖基化作用，導(dǎo)致許多糖蛋白的糖基缺乏，如轉(zhuǎn)鐵蛋白。

腫瘤至今仍是人類的一個(gè)頑敵。癌細(xì)胞不僅有許多特異蛋白質(zhì)產(chǎn)物，而且這些產(chǎn)物還會(huì)影響其他蛋白質(zhì)的翻譯后加工及許多蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。腫瘤的蛋白質(zhì)組研究能提供一些以往其他技術(shù)所不能提供的早期診斷依據(jù)，例如利用不同細(xì)胞組織的特征蛋白質(zhì)譜，可以判別一些難以判定來源的腫瘤細(xì)胞的來源。

丹麥的一個(gè)小組利用蛋白質(zhì)組研究技術(shù)結(jié)合組織冰凍切片技術(shù)分析了150例膀胱癌病人的組織，發(fā)現(xiàn)在所有的鱗狀細(xì)胞瘤的尿液中均能發(fā)現(xiàn)