生工生化試驗講義11

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生物化學試驗講義

試驗一蛋白質(zhì)的性質(zhì)試驗——蛋白質(zhì)及氨基酸的呈色反應及蛋白

質(zhì)的沉淀反應

試驗目的

1．了解構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單位及主要連接方式。2．了解蛋白質(zhì)和某些氨基酸的呈色反應原理。3．學習幾種常用的鑒定蛋白質(zhì)和氨基酸的方法。

4．加深對蛋白質(zhì)溶液的膠體性質(zhì)的認識，了解沉淀蛋白質(zhì)的幾種方法及其實用意義。，

一、茚三酮反應

1.試驗原理

除脯氨酸、羥脯氨酸和茚三酮反應產(chǎn)生黃色物質(zhì)外，所有α—氨基酸及一切蛋白質(zhì)都能和茚三酮反應生成藍紫色物質(zhì)。

β-丙氨酸、氨和大量一級胺都呈陽性反應。尿素、馬尿酸、二酮吡唪和肽鍵上的亞氨基不浮現(xiàn)此反應。因此，雖然蛋白質(zhì)和氨基酸均有茚三酮反應，但能與茚三酮呈陽性反應的不一定就是蛋白質(zhì)或氨基酸。在定性、定量測定中，應嚴防干擾物存在。

該反應十分靈敏，1∶1500000濃度的氨基酸水溶液即能給出反應，是一種常用的氨基酸定量測定方法。

茚三酮反應分為兩步，第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛，水合茚三酮被還原成還原型茚三酮；其次步是所形成的還原型茚三酮同另一個水合茚三酮分子和氨縮合生成有色物質(zhì)。

此反應的適合pH為5~7，同一濃度的蛋白質(zhì)或氨基酸在不同pH條件下的顏色深淺不同，酸度過大時甚至不顯色。2.材料、儀器與試劑

蛋白質(zhì)溶液；新鮮雞蛋清溶液（蛋清∶水=1∶9）；0.5%甘氨酸溶液；0.1%茚三酮水溶液；0.1%茚三酮-乙醇溶液3.試驗操作

①取2支試管分別參與雞蛋清溶液和0.5%甘氨酸溶液1ml，再各加0.5ml0.1%茚三酮水溶液，混勻，在沸水浴中加熱1~2分鐘，觀測顏色由粉色變紫紅色再變藍。

②在一小塊濾紙上滴一滴0.5%甘氨酸溶液，風干后，再在原處滴一滴0.1%茚三酮乙醇溶液，在微火旁烘干顯色，觀測紫紅色斑點的出現(xiàn)。

二、黃色反應

1.試驗原理

含有苯環(huán)結(jié)構(gòu)的氨基酸，如酪氨酸和色氨酸，遇硝酸后，可被硝化成黃色物質(zhì)，該化合物在堿性溶液中進一步形成橙黃色的硝醌酸鈉。

多數(shù)蛋白質(zhì)分子含有帶苯環(huán)的氨基酸，所以有黃色反應，苯丙氨酸不易硝化，需參與少量濃硫酸才有黃色反應。2.材料、儀器與試劑

雞蛋清溶液；大豆提取液(將大豆浸泡充分吸脹后，研磨成漿狀用紗布過濾)；頭發(fā)；指甲；0.5%苯酚溶液；濃硝酸；0.3%色氨酸溶液；0.3%酪氨酸溶液；10%氫氧化鈉溶液3.試驗操作

向7個試管中分別按下表參與試劑，觀測各管出現(xiàn)的現(xiàn)象，有的試管反應慢可略放置或

用微火加熱。待各管出現(xiàn)黃色后，于室溫下逐滴參與10%氫氧化鈉溶液至堿性，觀測顏色變化。管號材料（滴）濃硝酸/（滴）現(xiàn)象

1234頭發(fā)少許4050.5%苯酚4467雞蛋清大豆指甲溶液提取液少許4424400.3%0.3%色氨酸酪氨酸4444三、蛋白質(zhì)沉淀反應

蛋白質(zhì)是親水膠體，當其穩(wěn)定因素被破壞或與某些試劑結(jié)合成不溶性鹽類后，即自溶液

中沉淀析出，此現(xiàn)象叫蛋白質(zhì)的沉淀反應。（一）蛋白質(zhì)的鹽析作用1.試驗原理

鹽析現(xiàn)象是指—般蛋白質(zhì)在高濃度鹽溶液中溶解度下降，故向其溶液中參與中性鹽至一定濃度時，蛋白質(zhì)即自溶液中沉淀析出。鹽析作用與兩種因素有關(guān)：①蛋白質(zhì)分子被濃鹽脫水；②分子所帶電荷被中和。

蛋白質(zhì)的鹽析作用是可逆過程，用鹽析方法沉淀蛋白質(zhì)時，較少引起蛋白質(zhì)變性，經(jīng)透析或用水稀釋時又可溶解。鹽析不同的蛋白質(zhì)所需中性鹽濃度與蛋白質(zhì)種類及pH有關(guān)。分子量大的蛋白質(zhì)(如球蛋白)比分子量小的(如清蛋白)易于析出。球蛋白在半飽和硫酸銨溶液中即可析出，而清蛋白需在飽和硫酸銨溶液中才能析出。2.材料、儀器與試劑

雞蛋清溶液（蛋清∶水=1∶9）；固體硫酸銨；飽和硫酸銨溶（稱取377g硫酸銨溶于20℃500ml的蒸餾水中。硫酸銨在20℃水中的溶解度為754g/L水。配制時需稱取稍過量的硫酸銨使溶液中有少量固體存在，同時可加熱助溶）。3.試驗操作

取雞蛋清溶液約5ml于試管中，再參與等量的飽和硫酸銨溶液，混勻后靜止數(shù)分鐘則析出球蛋白沉淀。將管內(nèi)混合液過濾，向濾液中參與硫酸銨粉末，至硫酸銨飽和不再溶解為止，此時析出的沉淀為清蛋白。（二）重金屬鹽類沉淀蛋白質(zhì)1.試驗原理

溶液pH在蛋白質(zhì)等電點以上時，重金屬鹽類(如Pb2+、Cu2+、Hg2+及Ag+等)易與蛋白質(zhì)結(jié)合成不溶性鹽而沉淀。重金屬鹽類沉淀蛋白質(zhì)尋常比較完全，故常用重金屬鹽除去液體中的蛋白質(zhì)。但應注意，在使用某些重金屬鹽(如硫酸銅或醋酸鉛)沉淀蛋白質(zhì)時，不可過量，否則將引起沉淀再溶解。2.材料、儀器與試劑

雞蛋清溶液（蛋清∶水=1∶9）；5％CuS04溶液；3％AgNO3溶液3.試驗操作

取試管2支各加蛋白質(zhì)溶液1ml，向各管分別滴加2-3滴加5％CuS04溶液、3％AgNO3溶液，觀測各管所生成的沉淀。在硫酸銅產(chǎn)生蛋白質(zhì)沉淀的試管中，倒掉大部分沉淀，留少量沉淀，繼續(xù)參與5％CuS04溶液，觀測沉淀的溶解。（三）有機酸沉淀蛋白質(zhì)1.試驗原理

生物堿是植物中具有顯著生理作用的—類含氮的堿性物質(zhì)。凡能使生物堿沉淀，或能與生物堿作用產(chǎn)生顏色反應的物質(zhì)，稱為生物堿試劑。如鞣酸、苦味酸和磷鎢酸等。當?shù)鞍踪|(zhì)溶液pH值低于其等電點時，蛋白質(zhì)為陽離子，能與生物堿試劑的陰離子結(jié)合成中性鹽而沉淀。溶液中的蛋白亦能被有機酸沉淀，其中以三氯醋酸的作用最為靈敏而且特異，因此廣泛的被用于沉淀蛋白質(zhì)。2.材料、儀器與試劑

雞蛋清溶液（蛋清∶水=1∶9）；10％三氯醋酸溶液；3.試驗操作

取蛋白質(zhì)溶液1ml于試管中，加數(shù)滴三氯醋酸溶液，觀測現(xiàn)象。思考題

1．茚三酮反應的陽性結(jié)果是否經(jīng)常是同一色調(diào)？并說明原因。2．能否利用茚三酮反應可靠地鑒定蛋白質(zhì)的存在？

3．哪些芳香基因（蛋白質(zhì)中的、非蛋白質(zhì)中的）可以與濃硝酸作用浮現(xiàn)黃色反應的陽性結(jié)果？

試驗二考馬斯亮藍G-250法測定蛋白質(zhì)含量

蛋白質(zhì)是細胞中最重要的含氮生物大分子之一，承受著各種生物功能。蛋白質(zhì)的定量分析是蛋白質(zhì)構(gòu)造分析的基礎，也是農(nóng)牧產(chǎn)品品質(zhì)分析、食品營養(yǎng)價值比較、生化育種、臨床診斷等的重要手段。根據(jù)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)，提出多種蛋白質(zhì)定量方法。考馬斯亮藍G-250法是比色法與色素法相結(jié)合的復合方法，簡便快捷，靈敏度高，穩(wěn)定性好，是一種較好的常用方法。通過本試驗學習考馬斯亮藍G-250法測定蛋白質(zhì)含量的原理，了解分光光度計的結(jié)構(gòu)、原理和在比色法中的應用。

考馬斯亮藍法測定蛋白質(zhì)濃度，是利用蛋白質(zhì)-染料結(jié)合的原理，定量的測定微量蛋白濃度的快速、靈敏的方法。

考馬斯亮藍G-250存在著兩種不同的顏色形式，紅色和藍色?？捡R斯亮藍G-250在酸性游離狀態(tài)下呈棕紅色，最大光吸收在465nm，當它與蛋白質(zhì)結(jié)合后變?yōu)樗{色，最大光吸收在595nm。在一定的蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)-染料復合物在波長為595nm處的光吸收與蛋白質(zhì)含量成正比，通過測定595nm處光吸收的增加量可知與其結(jié)合蛋白質(zhì)的量。蛋白質(zhì)和考馬斯亮藍G-250結(jié)合，在2min左右的時間內(nèi)達到平衡，完成反應十分迅速，其結(jié)合物在室

溫下1小時內(nèi)保持穩(wěn)定。蛋白質(zhì)-染料復合物具有很高的消光系數(shù)，使得在測定蛋白質(zhì)濃度時靈敏度很高，可測微克級蛋白質(zhì)含量。1.儀器

電子天平、試管、試管架、移液管、容量瓶、721型分光光度劑2.試劑（1）標準蛋白質(zhì)溶液：稱取10mg牛血清白蛋白，溶于蒸餾水并定容至100mL，制成100μg/mL牛血清白蛋白溶液

（2）考馬斯亮藍G-250蛋白試劑：稱取100mg考馬斯亮藍G-250，溶于50mL90%乙醇中，

參與85%的磷酸100mL，最終用蒸餾水定容到1000mL。（3）雞蛋清1ml定容至50mL1、標準曲線繪制

取6支試管，按下表參與各試劑。管號試劑100μg/mL牛血清白蛋白溶液／mL蒸餾水／mL考馬斯亮藍液／mL蛋白質(zhì)含量/μg001.05.0010.20.85.02020.40.65.04030.60.45.06040.80.25.08051.005.0100參與考馬斯亮藍G-250蛋白試劑后，搖勻，放置2min后，在595nm波長下比色測定，記錄A595。以各管相應標準蛋白質(zhì)含量（mg）為橫坐標、A595為縱坐標，繪制標準曲線。2、樣品測定

試管中加自制蛋白質(zhì)樣品1.0mL，再參與5.0mL考馬斯亮藍G-250試劑，搖勻，放置5min后，在595nm波長下比色，記錄A595。根據(jù)所測A595從標準曲線上查得蛋白質(zhì)含量。

根據(jù)所測樣品提取液的吸光度，在標準曲線上查得相應的蛋白質(zhì)含量（μg），按下式計算：

查得的蛋白質(zhì)含量（μg）×提取液總體積（mL）樣品蛋白質(zhì)含量（μg/g鮮重）=

樣品鮮重（g）×測定時取用的提取液體積（mL）

（1）假使測定要求很嚴格，可以在試劑參與后的5～20min內(nèi)測定光吸收，由于在這段時間內(nèi)顏色是最穩(wěn)定的。比色反應需在1h內(nèi)完成。

（2）測定中，蛋白-染料復合物會有少部分吸附于比色杯壁上，試驗證明此復合物的吸附量是可以忽略的。測定完后可用乙醇將藍色的比色杯洗清白。

試驗三糖的性質(zhì)試驗及總糖和還原糖含量測定

一.試驗目的

1.加深對單糖、二糖、多糖化學性質(zhì)的認識，進一步體會糖類化合物的分子結(jié)構(gòu)與其化學性質(zhì)的關(guān)系。

2.了解3，5—二硝基水楊酸法測定還原糖的基本原理。

3.區(qū)分還原糖和總糖測定過程的異同，把握具體的操作方法。

二.試驗原理

糖是多羥基醛、多羥基酮或它們的縮合物。單糖及分子中含有半縮醛（酮）羥基的二糖都具有還原性，能將班氏試劑還原成磚紅色的Cu2O沉淀。蔗糖等不含有半縮醛（酮