癌生物學(xué)第五課p與凋亡

癌生物學(xué)第五課p與凋亡第1頁，共42頁，2023年，2月20日，星期一NanjingUniversity一、p53的發(fā)現(xiàn)：P53與凋亡F9：胚胎腫瘤細胞SV40：多乳頭瘤病毒T：SV40轉(zhuǎn)化倉鼠血清N:普通倉鼠血清P53在兩種不同的轉(zhuǎn)化細胞中高表達（1979）1979年，研究人員發(fā)現(xiàn)突變型p53常見于腫瘤。1993年，該年被稱為“p53分子年”第2頁，共42頁，2023年，2月20日，星期一NanjingUniversity二、p53是腫瘤抑制基因P53與凋亡編碼Ras癌蛋白的cDNA與7種不同形式的p53cDNA共轉(zhuǎn)染大鼠胚胎成纖維細胞第3頁，共42頁，2023年，2月20日，星期一NanjingUniversity二、p53是腫瘤抑制基因P53與凋亡P53不能被簡單認為是正常發(fā)育中細胞增殖的普通負調(diào)節(jié)者，實際上p53更像是專門阻止非正常細胞的出現(xiàn)，尤其是那些有可能發(fā)展為腫瘤的細胞P53-/-小鼠胚胎發(fā)育和出生存活率不受影響，但在生命的相對早期死亡率相當(dāng)高，大部分死于腫瘤，如肉瘤和白血病P53+/-雜合小鼠大約在250天左右發(fā)生腫瘤P53+/+小鼠在500天中沒有出現(xiàn)死亡第4頁，共42頁，2023年，2月20日，星期一NanjingUniversity二、p53是腫瘤抑制基因P53與凋亡至2002年，數(shù)據(jù)顯示在30-50%的人類腫瘤中都存在P53基因的突變實際上，在迄今所有人類腫瘤細胞基因組中，p53是發(fā)生突變頻率最高的P53等位基因在人類腫瘤細胞中突變的頻率第5頁，共42頁，2023年，2月20日，星期一NanjingUniversity三、突變的p53影響正常p53的功能P53與凋亡多大多數(shù)與腫瘤相關(guān)的突變p53等位基因（75%）都在可讀區(qū)存在錯義密碼子（導(dǎo)致氨基酸的改變），而不是無義密碼子（導(dǎo)致多肽鏈過早終止）第6頁，共42頁，2023年，2月20日，星期一NanjingUniversity腫瘤細胞在p53蛋白發(fā)生輕微改變的情況下，比它完全缺失更獲益，如通過無義突變或直接刪除p53基因的重要部分而形成無效等位基因三、突變的p53影響正常p53的功能P53與凋亡人類腫瘤超過15000個p53的突變等位基因被測序，大多數(shù)是點突變。其中95.1%的突變影響著p53蛋白的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域第7頁，共42頁，2023年，2月20日，星期一p53基因雜合細胞中，15/16的蛋白質(zhì)都缺乏完整的正常功能突變的p53蛋白是如何促進腫瘤細胞的形成？三、突變的p53影響正常p53的功能P53與凋亡背景線索：1）有意義的突變使編碼的基因產(chǎn)物失活；2)這個突變使得突變等位基因能夠干擾或妨礙細胞中剩下的野生型拷貝的正?；钚裕ㄟ@種類型的等位基因被命名為差異顯性干擾或者顯性負等位基因）3）p53是一個核蛋白，以同源四聚體（4個相同的多肽亞基）的形式存在于細胞中推論：突變的p53等位基因可以有效地干擾在同一個細胞中表達的野生型p53等位基因。甚至只含有一個突變型的蛋白質(zhì)亞基都可能導(dǎo)致整個四聚體的功能受損第8頁，共42頁，2023年，2月20日，星期一NanjingUniversity四、p53的半衰期短：P53與凋亡P53的核定位提示該蛋白可能作為一個轉(zhuǎn)錄因子而起作用，第一種機制，p53蛋白水平的改變是主要的背景：目前已知的三種調(diào)控核轉(zhuǎn)錄因子活性的機制：1）調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子在核內(nèi)的水平2）轉(zhuǎn)錄因子在核內(nèi)的水平保持恒定，但其活性必須由一些共價修飾復(fù)制3）調(diào)控某個共同轉(zhuǎn)錄因子水平一種抑制蛋白質(zhì)合成的藥物：放線菌酮，能夠用來區(qū)分相對穩(wěn)定的蛋白（合成后能持續(xù)數(shù)十到數(shù)百小時）和代謝高度不穩(wěn)定的蛋白（一合成就被降解）。野生型p53蛋白的半衰期大約是20min，說明p53是高度不穩(wěn)定的蛋白。為什么細胞要浪費能量和物質(zhì)來合成這么一個高度不穩(wěn)定的蛋白？生理信號刺激細胞增加或降低某種蛋白的水平，可以通過調(diào)控編碼mRNA水平或mRNA的翻譯速率來完成。但對于某個關(guān)鍵的蛋白更為迅速的調(diào)控可以通過增加或者降低其穩(wěn)定性來完成。如p53蛋白濃度可以通過抑制降解使其在20min內(nèi)加倍第9頁，共42頁，2023年，2月20日，星期一NanjingUniversity五、誘導(dǎo)p53的信號P53與凋亡細胞中存在很多負責(zé)監(jiān)控細胞系統(tǒng)完整及功能的傳感器，當(dāng)檢測到損傷或異常時，將信號傳遞給p53及其調(diào)節(jié)器，導(dǎo)致細胞p53水平快速升高不可逆可逆第10頁，共42頁，2023年，2月20日，星期一NanjingUniversity五、誘導(dǎo)p53的信號P53與凋亡X線照射后，，p53、p21Cip1蛋白水平升高，從而抑制CDK導(dǎo)致細胞周期阻滯，但在p53突變的細胞中則不發(fā)生。因此，攜帶突變p53等位基因的細胞與野生型細胞相比，同時暴露于應(yīng)激原時，進入細胞阻滯或者凋亡的傾向明顯要小第11頁，共42頁，2023年，2月20日，星期一NanjingUniversity五、誘導(dǎo)p53的信號P53與凋亡小結(jié)P53持續(xù)接受多種監(jiān)控系統(tǒng)傳出的信號；如果p53接受到特殊的警告信號，它將阻止細胞的增殖或者啟動凋亡程序P53的抑制細胞生長和促進細胞凋亡的功能，對于向惡性生長期進展的初期腫瘤細胞是一個主要威脅應(yīng)激、DNA損傷、信號通路失調(diào)是腫瘤各個時期都會經(jīng)歷到，因此一個完整的p53警告系統(tǒng)對腫瘤構(gòu)成威脅大多數(shù)或者可能所有的人類腫瘤細胞的p53警報系統(tǒng)必須部分或全部失活沒有完整的p53，腫瘤細胞可以忍受缺氧、DNA損傷及生長調(diào)控通路的失調(diào)正常細胞則需要避免p53過度激活第12頁，共42頁，2023年，2月20日，星期一NanjingUniversity六、DNA損傷及失調(diào)的生長信號導(dǎo)致p53穩(wěn)定P53與凋亡損失或信號失衡，監(jiān)控系統(tǒng)將發(fā)送報警信號給p53，有三個研究較清楚的監(jiān)控系統(tǒng)：1）對染色體DNA雙鏈斷裂應(yīng)答：基因組中任何一個位置的雙鏈斷裂都足夠引起p53水平的上調(diào)，只是不清楚那種蛋白檢測到了斷裂，但知將信號傳遞給p53的是ATM激酶（和ATR激酶），使p53磷酸化而不被降解。2）對DNA損傷因子的應(yīng)答：包括某些化療藥物、紫外線照射及某些蛋白激酶抑制劑。ATR激酶將信號傳遞給酪蛋白激酶（CKII），后者磷酸化p533）異常的生長信號，特別是pRb-E2F控制的細胞周期發(fā)生紊亂0第13頁，共42頁，2023年，2月20日，星期一NanjingUniversity七、Mdm2和ARF為p53的命運而戰(zhàn)P53與凋亡Mdm2最初在鼠肉瘤細胞中發(fā)現(xiàn)，由細胞染色體中的雙微體（double-minutechromosome）編碼。在許多人類肺癌中，Mdm2都是過表達

P53蛋白是由泛素蛋白酶體系統(tǒng)降解

正常情況下，p53的降解由Mdm2(小鼠）和HdmI（人）的蛋白調(diào)控，介導(dǎo)泛素與p53連接并將p53從核內(nèi)轉(zhuǎn)運到細胞質(zhì)的蛋白酶體中Mdm2連續(xù)而高效的運作保證了p53在正常未受刺激細胞中20min的半衰期

細胞遭遇某些類型刺激或者損傷，p53通過磷酸化來免除Mdm2對它的降解，Mdm2不能與磷酸化的p53結(jié)合，不能使其泛素化Mdm2和p53生死相連第14頁，共42頁，2023年，2月20日，星期一NanjingUniversity七、Mdm2和ARF為p53的命運而戰(zhàn)P53與凋亡ARF：Mdm2的拮抗物，p53敵人的敵人，是重要的抑制腫瘤的基因在小鼠為p19ARF（p16INK4A),在人為p14ARF，后被命名為ARE基因ARF與Mdm2結(jié)合并抑制其功能，快速誘導(dǎo)p53的上調(diào)在多種保留著野生型的p53拷貝的人類腫瘤中，通過失活兩個編碼ARE的基因拷貝來去除p53的功能多種激酶控制p53水平第15頁，共42頁，2023年，2月20日，星期一NanjingUniversity七、Mdm2和ARF為p53的命運而戰(zhàn)P53與凋亡ARF與p53的同盟第16頁，共42頁，2023年，2月20日，星期一NanjingUniversity八、ARF和p53介導(dǎo)的凋亡通過監(jiān)控胞內(nèi)信號來監(jiān)控腫瘤P53與凋亡第17頁，共42頁，2023年，2月20日，星期一NanjingUniversity九、p53:基因組的忠實守護者P53與凋亡p53作為轉(zhuǎn)錄因子來阻斷DNA損傷后細胞周期進程以及參與修復(fù)過程，p53蛋白有一個DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域p53四聚體還需要經(jīng)過復(fù)雜的共價修飾（C端），包括乙?；?、糖基化、磷酸化、核糖基化和sumo化突變的p53基因?qū)е聀53蛋白喪失轉(zhuǎn)錄激活能力，最直接的就是不能誘導(dǎo)Mdm2的轉(zhuǎn)錄及合成，使p53逃脫降解并累積染色體DNA受損傷后，P53蛋白通過阻止細胞周期的進程和DNA的復(fù)制、誘導(dǎo)表達DNA修復(fù)酶，減少細胞基因組中突變累積的比率P53的突變或缺失，可導(dǎo)致基因組中錯誤的積累第18頁，共42頁，2023年，2月20日，星期一NanjingUniversityP53靶基因舉例P53與凋亡基因類型基因名稱基因產(chǎn)物功能P53拮抗基因MDM2/HDM2誘導(dǎo)p53的泛素化生長阻滯基因p21CiplCDK抑制劑、DNA聚合酶Siah-1Beta-catenin降解14-3-3將cyclinB-CDC2束縛于胞質(zhì)中ReprimoG2期阻滯DNA修復(fù)基因p53R2核苷酸還原酶-DNA前體的合成XPE/DDB2GlobalNERXPCGlobalNERXPGGlobalNER,TCRGADD45GlobalNER?DNApolk易出錯的DNA聚合酶第19頁，共42頁，2023年，2月20日，星期一P53靶基因舉例NanjingUniversity凋亡調(diào)節(jié)子BAX線粒體孔蛋白PUMABH3線粒體孔蛋白NOXABH3線粒體孔蛋白p53AIP1去除線粒體膜電位KillerlDR5細胞表面死亡受體PIDD死亡結(jié)構(gòu)域蛋白PERP促凋亡轉(zhuǎn)膜蛋白APAF1Caspase-9的激活子NF-kB轉(zhuǎn)錄因子參與TNF信號通路FaslAPO1死亡受體PIG3線粒體氧化/還原調(diào)控PTEN降低抗凋亡的PIP3水平Bcl-2（抑制）其表達IGF-1R（抑制）其表達IGFBP-3IGF-1拮抗抗蛋白TSP-1(thrombospondin)血管生成拮抗劑第20頁，共42頁，2023年，2月20日，星期一十、p53引起的程序性凋亡P53與凋亡半胱氨酸天冬氨酸酶剪切細胞骨架蛋白：肌動蛋白、網(wǎng)格蛋白、彈性蛋白、凝溶膠蛋白使細胞骨架塌陷半胱天冬酶剪切核膜內(nèi)表面的纖層蛋白，導(dǎo)致染色質(zhì)凝集和核固縮半胱天冬酶活化并剪切脫氧核糖核酸酶的抑制劑（ICAD）最終導(dǎo)致DNA降解自然死亡小體第21頁，共42頁，2023年，2月20日，星期一十、p53引起的程序性凋亡P53與凋亡第22頁，共42頁，2023年，2月20日，星期一十、p53引起的程序性凋亡P53與凋亡第23頁，共42頁，2023年，2月20日，星期一問題：p53是如何在抑制細胞生長、阻礙細胞周期進程和激活細胞程序性凋亡之間進行選擇的？P53與凋亡第24頁，共42頁，2023年，2月20日，星期一十、p53引起的程序性凋亡P53與凋亡p53引起的凋亡常限于非常規(guī)的，即威脅到細胞及組織的緊急情況。如腫瘤的發(fā)生，p53啟動的凋亡是生物體清除有潛在成瘤能力細胞的一種方法第25頁，共42頁，2023年，2月20日，星期一NanjingUniversity十一、p53的失活對初始癌細胞在腫瘤進行發(fā)展的多個階段起著重要的作用P53與凋亡腫瘤形成的早期階段，癌基因常通過不同形式的突變活化，容易引起p53誘導(dǎo)的凋亡。因此，具有這樣一個癌基因的細胞如果減弱了p53的功能，就能具備更強的生長優(yōu)勢第26頁，共42頁，2023年，2月20日，星期一NanjingUniversity十二、凋亡是一個依賴線粒體的復(fù)雜過程P53與凋亡P53僅僅是引起程序性死亡的作用者之一，凋亡還可以不依賴于p53，如失巢凋亡。Caspase3陽性細胞（失巢）附著于整聯(lián)蛋白的存活乳腺細胞（顯示胞核）第27頁，共42頁，2023年，2月20日，星期一NanjingUniversity十二、凋亡是一個依賴線粒體的復(fù)雜過程P53與凋亡bcl-2(B-celllymphomagene-2),是最早知道的調(diào)節(jié)凋亡基因。bcl-2

能夠延長本來會迅速死亡細胞的壽命。myc癌基因，單獨作用時能有效促進細胞分裂，但其生長能力卻被它的死亡誘導(dǎo)能力減弱，若bcl-2和myc同時作用，能使細胞具有更強的惡性行為myc的死亡誘導(dǎo)作用能被p53基因的失活而中和不同轉(zhuǎn)基因小鼠死于淋巴瘤的時間第28頁，共42頁，2023年，2月20日，星期一NanjingUniversity十二、凋亡是一個依賴線粒體的復(fù)雜過程P53與凋亡Bcl-2癌蛋白在胞內(nèi)發(fā)揮作用的場所是線粒體外膜，調(diào)控線粒體介導(dǎo)的凋亡。細胞色素C位于線粒體外膜和內(nèi)膜之間，起著傳遞電子的作用。一旦凋亡信號開始，細胞色素C會脫離線粒體進入胞質(zhì)，并聯(lián)合其它蛋白啟動凋亡級聯(lián)事件第29頁，共42頁，2023年，2月20日，星期一NanjingUniversity十二、凋亡是一個依賴線粒體的復(fù)雜過程P53與凋亡細胞色素C位于線粒體外膜和內(nèi)膜之間，起著傳遞電子的作用。一旦凋亡信號開始，細胞色素C會脫離線粒體進入胞質(zhì)，并聯(lián)合其它蛋白啟動凋亡級聯(lián)事件A起始時，細胞色素C與線粒體分布一致B-D當(dāng)?shù)蛲鲞M展時，細胞色素C從線粒體釋放，在胞漿中的染色變得均勻，同時胞核出現(xiàn)與凋亡相一致的斷裂第30頁，共42頁，2023年，2月20日，星期一十二、凋亡是一個依賴線粒體的復(fù)雜過程P53與凋亡Bcl-2家族成員：右圖BH3-only蛋白活性可以通過：轉(zhuǎn)錄、胞內(nèi)定位、蛋白水解切割或磷酸化調(diào)節(jié)跨膜錨定區(qū)Bax家族成員常以無活性的方式存在于線粒體外膜或細胞漿中；BH3-only家族的無活性成員只存在于細胞質(zhì)。它們都被促凋亡信號活化或易位至線粒體中第31頁，共42頁，2023年，2月20日，星期一NanjingUniversity十二、凋亡是一個依賴線粒體的復(fù)雜過程P53與凋亡Bcl-2家族成員間的調(diào)節(jié)抑制Bcl-XL的功能第32頁，共42頁，2023年，2月20日，星期一NanjingUniversity十二、凋亡是一個依賴線粒體的復(fù)雜過程P53與凋亡Bax（不可見）/Bak（黑色顆粒）在線粒體外膜上的聚集，導(dǎo)致線粒體斷裂，細胞色素C的釋放第33頁，共42頁，2023年，2月20日，星期一P53與凋