現(xiàn)在分子生物學(xué)（筆記） 朱玉賢 第三版

本文格式為Word版，下載可任意編輯——現(xiàn)在分子生物學(xué)（筆記）朱玉賢第三版第一章緒論分子生物學(xué)

分子生物學(xué)的基本含義(p8)

分子生物學(xué)是研究核酸、蛋白質(zhì)等所有生物大分子的形態(tài)、結(jié)構(gòu)特征及其重要性、規(guī)律性和相互關(guān)系的科學(xué)，是人類從分子水平上真正揭開生物世界的奧秘，由被動(dòng)地適應(yīng)自然界轉(zhuǎn)向主動(dòng)地改造和重組自然界的基礎(chǔ)學(xué)科。

分子生物學(xué)與其它學(xué)科的關(guān)系

分子生物學(xué)是由生物化學(xué)、生物物理學(xué)、遺傳學(xué)、微生物學(xué)、細(xì)胞學(xué)、以至信息科學(xué)等多學(xué)科相互滲透、綜合融會(huì)而產(chǎn)生并發(fā)展起來的，凝聚了不同學(xué)科專長的科學(xué)家的共同努力。它雖產(chǎn)生于上述各個(gè)學(xué)科，但已形成它獨(dú)特的理論體系和研究手段，成為一個(gè)獨(dú)立的學(xué)科。

生物化學(xué)與分子生物學(xué)關(guān)系最為密切:

生物化學(xué)是從化學(xué)角度研究生命現(xiàn)象的科學(xué)，它著重研究生物體內(nèi)各種生物分子的結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)變與新陳代謝。傳統(tǒng)生物化學(xué)的中心內(nèi)容是代謝，包括糖、脂類、氨基酸、核苷酸、以及能量代謝等與生理功能的聯(lián)系。

分子生物學(xué)則著重說明生命的本質(zhì)主要研究生物大分子核酸與蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能、生命信息的傳遞和調(diào)控。

細(xì)胞生物學(xué)與分子生物學(xué)關(guān)系也十分密切:

傳統(tǒng)的細(xì)胞生物學(xué)主要研究細(xì)胞和亞細(xì)胞器的形態(tài)、結(jié)構(gòu)與功能。探討組成細(xì)胞的分子結(jié)構(gòu)比單純觀測大體結(jié)構(gòu)能更加深入認(rèn)識(shí)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與功能，因此現(xiàn)代細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展越來越多地應(yīng)用分子生物學(xué)的理論和方法。

分子生物學(xué)則是從研究各個(gè)生物大分子的結(jié)構(gòu)入手，但各個(gè)分子不能孤立發(fā)揮作用，生命絕非組成成分的隨意加和或混合，分子生物學(xué)還需要進(jìn)一步研究各生物分子間的高層次組織和相互作用，特別是細(xì)胞整體反應(yīng)的分子機(jī)理，這在某種程度上是向細(xì)胞生物學(xué)的靠攏。

第一章序論

1859年發(fā)表了《物種起源》，用事實(shí)證明“物競天擇，適者生存〞的進(jìn)化論思想。

指出：物種的變異是由于大自然的環(huán)境和生物群體的生存競爭造成的，完全否定了“創(chuàng)世說〞。達(dá)爾文第一個(gè)認(rèn)識(shí)到生物世界的不連續(xù)性。

意義：達(dá)爾文關(guān)于生物進(jìn)化的學(xué)說及其唯物主義的物種起源理論，是生物科學(xué)史上最宏偉的創(chuàng)舉之一，具有不可磨滅的貢獻(xiàn)。

細(xì)胞學(xué)說

細(xì)胞學(xué)說的建立及其意義

德國植物學(xué)家施萊登和德國動(dòng)物學(xué)家施旺共同提出：一切植物、動(dòng)物都是由細(xì)胞組成的，細(xì)胞是一切動(dòng)植物的基本單位。

經(jīng)典遺傳學(xué)

兩條基本規(guī)律:

統(tǒng)一律：當(dāng)兩種不同植物雜交時(shí)，它們的下一代可能與親本之一完全一致；

分開規(guī)律：將不同植物品種雜交后的F1代種子再進(jìn)行雜交或自交時(shí)，下一代就會(huì)依照一定的比例分開，因而具有不同的形式。

1865年發(fā)表《植物雜交試驗(yàn)》，直到1900年才被人們重新發(fā)現(xiàn)。孟德爾被公認(rèn)為經(jīng)典遺傳學(xué)的奠基人。

現(xiàn)代遺傳學(xué)

Morgan及其助手第一次將代表某一特性的基因同染色體聯(lián)系起來，使科學(xué)界普遍認(rèn)識(shí)了染色體的重要性并接受了孟德爾的遺傳學(xué)原理。

Morgan特別指出：種質(zhì)必需由某些獨(dú)立的要素組成，我們把這些要素稱為遺傳因子或基因。

其次節(jié)分子生物學(xué)發(fā)展簡史

準(zhǔn)備和醞釀階段（19世紀(jì)后期到20世紀(jì)50年代初）

對(duì)生命本質(zhì)的認(rèn)識(shí)上的兩點(diǎn)重大突破：

1．確定了蛋白質(zhì)是生命的主要基礎(chǔ)物質(zhì)

2．確定了生物遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)是DNA

現(xiàn)代分子生物學(xué)的建立和發(fā)展階段（20世紀(jì)50年代初到70年代初）

這一階段以1953年Watson和Crick提出的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型作為現(xiàn)代分子生物學(xué)誕生的里程碑開創(chuàng)了分子遺傳學(xué)基本理論建立和發(fā)展的黃金時(shí)代。在此期間的主要進(jìn)展包括：

遺傳信息傳遞中心法則的建立

對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的進(jìn)一步認(rèn)識(shí)

DNA雙螺旋發(fā)現(xiàn)的意義：

確立了核酸作為信息分子的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)；

提出了堿基配對(duì)是核酸復(fù)制、遺傳信息傳遞的基本方式；

從而最終確定了核酸是遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)，為認(rèn)識(shí)核酸與蛋白質(zhì)的關(guān)系及其在生命中的作用打下了最重要的基礎(chǔ)。

Crick于1954年所提出遺傳信息傳遞的中心法則（CentralDogma）：

初步認(rèn)識(shí)生命本質(zhì)并開始改造生命的深入發(fā)展階段（20世紀(jì)70年代后至今）

基因工程技術(shù)的出現(xiàn)作為標(biāo)志。其間的重大成就包括：

重組DNA技術(shù)的建立和發(fā)展

基因組研究的發(fā)展

單克隆抗體及基因工程抗體的建立和發(fā)展

基因表達(dá)調(diào)控機(jī)理

細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)理研究成為新的前沿領(lǐng)域

第三節(jié)分子生物學(xué)的主要研究內(nèi)容

一．DNA重組技術(shù)（recombinantDNAtechnology）

定義：又稱為基因工程，根據(jù)分子生物學(xué)和遺傳學(xué)的原理，將一種生物的遺傳物質(zhì)DNA轉(zhuǎn)移到另一生物體中，使后者獲得新的遺傳性狀或表達(dá)出所需要的產(chǎn)物。

DNA重組技術(shù)的應(yīng)用：

利用微生物基因工程生產(chǎn)重組基因工程藥物

轉(zhuǎn)基因植物和動(dòng)物體細(xì)胞克隆

基因表達(dá)與調(diào)控的基礎(chǔ)研究

二．生物大分子的結(jié)構(gòu)功能研究

三．基因組、功能基因組與生物信息學(xué)的研究

基因組、蛋白質(zhì)組與生物信息學(xué)

基因組(Genome)：細(xì)胞或生物體一條完整單體的全部染色體遺傳物質(zhì)的總和。

人類基因組計(jì)劃（HumanGenomeProject,HGP）：測定出人基因組全部DNA3109鹼基對(duì)的序列、確定人類約5-10萬個(gè)基因的一級(jí)結(jié)構(gòu)。

基因組、蛋白質(zhì)組與生物信息學(xué)

蛋白組計(jì)劃（Proteomeproject）:又稱為后基因組計(jì)劃或功能基因組計(jì)劃，用于透露并說明細(xì)胞、組織乃至整個(gè)生物個(gè)體全部蛋白質(zhì)及其功能。

生物信息學(xué)（Bioinformatics）:是在生命科學(xué)的研究中，以計(jì)算機(jī)為工具對(duì)生物信息進(jìn)行儲(chǔ)存、檢索和分析的科學(xué)。

四．基因表達(dá)調(diào)控研究

其次章染色體與DNA

本章內(nèi)容

1.染色體

2.DNA的結(jié)構(gòu)

3.DNA的復(fù)制

4.原核生物和真核生物DNA復(fù)制特點(diǎn)

5.DNA的修復(fù)

6.DNA的轉(zhuǎn)座

第一節(jié)染色體(chromosome)

概念：

染色體(chromosome)：原指真核生物細(xì)胞分裂中期具有一定形態(tài)特征的染色質(zhì)?，F(xiàn)在這一概念已擴(kuò)大為包括原核生物及細(xì)胞器在內(nèi)的基因載體的總稱。

染色質(zhì)(chromatin)：由DNA和蛋白質(zhì)構(gòu)成，在分裂間期染色體結(jié)構(gòu)疏松，稱為染色質(zhì)。其實(shí)染色質(zhì)與染色體只是同一物質(zhì)在不同細(xì)胞周期的表現(xiàn)。

常染色質(zhì)(euchromatin)：是進(jìn)行活躍轉(zhuǎn)錄的部位，呈疏松的環(huán)狀，電鏡下表現(xiàn)為淺染，易被核酸酶在一些敏感的位點(diǎn)(hypersensitivesites)降解。

異染色質(zhì)(heterochromatin)：在間期核中處于凝縮狀態(tài)，無轉(zhuǎn)錄活性，也叫非活動(dòng)染色質(zhì)(inactivechromatin)，是遺傳惰性區(qū)。在細(xì)胞周期中表現(xiàn)為晚復(fù)制，早凝縮，即異固縮現(xiàn)象(heteropycnosis)。

原核細(xì)胞與真核細(xì)胞特征分析

染色體特性：

分子結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定

能夠自我復(fù)制，使親、子代之間保持連續(xù)性

能夠指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成，從而控制整個(gè)生命過程

能夠產(chǎn)生可遺傳的變異

真核細(xì)胞染色體的組成

DNA30%--40%

組蛋白(histone)30%--40%

非組蛋白(NHP)變化很大

少量RNA

染色體中的蛋白質(zhì)

組蛋白(histone)：一類小的帶有豐富正電荷(富含Lys、Arg)的核蛋白，與DNA有高親和力。

組蛋白是染色體的結(jié)構(gòu)蛋白，它與DNA組成核小體。組蛋白分為H1、H2A、H2B、H3及H4。

非組蛋白(non-histoneprotein)：是染色體上與特異DNA序列結(jié)合的蛋白質(zhì)，所以又稱為序列特異性DNA結(jié)合蛋白。

組蛋白具有如下特性：

1、進(jìn)化上的極端保守性。

2、無組織特異性。

3、肽鏈上氨基酸分布的不對(duì)稱性。

4、組蛋白的修飾作用。

5、富含賴氨酸的組蛋白H5。

非組蛋白：

非組蛋白大約占組蛋白總量的60－70%，種類好多。

（1）HMG蛋白(highmobilitygroupprotein)，能與DNA結(jié)合(不穩(wěn)固)，也能與H1作用,可能與DNA的超螺旋結(jié)構(gòu)有關(guān)。

（2）DNA結(jié)合蛋白：可能是一些與DNA的復(fù)制或轉(zhuǎn)錄有關(guān)的酶或調(diào)理物質(zhì)。

（3）A24非組蛋白：與H2A差不多，位于核小體內(nèi)，功能不祥。

非組蛋白的一般特性：

1.非組蛋白的多樣性；

非組蛋白的量大約是組蛋白的60%～70%，但它的種類卻好多，約在20-100種之間，其中常見的有15-20種。

2.非組蛋白的組織專一性和種屬專一性。

DNA

C值：尋常指一種生物單倍體基因組DNA的總量。

C值反?，F(xiàn)象：真核細(xì)胞基因組的最大特點(diǎn)是它含有大量的重復(fù)序列，而且功能DNA序列大多被不編碼蛋白質(zhì)的非功能DNA所隔開，這就是著名的“C值反常現(xiàn)象〞。

染色體中的DNA

根據(jù)DNA的動(dòng)力學(xué)研究，真核細(xì)胞DNA可分為：

高度重復(fù)序列：幾百→幾萬copy。如：衛(wèi)星DNA和微衛(wèi)星DNA。

中度重復(fù)序列：10→幾百copy。如：各種rDNA、tDNA及組蛋白基因。

低度重復(fù)序列：2→10copy。如：血紅蛋白。

單拷貝序列：大多數(shù)編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因和基因間間隔序列。只有一個(gè)拷貝。如：蛋清蛋白。

染色體折疊

DNA

核小體

螺線管

圓筒

超螺旋

（1）核小體

染色質(zhì)纖維細(xì)絲是大量核小體連成的念珠狀結(jié)構(gòu)。核小體(nucleosome)：DNA繞在組蛋白八聚體(H2A、H2B、H3、H4各一對(duì))核心外1.8周(146bp)，形成核小體核心顆粒。

（2）螺線管

10nm的染色質(zhì)細(xì)絲盤繞成螺旋管狀的30nm纖維粗絲，

通稱螺線管（solenoid）。螺線管的每一螺旋包含6個(gè)核小體，其壓縮比為6。這種螺線管是分裂間期染色質(zhì)和分裂中期染色體的基本組分。

（3）上述螺線管可進(jìn)一步壓縮形成超螺旋。由30nm螺線管纏繞而成一修長、中空的圓筒，直徑為4000nm，壓縮比是40。

（4）超螺旋進(jìn)一步壓縮1/5便成為染色體單體，總壓縮比是7×6×40×5，將近一萬倍。

原核生物基因組

特點(diǎn)：

1、結(jié)構(gòu)簡練

2、存在轉(zhuǎn)錄單元多順反子mRNA

3、有重疊基因

Sanger1977在《Nature》上發(fā)表了ΦX174DNA的全部核苷酸序列，正式發(fā)現(xiàn)了重疊基因。

其次節(jié)DNA的結(jié)構(gòu)

一、DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)

所謂DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)，就是指4種核苷酸的連接及其排列順序，表示了該DNA分子的化學(xué)構(gòu)成。

基本特點(diǎn)

①DNA分子是由兩條相互平行的脫氧核苷酸長鏈盤繞而成的。

②DNA分子中的脫氧核糖和磷酸交替連接，排在外側(cè)，構(gòu)成基本骨架，堿基排列在內(nèi)側(cè)。

③兩條鏈上的堿基通過氫鍵相結(jié)合，形成堿基對(duì)，它的組成有一定的規(guī)律。這就是嘌呤與嘧啶配對(duì)，而且腺嘌呤（A）只能與胸腺嘧啶（T）配對(duì)，鳥嘌呤（G）只能與胞嘧啶（C）配對(duì)。

2、DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)

DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)是指兩條多核苷酸鏈反向平行盤繞所生成的雙螺旋結(jié)構(gòu)。

尋常狀況下，DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)分兩大類：一類是右手螺旋，如A-DNA和B-DNA；另一類是左手螺旋，即Z-DNA。

3、DNA的高級(jí)結(jié)構(gòu)

DNA的高級(jí)結(jié)構(gòu)是指DNA雙螺旋進(jìn)一步扭曲盤繞所形成的特定空間結(jié)構(gòu)。超螺旋結(jié)構(gòu)

是DNA高級(jí)結(jié)構(gòu)的主要形式，可分為正超螺旋與負(fù)超螺旋兩大類。

DNA分子的超螺旋化可以用一個(gè)數(shù)學(xué)公式來表示：

L=T+W其中L為連接數(shù)（linkingnumber），是指環(huán)形DNA分子兩條鏈間交織的次數(shù)。只要不發(fā)生鏈的斷裂，L是個(gè)常量。T為雙螺旋的盤繞數(shù)（twistingnumber），W為超螺旋數(shù)（writhingnumber），它們是變量。

2．3DNA的復(fù)制

2.3.1DNA的半保存復(fù)制機(jī)理

2.3.2復(fù)制的起點(diǎn)、方向和速度

2.3.3復(fù)制的幾種主要方式

一、DNA的復(fù)制

1、DNA的半保存復(fù)制

每個(gè)子代分子的一條鏈來自親代DNA，另一條鏈則是新合成的，所以這種復(fù)制方式被稱為DNA的半保存復(fù)制（semiconservativereplication）。DNA的這種半保存復(fù)制保證了DNA在代謝上的穩(wěn)定性。

2、復(fù)制的起點(diǎn)與方向

一般把生物體的復(fù)制單位稱為復(fù)制子（replicon）。一個(gè)復(fù)制子只含一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)。

多復(fù)制子：DNA復(fù)制時(shí)，原核生物一般只有一個(gè)起始位點(diǎn)，而真核生物則有多個(gè)起始位點(diǎn)，因而在復(fù)制時(shí)浮現(xiàn)多復(fù)制泡，也稱為多復(fù)制子。

DNA的復(fù)制主要是從固定的起始點(diǎn)以雙向等速復(fù)制方式進(jìn)行的（圖2-18）。復(fù)制叉以DNA分子上某一特定順序?yàn)槠瘘c(diǎn)，向兩個(gè)方向等速生長前進(jìn)。

拓?fù)洚悩?gòu)酶I

拓?fù)洚悩?gòu)酶I解開負(fù)超螺旋，并與解鏈酶共同作用，在復(fù)制起點(diǎn)處解開雙鏈。參與解鏈的除一組解鏈酶外，還有Dna蛋白等。

DNA解鏈酶（DNAhelicase）

DNA解鏈酶能通過水解ATP獲得能量來解開雙鏈DNA。

單鏈結(jié)合蛋白（SSB蛋白）

SSB蛋白的作用是保證被解鏈酶解開的單鏈在復(fù)制完成前能保持單鏈結(jié)構(gòu)，它以四聚體形式存在于復(fù)制叉處，待單鏈復(fù)制后才掉下，重新循環(huán)。所以，SSB蛋白只保持單鏈的存在，并不能起解鏈的作用。

3、DNA的半不連續(xù)復(fù)制與岡崎片段

DNA復(fù)制時(shí)，短時(shí)間內(nèi)合成的約1000個(gè)核苷酸左右的小片段，稱之為岡崎片段(Okazakifragment)

DNA復(fù)制過程中至少有一條鏈?zhǔn)紫群铣奢^短的片段，然后再由連接酶連成大分子DNA?，F(xiàn)在已知一般原核生物的岡崎片段要長些，真核生物中的要短些。進(jìn)一步研究還證明，這種前導(dǎo)鏈的連續(xù)復(fù)制和滯后鏈的不連續(xù)復(fù)制在生物界是有普遍性的，因而稱之為雙螺旋的半不連續(xù)復(fù)制。

DNA鏈的延伸：

DNA復(fù)制體(replisome)：在復(fù)制叉附近，形成了以兩套DNA聚合酶Ⅲ全酶分子、引發(fā)體和解鏈酶構(gòu)成的類似核糖體大小的復(fù)合體，稱為DNA復(fù)制體。

4、滯后鏈的引發(fā)

DNA復(fù)制時(shí)，往往先由RNA聚合酶在DNA模板上合成一段RNA引物，再由DNA聚合酶從RNA引物3'端開始合成新的DNA鏈。滯后鏈的引發(fā)過程往往由引發(fā)體（primosome）來完成。引發(fā)體由6種蛋白質(zhì)n、n'、n''、DnaB、C和I共同組成，只有當(dāng)引發(fā)前體（preprimosome）把這6種蛋白質(zhì)合在一起并與引發(fā)酶（primase）進(jìn)一步組裝后形成引發(fā)體，才能發(fā)揮其功能。

5、鏈的終止

當(dāng)復(fù)制叉前移，遇到20bp重復(fù)性終止子序列（Ter）時(shí)，Ter-Tus復(fù)合物能阻擋復(fù)制叉的繼續(xù)前移，等到相反方向的復(fù)制叉到達(dá)后在DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶IV的作用下使復(fù)制叉解體，釋放子鏈DNA。

6、復(fù)制的幾種方式

(1)環(huán)狀DNA雙鏈的復(fù)制

環(huán)狀雙鏈DNA的復(fù)制可分為θ型、滾環(huán)型和D-環(huán)型幾種類型。

(a)θ型

模板鏈(templatestrand)=反義鏈

不對(duì)稱轉(zhuǎn)錄(asymmetrictranscription)：轉(zhuǎn)錄僅發(fā)生在DNA的一條鏈上。

啟動(dòng)子(promoter)：是DNA轉(zhuǎn)錄起始信號(hào)的一段序列，它能指導(dǎo)全酶與模板正確的結(jié)合，并活化酶使之具有起始特異性轉(zhuǎn)錄形式。

終止子(terminator)：轉(zhuǎn)錄終止的信號(hào)，其作用是在DNA模板特異位置處終止RNA的合成。

轉(zhuǎn)錄單位：DNA鏈上從啟動(dòng)子直到終止子為止的長度稱為一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位。

3.1RNA的轉(zhuǎn)錄

轉(zhuǎn)錄的基本過程都包括：模板識(shí)別、轉(zhuǎn)錄起始、通過啟動(dòng)子及轉(zhuǎn)錄的延伸和終止。

1、模板識(shí)別階段主要指RNA聚合酶與啟動(dòng)子DNA雙鏈相互作用并與之相結(jié)合的過程。轉(zhuǎn)錄起始前，啟動(dòng)子附近的DNA雙鏈分開形成轉(zhuǎn)錄泡以促使底物核糖核苷酸與模板DNA的堿基配對(duì)。

2、轉(zhuǎn)錄起始就是RNA鏈上第一個(gè)核苷酸鍵的產(chǎn)生。

3、轉(zhuǎn)錄起始后直到形成9個(gè)核苷酸短鏈?zhǔn)峭ㄟ^啟動(dòng)子階段，通過啟動(dòng)子的時(shí)間越短，該基因轉(zhuǎn)錄起始的頻率也越高。

4、RNA聚合酶離開啟動(dòng)子，沿DNA鏈移動(dòng)并使新生RNA鏈不斷伸長的過程就是轉(zhuǎn)錄的延伸。

5、當(dāng)RNA鏈延伸到轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)時(shí)，RNA聚合酶不再形成新的磷酸二酯鍵，RNA-DNA雜合物分開，這就是轉(zhuǎn)錄的終止。

3.1.1轉(zhuǎn)錄的基本過程

RNA合成的基本特點(diǎn)：

1.底物是：ATP、GTP、CTP、UTP

2.在聚合酶作用下形成磷酸酯鍵

3.RNA的堿基順序由DNA的順序決定

4.僅以一條DNA鏈作為模板

5.合成方向?yàn)?’→3’

6.合成中不需要引物

3.1.2轉(zhuǎn)錄機(jī)器的主要成分

原核生物RNA聚合酶：

亞基基因相對(duì)分子量亞基數(shù)組分功能

αrpoA3.65×1042核心酶核心酶組裝，啟動(dòng)子識(shí)別

βrpoB1.51×1051核心酶β和β’共同形成RNA合成的活性中心

β’rpoC1.55×1051核心酶

？11×1041核心酶未知

σrpoD7.0×1041σ因子存在多種σ因子，用于識(shí)別不同的啟動(dòng)子

1、RNA聚合酶

大多數(shù)原核生物RNA聚合酶的組成是一致的，大腸桿菌RNA聚合酶由2個(gè)α亞基、一個(gè)β亞基、一個(gè)β’亞基和一個(gè)ω亞基組成，稱為核心酶。加上一個(gè)σ亞基后則成為聚合酶全酶（holoenzyme），相對(duì)分子質(zhì)量為4.65×105。研究發(fā)現(xiàn)，由β和β’亞基組成了聚合酶的催化中心，它們在序列上與真核生物RNA聚合酶的兩個(gè)大亞基有同源性。β亞基能與模板DNA、新生RNA鏈及核苷酸底物相結(jié)合。

σ因子可以極大地提高RNA聚合酶對(duì)啟動(dòng)子區(qū)DNA序列的親和力，參與σ因子以后，RNA聚合酶全酶識(shí)別啟動(dòng)子序列的特異性總共提高了107倍。

σ因子的作用是負(fù)責(zé)模板鏈的選擇和轉(zhuǎn)錄的起始，

轉(zhuǎn)錄的起始從化學(xué)過程來看是單個(gè)核苷酸與開鏈啟動(dòng)子-酶復(fù)合物相結(jié)合構(gòu)成新生RNA的5’端，再以磷酸二酯鍵的形式與其次個(gè)核苷酸相結(jié)合，起始的終止反映在σ因子的釋放。過去認(rèn)為二核苷酸的形成就是轉(zhuǎn)錄起始的終止，實(shí)際上，只有當(dāng)新生RNA鏈達(dá)到6-9個(gè)核苷酸時(shí)才能形成穩(wěn)定的酶-DNA-RNA三元復(fù)合物，才釋放σ因子，轉(zhuǎn)錄進(jìn)入延伸期。

真核生物RNA聚合酶

真核生物中共有3類RNA聚合酶。真核生物RNA聚合酶一般有8-14個(gè)亞基所組成，相對(duì)分子質(zhì)量超過5×105。

除了細(xì)胞核中的RNA聚合酶之外，真核生物線粒體和葉綠體中還存在著不同的RNA聚合酶。線粒體RNA聚合酶只有一條多肽鏈，相對(duì)分子質(zhì)量小于7×104，是已知最小的RNA聚合酶之一，與T7噬菌體RNA聚合酶有同源性。葉綠體RNA聚合酶比較大，結(jié)構(gòu)上與細(xì)菌中的聚合酶相像，由多個(gè)亞基組成，部分亞基由葉綠體基因組編碼。線粒體和葉綠體RNA聚合酶活性不受α-鵝膏覃堿所抑制。

常用的轉(zhuǎn)錄抑制劑及其作用：

抑制劑靶酶抑制作用

利福霉素細(xì)菌的全酶與β亞基結(jié)合，阻止起始

鏈霉溶菌素細(xì)菌的核心酶與β亞基結(jié)合，阻止延長

放線菌素D真核RNA聚合酶Ⅰ與DNA結(jié)合，并阻止延長

α-鵝膏蕈堿真核RNA聚合酶Ⅱ與RNA聚合酶Ⅱ結(jié)合

起始復(fù)合物的形成

轉(zhuǎn)錄可被分為4個(gè)階段，即啟動(dòng)子的選擇、轉(zhuǎn)錄起始、RNA鏈的延伸和終止。

原核生物中：啟動(dòng)子選擇階段包括RNA聚合酶全酶對(duì)啟動(dòng)子的識(shí)別，聚合酶與啟動(dòng)子可逆性結(jié)合形成封閉復(fù)合物（closedcomplex）。

真核生物RNA聚合酶Ⅱ所形成的轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物：除了RNA聚合酶之外，真核生物轉(zhuǎn)錄起始過程中至少還需要7種輔助因子參與

一般狀況下，該復(fù)合物可以進(jìn)入兩條不同的反應(yīng)途徑，

一是合成并釋放2-9個(gè)核苷酸的短RNA轉(zhuǎn)錄物，即所謂的流產(chǎn)式起始；

二是盡快釋放σ亞基，轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物通過上游啟動(dòng)子區(qū)并生成由核心酶、DNA和新生RNA所組成的轉(zhuǎn)錄延伸復(fù)合物。

RNA聚合酶的核心酶雖可合成RNA，但不能找到模板DNA上的起始位點(diǎn)。

只有帶б因子的全酶才能專一地與DNA上的啟動(dòng)子結(jié)合，選擇其中一條鏈作為模板，合成均一的產(chǎn)物。б因子的作用只是起始而已，一旦轉(zhuǎn)錄開始，它就脫離了起始復(fù)合物，而由核心酶負(fù)責(zé)RNA鏈的延伸。因此，聚合酶全酶的作用是啟動(dòng)子的選擇和轉(zhuǎn)錄的起始，而核心酶的作用是鏈的延伸。

真核生物RNAPolII的轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物

真核生物轉(zhuǎn)錄起始除RNA聚合酶外，至少還需要7種輔助因子參與，如TBP，TFIIA，TFIIB，TFIID，TFIIE，TFIIF和TFIIH。

3.2啟動(dòng)子與轉(zhuǎn)錄起始

2、啟動(dòng)子與轉(zhuǎn)錄起始

啟動(dòng)子是一段位于結(jié)構(gòu)基因5’端上游區(qū)的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之與范本DNA確鑿地相結(jié)合并具有轉(zhuǎn)錄起始的特異性。

轉(zhuǎn)錄的起始是基因表達(dá)的關(guān)鍵階段，而這一階段的重要問題是RNA聚合酶與啟動(dòng)子的相互作用。

3.2.1啟動(dòng)子區(qū)的基本結(jié)構(gòu)

轉(zhuǎn)錄單元(transcriptionunit)：是一段從啟動(dòng)子開始至終止子終止的DNA序列，RNA聚合酶從轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)開始沿著模板前進(jìn)，直到終止子為止，轉(zhuǎn)錄出一條RNA鏈。

轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)是指與新生RNA鏈第一個(gè)核苷酸相對(duì)應(yīng)DNA鏈上的堿基，研究證明尋常為一個(gè)嘌呤。

常把起點(diǎn)前面，即5’末端的序列稱為上游(upstream)，而把其后面即3’末端的序列稱為下

游(downstream)。

在啟動(dòng)子區(qū)內(nèi)有一個(gè)由5個(gè)核苷酸組成的共同序列，是RNA聚合酶的緊湊結(jié)合點(diǎn)，現(xiàn)在稱為Pribnow區(qū)(Pribnowbox)，這個(gè)區(qū)的中央大約位于起點(diǎn)上游10bp處，所以又稱為-10區(qū)。

絕大部分啟動(dòng)子都存在位于-10bp處的TATA區(qū)和-35bp處的TTGACA區(qū)。這兩段共同序列是RNA聚合酶與啟動(dòng)子的結(jié)合位點(diǎn)，能與σ因子相互識(shí)別而具有很高的親和力。

Pribnow區(qū)（Pribnowbox）這個(gè)區(qū)的中央大約位于起點(diǎn)上游10bp處，所以又稱為–10區(qū)。

TTGACA。這個(gè)區(qū)的中央大約位于起點(diǎn)上游35bp處，所以又稱為–35區(qū)。

–10位的TATA區(qū)和–35位的TTGACA區(qū)是RNA聚合酶與啟動(dòng)子的結(jié)合位點(diǎn)，能與σ因子相互識(shí)別而具有很高的親和力。

在真核生物基因中，Hogness等先在珠蛋白基因中發(fā)現(xiàn)了類似Pribnow區(qū)的Hogness區(qū)（Hognessbox），這是位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游–25～–30bp處的共同序列TATAAA，也稱為TATA區(qū)（圖3-7）。

另外，在起始位點(diǎn)上游–70～–78bp處還有另一段共同序列CCAAT，這是與原核生物中–35bp區(qū)相對(duì)應(yīng)的序列，稱為CAAT區(qū)（CAATbox）。

在–70～–80區(qū)含有CCAAT序列（CAATbox），在–80～–110含有GCCACACCC或GGGCGGG序列（GCbox）。

3.2.2啟動(dòng)子區(qū)的識(shí)別

氫鍵互補(bǔ)學(xué)說：RNA聚合酶并不直接識(shí)別堿基對(duì)本身，而是通過氫鍵互補(bǔ)的方式加以識(shí)別。

這種氫鍵互補(bǔ)學(xué)說較為圓滿地解釋了啟動(dòng)子功能既受DNA序列影響，又受其構(gòu)象影響這一事實(shí)。

3.2.3酶與啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合

在RNA聚合酶與啟動(dòng)子相互作用的過程中，聚合酶首先與啟動(dòng)子區(qū)閉合雙鏈DNA相結(jié)合，形成二元閉合復(fù)合物，然后經(jīng)過解鏈得到二元開鏈復(fù)合物。

DNA開鏈?zhǔn)且勒誅NA模板序列正確引入核苷酸底物的必要條件。

RNA聚合酶既是雙鏈DNA結(jié)合蛋白，又是單鏈DNA結(jié)合蛋白。

3.2.4-10區(qū)和-35區(qū)的最正確間距

在原核生物中，-35區(qū)與-10區(qū)之間的距離大約是16~19bp，小于15bp或大于20bp都會(huì)降低

1.DNA的體外切割和連接

重組DNA試驗(yàn)中常見的主要工具酶

酶類功能

限制性核酸內(nèi)切酶

識(shí)別并在特定位點(diǎn)切開DNA

DNA連接酶

通過磷酸二酯鍵把兩個(gè)或多個(gè)DNA片段連接成一個(gè)DNA分子

DNA聚合酶I（大腸桿菌）

按5'到3'方向參與新的核苷酸，補(bǔ)平DNA雙鏈中的缺口

反轉(zhuǎn)錄酶

依照RNA分子中的堿基序列，根據(jù)堿基互補(bǔ)原則合成DNA鏈

多核苷酸激酶

把磷酸基團(tuán)加到多聚核苷酸鏈的5'-OH末端（進(jìn)行末端標(biāo)記試驗(yàn)或用來進(jìn)行DNA的連接

末端轉(zhuǎn)移酶

在雙鏈核酸的3'末端加上多聚單核苷酸

DNA外切酶III

從DNA鏈的3'末端逐個(gè)切除單核苷酸

λ噬菌體DNA外切酶

從DNA鏈的5'末端逐個(gè)切除單核苷酸

堿性磷酸酯酶

切除位于DNA鏈5'或3'末端的磷酸基團(tuán)

2.DNA的核苷酸序列分析技術(shù)

DNA核苷酸序列分析法是在核酸的酶學(xué)和生物化學(xué)的基礎(chǔ)上創(chuàng)立并發(fā)站起來的一門重要的DNA技術(shù)學(xué)，這門技術(shù)，對(duì)于從分子水平上研究基因的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，以及克隆DNA片斷的操作方面，都有著十分廣泛的使用價(jià)值。

重組DNA試驗(yàn)中常見的主要工具酶

分子生物學(xué)研究的核心技術(shù)

基因操作（genemanipulation）：

DNA分子的切割與連接、核酸分子雜交、凝膠電泳、細(xì)胞轉(zhuǎn)化、核酸序列分析以及基因的人工合成、定點(diǎn)突變和PCR擴(kuò)增等。

基因工程（geneengineering）：

是指在體外將核酸分子接入病毒、質(zhì)?；蚱渌d體分子，構(gòu)成遺傳物質(zhì)的新組合，并使之參入到原先沒有這類分子的寄主細(xì)胞內(nèi)而能持續(xù)的繁殖。

5.2DNA操作技術(shù)

5.2.1核酸的凝膠電泳

v電泳的基本原理：

一種帶電粒子在電場中，會(huì)以一定的速度移向與它自身帶相反電荷的電極。我們把這種電泳分子在電場作用下的遷移速度，叫做電泳的遷移率，它與電場強(qiáng)度和電泳分子本身所攜帶的凈電荷數(shù)成正比。

v核酸的凝膠電泳：

糖-磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì)，一致數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈負(fù)電荷，因此它們能以同樣的速度向正電極方向遷移。在一定的電場強(qiáng)度下，DNA分子的這種遷移速度，亦即電泳的遷移率，取決于核酸分子本身的大小和構(gòu)型。

v影響遷移率的四大因素:

一、分子物理性質(zhì)：

分子大?。捍蟮倪w移快

電荷多少：電荷密度大的遷移快

構(gòu)形：閉環(huán)(CCC)>單鏈開環(huán)(OC)>線性(L)

二、支持介質(zhì)：

在電泳中常用無反應(yīng)活性的穩(wěn)定的支持介質(zhì)，如瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠等，其分子的遷移率與分子的摩擦系數(shù)成反比。其中，摩擦系數(shù)與凝膠密度相關(guān)。

三、電場強(qiáng)度：

電泳場兩極間單位支持物長度的電壓降即為電場強(qiáng)度或電壓梯度。在低電壓時(shí)，線狀DNA片段的遷移率與所用電壓成正比。但當(dāng)電壓增高時(shí)，大分子量DNA片段遷移率的增大是不同的，因此瓊脂糖凝膠的有效分開范圍隨電壓增大而減小。電場強(qiáng)度愈大，帶電顆粒的泳動(dòng)速度愈快。

四、緩沖液離子強(qiáng)度：

緩沖液是電泳場中的導(dǎo)體，它的種類、pH值、離子濃度直接影響電泳的效率。常用的緩沖體系有Tris-醋酸（TAE）、Tris-硼酸（TBE）、Tris-磷酸（TPE）三種。以TAE最為常用，價(jià)格低且其緩沖能力低，需經(jīng)常更新

脈沖電場凝膠電泳（pulsed-fieldgelelectrophoresis，簡稱PFGE）:

用于分開超大分子量（有時(shí)甚至是整條染色體）DNA。

在標(biāo)準(zhǔn)的PFGE中，第一個(gè)脈沖的電場方向與核酸移動(dòng)方向成45°夾角，而其次個(gè)脈沖的電場方向與核酸移動(dòng)方向在另一側(cè)成45°夾角。

應(yīng)用脈沖電場凝膠電泳技術(shù)，可成功地分開到分子量高達(dá)107bp的DNA大分子。

核酸電泳的指示劑:

電泳過程中，常使用一種有顏色的標(biāo)記物以指示樣品的遷移過程。核酸電泳常用的指示劑有兩種：溴酚藍(lán)呈藍(lán)紫色，二甲苯青呈藍(lán)色。

溴酚藍(lán)的分子量為670Da，在不同濃度凝膠中，遷移速度基本一致，它的分子篩效應(yīng)小，近似于自由電泳，故被普遍用作指示劑。二甲苯青的分子量為554.6Da，攜帶的電荷量比溴酚藍(lán)少，在凝膠電泳中，遷移率比溴酚藍(lán)慢。

核酸電泳的染色劑:

溴化乙錠（EB）是一種具扁平分子的核酸染料，能插入到DNA或RNA分子的相鄰堿基之間，并在300nm波長的紫外光照射下發(fā)出熒光。

溴化乙錠不能與瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠相結(jié)合。

在適當(dāng)?shù)娜旧珬l件下（0.5ug/ml），熒光強(qiáng)度與DNA片段的大小（或數(shù)量）成正比。

5.2.2核酸的分子雜交

定義：

核酸雜交（Nucleicacidhybridization）：是指具有一定同源性的兩條單鏈核酸在一定條件下，按堿基互補(bǔ)的原則重新配對(duì)形成雙鏈的過程。

原理：

DNA的變性和復(fù)性

在一定的條件（如適當(dāng)?shù)臏囟?、有機(jī)溶劑存在等）下，DNA的雙鏈可解開成為單鏈，這一過程稱為DNA的變性（Denaturation）。高溫、低鹽和有機(jī)溶劑促進(jìn)DNA變性。

DNA的雜交即復(fù)性（Renaturation）是變性的單鏈DNA在一定的條件下（低于Tm的溫度下）與其互補(bǔ)序列退火形成雙鏈的過程，因此雜交與Tm值相關(guān)。

影響雜交的主要因素：

溫度：一般在低于Tm約15至25度的溫度下雜交速率最快。

鹽濃度：鈉離子增加雜交分子的穩(wěn)定性，降低鈉離子濃度猛烈地影響Tm值和復(fù)性速率。但當(dāng)鈉離子濃度超過0.4M時(shí)，對(duì)復(fù)性速度和Tm值影響不大。

甲酰胺：有機(jī)溶劑如甲酰胺能減少雙鏈核酸的穩(wěn)定性。每增加1%的甲酰胺，DNA/DNA或DNA/RNA雙鏈的Tm值減少0.72℃。常用50%甲酰胺。

硫酸葡聚糖：使雜交速率增加，但有時(shí)可能增加雜交本底。

核酸探針的類型

1克隆的DNA片段，常用cDNA探針。

2RNA探針（Riboprobe）

RNA探針的優(yōu)點(diǎn)是特異性高；雜交效率(靈敏度)更高。適合于Northen雜交、原位雜交等。主要缺點(diǎn)是不穩(wěn)定，易被降解，另外其制備較困難。

3寡核苷酸探針

可用化學(xué)方法人工合成，制備較便利，但靈敏度稍差。

4聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物

是很好的探針來源，其優(yōu)點(diǎn)是制備和標(biāo)記相對(duì)簡單。

核酸標(biāo)記的類型：

放射性同位素：32P,35S,33P

目前應(yīng)用最廣，優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高，特別適用于單拷貝基因或低豐度mRNA檢測，缺點(diǎn)是易造成放射性污染以及半衰期短，使用不便。

非同位素標(biāo)記：

常用地高辛或生物素系統(tǒng)。

優(yōu)點(diǎn)：無放射性污染，較穩(wěn)定；缺點(diǎn)：靈敏度、特異性稍差。

常用核酸雜交技術(shù)

濾膜雜交

固相雜交

原位雜交

核酸雜交

液相雜交

濾膜雜交：是指先將待檢測的核酸序列結(jié)合到適當(dāng)?shù)墓滔嘀С治锶缒猃埬ど?，然后與存在于溶液中的已標(biāo)記探針進(jìn)行雜交的過程。

濾膜雜交的基本過程

啟動(dòng)子的活性。

在細(xì)菌中常見兩種啟動(dòng)子突變，一種叫下降突變(downmutation)，假使把Pribnow區(qū)從TATAAT變成AATAAT就會(huì)大大降低其結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄水平；另一類突變叫上升突變(upmutation)，即增加Pribnow區(qū)共同序列的同一性。

3.2.5加強(qiáng)子及其功能

能加強(qiáng)轉(zhuǎn)錄起始的序列為加強(qiáng)子或加強(qiáng)子(enhancer)。

加強(qiáng)子很可能通過影響染色質(zhì)DNA-蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)或改變超螺旋的密度而改變模板的整體結(jié)構(gòu)，從而使得RNA聚合酶更簡單與范本DNA相結(jié)合，起始基因轉(zhuǎn)錄。

加強(qiáng)子與啟動(dòng)子的區(qū)別：

1.加強(qiáng)子對(duì)于啟動(dòng)子的位置不固定，而能有很大的變動(dòng)；

2.它能在兩個(gè)方向產(chǎn)生作用。一個(gè)加強(qiáng)子并不限于促進(jìn)某一特別啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄，它能刺激在它附近的任一啟動(dòng)子。

3.2.6真核生物啟動(dòng)子對(duì)轉(zhuǎn)錄的影響

習(xí)慣上，將TATA區(qū)上游的保守序列稱為上游啟動(dòng)子元件(upstreampromoterelement，UPE)或稱上游激活序列(upstreamactivatingsequence，UAS)。

在真核生物基因中，Hogness等先在珠蛋白基因中發(fā)現(xiàn)了類似Pribnow區(qū)的Hogness區(qū)（Hognessbox），這是位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游–25～–30bp處的共同序列TATAAA，也稱為TATA區(qū)。

另外，在起始位點(diǎn)上游–70～–78bp處還有另一段共同序列CCAAT，這是與原核生物中–35bp區(qū)相對(duì)應(yīng)的序列，稱為CAAT區(qū)（CAATbox）。

在–70～–80區(qū)含有CCAAT序列（CAATbox），在–80～–110含有GCCACACCC或GGGCGGG序列（GCbox）。TATA區(qū)的主要作用是使轉(zhuǎn)錄確切地起始；

CAAT區(qū)和GC區(qū)主要控制轉(zhuǎn)錄起始頻率，基本不參與起始位點(diǎn)的確定。

轉(zhuǎn)錄實(shí)際上是RNA聚合酶、轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子和啟動(dòng)子區(qū)各種調(diào)控元件相互作用的結(jié)果。轉(zhuǎn)錄的終止

RNA聚合酶起始基因轉(zhuǎn)錄后，它就會(huì)沿著范本5’→3’方向不停地移動(dòng)，合成RNA鏈，直到碰上終止信號(hào)時(shí)才與模板DNA相脫離并釋放新生RNA鏈。終止發(fā)生時(shí)，所有參與形

成RNA-DNA雜合體的氫鍵都必需被破壞，范本DNA鏈才能與有意義鏈重新組合成DNA雙鏈。

3.4終止和抗終止

不依靠于ρ因子的終止

終止位點(diǎn)上游一般存在一個(gè)富含GC堿基的二重對(duì)稱區(qū)，由這段DNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的RNA簡單形成發(fā)卡式結(jié)構(gòu)。在終止位點(diǎn)前面有一段由4-8個(gè)A組成的序列，所以轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的3’端為寡聚U，這種結(jié)構(gòu)特征的存在決定了轉(zhuǎn)錄的終止。終止效率與二重對(duì)稱序列和寡聚U的長短有關(guān)，隨著發(fā)卡式結(jié)構(gòu)（至少6bp）和寡聚U序列（至少4個(gè)U）長度的增加，終止效率逐步提高。

依靠于ρ因子的終止

ρ因子是一個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量為2.0×105的六聚體蛋白，它能水解各種核苷酸三磷酸，實(shí)際上是一種NTP酶，它通過催化NTP的水解促使新生RNA鏈從三元轉(zhuǎn)錄復(fù)合物中解離出來，從而終止轉(zhuǎn)錄。

3.4.3抗終止

抗轉(zhuǎn)錄終止主要有兩種方式：

1.破壞終止位點(diǎn)RNA的莖—環(huán)結(jié)構(gòu)

2.依靠于蛋白質(zhì)因子的轉(zhuǎn)錄抗終止

3.3原核生物與真核生物mRNA的特征比較

原核生物mRNA的特征

mRNA在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)占總RNA的2%左右（tRNA占16%，而rRNA則占80%以上）。原核生物中，mRNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯不僅發(fā)生在同一個(gè)細(xì)胞空間里，而且這兩個(gè)過程幾乎是同步進(jìn)行的，蛋白質(zhì)合成往往在mRNA剛開始轉(zhuǎn)錄時(shí)就被引發(fā)了。一個(gè)原核細(xì)胞的mRNA（包括病毒）有時(shí)可以編碼幾個(gè)多肽。

3.3.1原核生物mRNA的特征

1.原核生物mRNA的半衰期短

2.大量原核生物mRNA以多順反子的形式存在

3.原核生物mRNA的5’端無帽子結(jié)構(gòu)，3’端沒有或只有較短的poly(A)結(jié)構(gòu)

4.原核生物起始密碼子AUG上游7-12個(gè)核苷酸處有一被稱為SD序列（Shine–Dalgarnosequence）的保守區(qū)，由于該序列與16S-rRNA3’端反向互補(bǔ)，所以被認(rèn)為在核糖體-mRNA的結(jié)合過程中起作用。

只編碼一個(gè)蛋白質(zhì)的mRNA稱為單順反子mRNA（monocistronicmRNA），

把編碼多個(gè)蛋白質(zhì)的mRNA稱為多順反子mRNA（polycistronicmRNA）。

多順反子mRNA是一組相鄰或相互重迭基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，這樣的一組基因可被稱為一個(gè)操縱子（operon），是生物體內(nèi)的重要遺傳單位。如大腸桿菌乳糖操縱子轉(zhuǎn)錄成編碼3條多肽的多順反子mRNA，經(jīng)過翻譯生成β半乳糖苷酶、透過酶及乙?；D(zhuǎn)移酶。

真核生物mRNA的特征

前體RNA成熟mRNA

“基因〞的分子生物學(xué)定義是：產(chǎn)生一條多肽鏈或功能RNA所必需的全部核苷酸序列！

3.3.2真核生物mRNA的特征

1.真核生物mRNA的5’端存在“帽子〞結(jié)構(gòu)：pppApNpNp。

2.絕大多數(shù)真核生物mRNA具有多聚(A)尾巴。

帽子結(jié)構(gòu)

帽子被扣在了mRNA的5’端，并可能在幾個(gè)位置發(fā)生甲基化。

mRNA5′端加“G〞的反應(yīng)是由鳥苷酸轉(zhuǎn)移酶完成的。

帽子甲基化作用

帽子0：出現(xiàn)在所有真核生物中。

尿苷酸一7一甲基轉(zhuǎn)移酶在G的7N位甲基化

帽子1：除單細(xì)胞生物以外所有其他真核生物中都有的最主要的帽子。

2’一甲基一轉(zhuǎn)移酶

第2個(gè)堿基的2’－OH位置上（實(shí)際上在任何修飾反應(yīng)進(jìn)行前，它是轉(zhuǎn)錄物中原來的第1個(gè)堿基）

帽子2：甲基基團(tuán)可以添加到戴帽mRNA的第3堿基上。這個(gè)反應(yīng)的底物是已經(jīng)具有兩個(gè)甲基基團(tuán)的帽子mRNA。

2’一甲基一轉(zhuǎn)移酶催化2’－OH位置上甲基化

這種帽子尋常低于戴帽群體總量的10－15％。

二、mRNA的轉(zhuǎn)錄后修飾－帽子

1、帽子的種類

帽子0（Cap-0）m7GpppXpYp（共有）

帽子1（Cap-1）m7GpppXmpYp第一個(gè)核苷酸的2’-O位上產(chǎn)生甲基化（AN6位甲基化）

帽子2（Cap-2）m7GpppXmpYm其次個(gè)核苷酸的2’-O位上產(chǎn)生甲基化（A、G、C、U）

其中:

☆單細(xì)胞真核生物只有Cap—0

☆Cap—1是其余真核生物的主要帽子形式

☆Cap—2存在于某些真核生物中

2、帽子結(jié)構(gòu)的生成

☆甲基供體都為S—腺苷甲硫氨酸（SAM）

☆RNA鳥苷酸轉(zhuǎn)移酶戴帽酶（cappingenzyme）

3、帽子結(jié)構(gòu)的功能

（1）對(duì)翻譯起識(shí)別作用為核糖體識(shí)別RNA提供信號(hào)Cap—0的全部都是識(shí)別的重要信號(hào)Cap—1,2的甲基化能增進(jìn)識(shí)別

（2）增加mRNA的穩(wěn)定性，使5’端免遭外切核酸酶的攻擊

（3）與某些RNA病毒的正鏈合成有關(guān)（Cap—1、Cap—2）

除帽子結(jié)構(gòu)外的Euk.mRNA內(nèi)部甲基化－－－m6A形式

PolyA尾巴

3、poly(A)的功能

（1）可能與核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)

（2）與mRNA的壽命有關(guān)

（3）與翻譯有關(guān)

a、缺失可抑制體外翻譯的起始

b、胚胎發(fā)育中，poly(A)對(duì)其mRNA的翻譯有影

響（非poly(A)化的為保存形式）

c、對(duì)含poly(A)的mRNA失去poly(A)可減弱其翻譯

（4）poly(A)在分子生物學(xué)試驗(yàn)中有很大應(yīng)用價(jià)值

a、也可將oligo(dT)與載體相連，從總體RNA中分開

純化mRNA

b、用寡聚dT（oligo(dT)）為引物，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA

若干基本概念

基因表達(dá)的第一步

以D.S.DNA中的一條單鏈作為轉(zhuǎn)錄的模板

在依靠DNA的RNA聚合酶的作用下

按A＝U，C＝G配對(duì)的原則，合成RNA分子

模板單鏈DNA的極性方向?yàn)?’→5’,而非模板單鏈

DNA的極性方向與RNA鏈一致，均為5’→3’.

模板單鏈DNA的極性方向?yàn)?’→5’,而非模板單鏈

DNA的極性方向與RNA鏈一致，均為5’→3’.

3.5內(nèi)含子的剪接、編輯及化學(xué)修飾

一、概述

割裂基因（splitgene）：指編碼某一RNA的基因中有些序列并不出現(xiàn)在成熟的RNA序列中，成熟RNA的序列在基因中被其他的序列隔開

內(nèi)含子（intron）：原初轉(zhuǎn)錄物中通過RNA拼接反應(yīng)而被去除的RNA序列或基因中與這些RNA序列相應(yīng)的DNA序列

外顯子（excon）：

RNA拼接（RNAsplicing）：一個(gè)基因的外顯子和內(nèi)含子共同轉(zhuǎn)錄在一條轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中，將內(nèi)含子去除而把外顯子連接起來形成成熟RNA分子的過程

拼接點(diǎn)：5’拼接點(diǎn)或左拼接點(diǎn)（內(nèi)含子上游）

3’拼接點(diǎn)或右拼接點(diǎn)（??下游）

3.5.1RNA中的內(nèi)含子

真核生物mRNA前體的加工：

1.5’端形成特別的帽子結(jié)構(gòu)

2.在3’端切斷并加上一個(gè)poly(A)的尾巴

3.通過剪接除去轉(zhuǎn)錄來的IVS(非翻譯區(qū))

4.鏈內(nèi)部核酸的甲基化

內(nèi)含子的分類

中部核心結(jié)構(gòu)（centralcorestructure）:在有些內(nèi)含子中，含有4個(gè)重復(fù)的保守序列，長度為10~20bp，4個(gè)保守序列構(gòu)成一種二級(jí)結(jié)構(gòu)，在拼接中起重要作用

由于并非所有的內(nèi)含子都有中部核心結(jié)構(gòu)，所以有了內(nèi)含子的分類

Ⅰ類（groupⅠ）:含有中部核心結(jié)構(gòu)的細(xì)胞器基因核基因

Ⅱ類（groupⅡ）:不含有中部核心結(jié)構(gòu)細(xì)胞器線粒體基因內(nèi)核基因

Ⅲ類（groupⅢ）:具有GU－AG特征的邊界序列核基因mRNA前體

RNA基因的內(nèi)元均位于tRNA的反密碼環(huán)上

3、拼接方式

方式一：由拼接裝置完成（核mRNA內(nèi)含子）可供識(shí)別的特異序列拼接裝置由多種蛋白質(zhì)和核蛋白組成

方式二：自我拼接（兩類內(nèi)含子Ⅰ、Ⅱ）形成特定的二級(jí)結(jié)構(gòu)RNA具有催化拼接的能力

方式三：需要蛋白質(zhì)酶參與的拼接（酵母tRNA）前兩種拼接都屬于轉(zhuǎn)酯反應(yīng)

3.5.2RNA的剪接

RNA的剪接實(shí)質(zhì)：就是要把斷裂基因的內(nèi)含子除去，連接外顯子。

剪切方式：mRNA前體的剪接；自我剪接；蛋白質(zhì)剪接(tRNA)。

剪接體(spliceosome)：各種參與剪接的成分形成的一個(gè)體系。

Ribozyme：有酶活性的RNA。

拼接機(jī)制（Splicingmehanism)

SnRNA(orScRNA)與拼接點(diǎn)序列間存在互補(bǔ)區(qū)域并參與剪接,形成拼接體(spliceosome)。

Spliceosome逐級(jí)組裝，SnRNA（U1、U2、U5和U4／U6）分步替代

U1通過5，拼接點(diǎn)互補(bǔ)而結(jié)合U2識(shí)別并結(jié)合分支點(diǎn)AU1和U2作用使內(nèi)元的5’端和3’端帶