槲皮素的提取及結(jié)構(gòu)鑒定

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自然藥物化學(xué)設(shè)計試驗

開題報告

題目：槲皮素提取及結(jié)構(gòu)鑒定

學(xué)生姓名：舒泉湧

學(xué)號：202304040125

院（系）：生命科學(xué)與工程學(xué)院

專業(yè)：制藥工程

指導(dǎo)教師：孔陽

一．1．1研究意義

我國北部、華南和西南地區(qū)等地區(qū)都產(chǎn)槐花，尤XX和XX省產(chǎn)量最為豐富?；被ㄖ泻胸S富的黃酮類化合物，其蘆丁(nltin)為黃酮中的主要成分，含量為8—20％；槲皮素(quercetin)為蘆丁的苷元。蘆丁和槲皮素具有抗炎作用、抗氧化作用、抗腫瘤作用、抗血小板聚集作用；對糖尿病的腎臟、胃腸粘膜、器官缺血損傷具有保護(hù)作用；同時還有抗惆悵、抗心胸肥大、降壓等作用。因此，對槐花中蘆丁和槲皮素的提取分開研究具有十分重要的研究意義。1．2研究現(xiàn)狀

1．2．1槐花性狀與產(chǎn)地簡介

槐花為豆科植物槐SophorajaponicaL.的枯燥花及花蕾；前者習(xí)稱為“槐花〞，后者習(xí)稱為槐米。落葉喬木，單數(shù)羽狀復(fù)葉互生，長達(dá)25cm，葉柄基部膨大，小葉7—15，卵狀長圓形或卵狀披針形，長2.55cm，先端尖，基部圓形或闊楔形，全緣,上面綠色，下面伏生白色短毛。小葉柄長2.5cm；托葉鐮刀狀，早落?；ò甓鄶?shù)散落，完整花呈飛鳥狀，花瓣5枚，黃色或淡棕色，皺縮，卷曲。雄蕊淡黃色，須狀，有時彎曲，子房膨大；質(zhì)輕，氣微，味微苦；花期為7—8月。主產(chǎn)于我國北部、華南及西南地區(qū)；XX省產(chǎn)量較豐富，XX主產(chǎn)于鎮(zhèn)江、蘇州、南京、徐州等地。

1．2．2槐花的化學(xué)成份及理化性質(zhì)1．2．2．1槐花中的化學(xué)成份

槐花中含赤豆皂甙（azukisaponin）Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ，大豆皂甙（soyasaponin）I、Ⅲ，槐花皂甙（kaikasaponin）Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。還含黃酮類：槲皮素（quercetin），蕓香甙（rutin），異鼠李素（isorhamnetin），異鼠李素-3-蕓香糖甙

（isorhamnetin-3-rutinoside），山奈酚-3-蕓香糖（kaempferol-3-rutinoside）。又含白樺脂醇（betulin），槐花二醇（sophoradiol）?；ㄓ椭泻鹿鹚幔╨auricacid），十二碳烯酸（dodecenoicacid），肉豆蔻酸（myristicacid），十四碳烯酸（tetradecenoicacid）十四碳二烯酸（teradecadienoicacid），棕櫚酸（palmiticacid），十六碳烯酸（hexadecenoicacid），硬脂酸（stearicacid），十八碳二烯酸（octadecadienoicacid），十作碳三烯酸（octadecatrienoic

acid），花生酸（arachidicacid）等脂肪酸和β-谷甾醇（β-sitosterol）。另含鞣質(zhì)。

1．2．2．2蘆丁和槲皮素的理化性質(zhì)

蘆丁(Rutin)又名蕓香苷，紫槲皮苷，維生素P，RmosideVi01aquercitrin，是槲皮素的3一O一蕓香糖昔，屬黃酮類物質(zhì)。分子式C27H30O16，分子量610.51,本品黃色或淡黃、綠色、極微弱的針狀結(jié)晶或粉末，無臭、無味或微帶原植物的特別氣味。在空氣中色漸變深，加熱到185℃一192℃即變?yōu)樽厣哪z狀體，約在215℃分解。難溶于冷水(1：8000)，略溶于熱水(1：200)和冷乙醇(1：600)，溶于熱甲醇(1：7)、冷甲醇(1：100)和熱乙醇(1：30)，難溶于乙酸乙酯、丙酮，不溶于苯、氯仿、乙醚、石油醚等；易溶于堿中呈黃色，酸化后復(fù)析出，也可溶于濃硫酸或濃鹽酸呈棕黃色，加水稀釋后復(fù)析出。含有3個結(jié)晶水的蘆丁熔點為174-178℃，無水蘆丁的熔點為188℃，本品能保持和恢復(fù)毛細(xì)血管的正常彈性，適用于輔助治療高血壓病及毛細(xì)血管出血性疾息。衛(wèi)生部新頒標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定蘆丁直接用著藥的標(biāo)準(zhǔn)為：C27H30O16不少于93％。

槲皮素(Quercetin)：又名櫟精，槲皮黃素，MeletinSophoretin。分子式C15Hl007，分子量302．23。黃色結(jié)晶(C15Hl0072H20)，mp-313—314℃(分解)，無水物mp316℃。溶于熱乙醇、冷乙醇、甲醇、乙酸乙酯、吡啶等；不溶于石油

醚、苯、乙醚和氯仿，幾乎不溶于水。1．2．3蘆丁和槲皮素的藥理作用1．2．3．1蘆丁的藥理作用

抗炎作用：蘆丁能顯著抑制大鼠刨傷性浮腫，并能阻止結(jié)膜炎、耳廓炎、肺水腫的發(fā)展；對兔由于芥子油引起的結(jié)膜水腫，有微弱的抑制作用?？寡趸饔茫宏愔疚涞热搜芯空f明，蘆丁可以抑制氧自由基對膜脂質(zhì)過氧化作用和可顯著提高大鼠血漿重超氧化物岐化酶(Superoxidedismufase，SOD)的活性。

對心血管系統(tǒng)的影響：蘆丁能夠降低毛細(xì)血管的異常通透性、脆性，可用于高血壓、腦溢血、出血等癥的治療和預(yù)防，能維持血管抗?fàn)幜?；對脂肪浸潤?/p>

肝有祛脂作用，與谷胱甘肽合用祛脂藥效更明顯。

其他作用：蘆丁對胃腸粘膜、器官缺血損傷具有保護(hù)作用，同時有鎮(zhèn)痛作用，對低密度脂蛋白質(zhì)氧化修飾抑制作用等。1．2．3．2槲皮素的藥理作用

抗腫瘤作用：槲皮素能顯著抑制促癌劑的作用，抑制離體惡性細(xì)胞的生長，抑制艾氏腹水癌細(xì)胞DNA/RNA和蛋白質(zhì)合成。構(gòu)效關(guān)系研究說明槲皮素B環(huán)上的鄰苯二酚結(jié)構(gòu)和2、3位的雙鍵對其抗增殖活性具有重要作用。康鐵邦等報導(dǎo)槲皮素可抑制白血病細(xì)胞中的PKC及TPK而產(chǎn)生抗癌作用。

抗血小板聚集作用：顧振綸等采用體外試驗觀測了槲皮素對血小板的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)槲皮素可顯著抑制二磷酸腺苷、膠原、鈣離子載體和花生四烯酸誘導(dǎo)的血小板聚集及血小板5一羥色胺的釋放反應(yīng)，并探討了有關(guān)作用機理。

抗氧化作用：謝海林等通過槲皮素的抗超陰離子作用的試驗研究，結(jié)果表明槲皮素的有抑制黃嘌呤氧化酶的活性而減少超氧陰離子的產(chǎn)生及其超氧陰離子的作用。

其他作用：槲皮素還對糖尿病的腎臟、腸粘膜具有保護(hù)作用；同時還有抗惆悵、抗心胸肥大、降壓等作用。1．2．4槐花總黃酮提取工藝的研究進(jìn)展

由于傳統(tǒng)的提取工藝水提法僅限于提取黃酮苷類物質(zhì)，在提取過程中主要

考慮加水量、浸泡時間、煎煮時間及煎煮次數(shù)等因素。此工藝提取效率低、成本高、工藝流程長、提取蘆丁的純度差、熾灼殘渣偏高，提取液中雜質(zhì)較多(如無機鹽、蛋白質(zhì)、糖等，給進(jìn)一步分開帶來大量麻煩)等缺點。目前，對其提取工藝進(jìn)行了改進(jìn)，主要有如下提取方法：1．2．4．1冷堿滲漉法

黃酮類物質(zhì)大多具有酚羥基，因此可以用堿性水或堿性稀醇浸出，經(jīng)酸化后得出黃酮類物質(zhì)。主要用的堿性溶液是稀氫氧化鈉和石灰水(氫氧化鈣水溶液)。氫氧化鈉水溶液的浸出能力高，但雜質(zhì)較多，不利于純化。石灰水可以使一些鞣質(zhì)或水溶性雜質(zhì)沉淀生成鈣鹽沉淀，有利于浸液純化；但是浸出效果不如氫氧化鈉水溶液效果好，同時有些黃酮類化合物能與鈣結(jié)合成不溶性物質(zhì)，不被溶出。文獻(xiàn)報道,采用冷堿滲漉提取一酸沉淀法從槐米中提取蘆丁，其收率比冷堿分次提取一酸沉淀法提高了5％。滲漉法由于保持一定的濃度差，所以提取效率較高，浸液雜質(zhì)較少；但費時較長，溶劑用量大，操作麻煩。1．2．4．2微波法

微波技術(shù)在人們的生產(chǎn)生活中應(yīng)用越來越廣泛，此法在黃酮類物質(zhì)的提取上也取得了良好的效果。它的原理是利用磁控管所產(chǎn)生的每秒24．5億次超高頻率的快速震動，使藥材內(nèi)分子間相互碰撞、擠壓，這樣有利于藥材有效成份的浸出。龔盛昭等用微波協(xié)同提取槐米中蘆丁的研究說明，協(xié)同提取10min，其提取率94．1％。在銀杏葉中提取黃酮，用60％乙醇溶液做萃取溶劑，僅僅用微波處理15min，用70℃水裕浸提1h便可與70℃水裕浸提4h的黃酮得率相當(dāng)，這大大地降低了成本和時間。微波在提取過程中具有反應(yīng)高效性和強選擇性等特點，而且操作簡便，副產(chǎn)物少，產(chǎn)率高及產(chǎn)物易提純等優(yōu)點；并且浸出過程中藥材細(xì)粉不凝聚，不糊化，戰(zhàn)勝了熱水法易凝聚易糊化的不足。但微波技術(shù)不適于熱敏性物質(zhì)的提取，而且高頻電場和微波輻射對人體機能有不利影響，使用時應(yīng)防止微波泄露，注意加強安全防護(hù)措施。此外微波提取是否會影響藥物的穩(wěn)定性、及療效等尚需深入研究和探討。1．2．4_3超臨界萃取法

超臨界C02萃取是一種90年代國際最新的高科技技術(shù)，它是以液態(tài)C02為溶劑進(jìn)行提取的，是一種不同于傳統(tǒng)黃酮類物質(zhì)提取的新工藝，它的提取率與

提取溫度、提取壓力、C02消耗量等因素有關(guān)。它既有與氣體相當(dāng)?shù)母邼B透能力和低的粘度，又具有與液體相近的密度和對物質(zhì)優(yōu)良的溶解能力。與水蒸氣蒸餾和溶劑提取法相比，超臨界流體提取是一項具有大量優(yōu)勢的提取技術(shù)。本法在生產(chǎn)銀杏黃酮內(nèi)臘的技術(shù)上取得了較大的突破。高發(fā)奎等研究說明，用超臨界C02能顯著提取槐花米中的蘆??；該技術(shù)的主要特點是提取率高、產(chǎn)品不含有害物質(zhì)、無污染。超臨界c02萃取技術(shù)項目的啟動符合人們回歸自然的世界潮流，可以帶動相關(guān)產(chǎn)業(yè)發(fā)展，帶動我國化學(xué)溶劑法的技術(shù)改造，促進(jìn)該行業(yè)發(fā)展；但是由于超臨界提取所需設(shè)備價格昂貴生產(chǎn)成本高，而且提取物中烷基酚含量較高，因此目前仍不能進(jìn)行規(guī)?；a(chǎn)。1．2．4．4超聲波法

用超聲波法提取黃酮類物質(zhì)，是～種比較新的方法，它是目前提取黃酮類化合物的發(fā)展方向。超聲波用于槐花米中的蘆丁提取，主要源于超聲波的空化作用，當(dāng)超聲波通過液體時，在聲波的稀疏階段，液體中含有雜質(zhì)或小氣泡的地方，會產(chǎn)生斷裂形成～些近真空的小空穴并迅速漲大；在聲波的壓縮階段，這些小空穴又被突然絕熱壓縮直至崩潰，崩潰時空穴周邊會形成局部的高溫高壓，其瞬間溫度可達(dá)5000℃，壓力達(dá)到50MPa，溫度的變化率可達(dá)109k/s并伴隨有猛烈的沖擊波，由此有效地粉碎了槐花米的細(xì)胞壁，加速了蘆丁在溶液中的溶解。但整個系統(tǒng)的溫度并未升高大量，提取可在室溫下進(jìn)行；從而提高了提出率，縮短了提取時間，并且免去了高溫對提取成份的影響。由于超聲波所形成的空穴只是在局部，所以必需將提取容器放置在指定位置，否則無明顯效果舊。

二．2.1試驗?zāi)康募耙饬x2.1.1試驗?zāi)康?/p>

2.1.1.1把握槐米中槲皮素的提取和提取方法2.1.1.2了解槲皮素的藥理作用和應(yīng)用價值2.1.1.3把握槲皮素的純度檢測及結(jié)構(gòu)鑒定的方法

2.1.1.4鍛煉自己的設(shè)計能力和試驗操作能力2.1.2試驗意義

通過試驗設(shè)計階段培養(yǎng)學(xué)生的自我創(chuàng)新能力，讓學(xué)生養(yǎng)成勤動腦，勤動手，勤查資料的好習(xí)慣；試驗階段通過學(xué)生的自我操作，提高學(xué)生的試驗操作，分析問題，解決問題的能力，加強對相關(guān)知識的理解，拓展學(xué)生的思維和對專業(yè)領(lǐng)域的再認(rèn)識。2.2試驗原理

采用堿提取一酸沉淀法提取蘆丁。蘆丁結(jié)構(gòu)含4個酚羥基，特別由于7位羥基和4’位羥基的存在，使得蘆丁有較強的酸性，可與堿反應(yīng)，生成鹽而溶于水；向此鹽溶液中參與酸，蘆丁又沉淀析出.蘆丁經(jīng)酸水解即得槲皮素。2.3試驗流程圖

2.4試驗用品

2.4.1試驗藥品：槐花NaOH顆粒濃硫酸蒸餾水無水乙醇甲醇a-萘酚鎂粉AlCl3氯化鋯枸櫞酸硅膠G甲苯醋酸乙酯KBrPH試紙槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品2.4.1試驗儀器：紫外分光光度儀紅外分光光度儀乳缽電熱套電子天平熔點測定儀紫外燈水浴鍋抽濾瓶真空泵布氏漏斗濾紙紗布燒杯（1000ml250ml50ml）燒瓶（500ml）蒸餾頭尾接納溫度計溫度計套管直行冷凝管三口燒瓶（500ml）球形冷凝管乳膠管攪拌器玻璃塞玻璃棒膠頭滴管量筒（10ml50ml100ml各一個）2.5試驗步驟2.5.1粗蘆丁的制備

槐米粗粉150g，加水800ml加熱，加氫氧化鈉調(diào)PH8-8.5，升溫至80℃，加硼砂3.2g，攪拌加熱,95℃保溫50min，趁熱過濾，濾渣再如上提取一次。合并濾液。向濾液參與10%HCL調(diào)PH4-5，放置過夜，抽濾。用冷蒸餾水洗滌濾渣至中性，至于80℃枯燥得粗蘆丁。2.5.2粗蘆丁的水解

至粗蘆丁于500ml三口燒瓶中，參與原生藥4倍量4%硫酸，微沸回流95min，之后參與適量的水稀釋，靜置，過濾。用水洗濾渣至無酸性，至80℃枯燥，得槲皮素粗品。

至粗品于500ml三口燒瓶中，參與20倍量95%乙醇，加熱回流，使其溶解，趁熱過濾，取濾液用20倍量蒸餾水稀釋，靜置24h，濾過。得槲皮素精品。2.6純度檢測

2.6.1測熔點：取槲皮素精品少量，用熔點測定儀測其熔點，觀測熔距的大小熔距越小，純度越高（m.p.313—314℃）.

2.6.2紙層析:新華一號濾紙,正丁醇:醋酸:水4:1:5為展開劑，可見光下觀測只

顯示單一的黃色斑點

2.6.3薄層色譜法：硅膠G板，用甲苯-醋酸乙酯-甲酸（5:4:1）展開；3%三氯

化鋁乙醇液檢識，紫外燈（365nm）觀測，經(jīng)展開，顯色僅顯示槲皮素的斑點2.7結(jié)構(gòu)鑒定

2.7.1槲皮素的理化鑒定

黃綠色結(jié)晶，熔點315-317℃（分解），紫外燈下顯蘭色熒光，加AlCl3乙醇溶液螢光變黃綠色，鹽酸鎂粉反