重組質(zhì)粒的酶切鑒定及PCR實驗

重組質(zhì)粒的酶切鑒定及PCR實驗陳倩倩(交流生)118627140313一，實驗?zāi)康?，檢驗重組質(zhì)粒的插入片段的大小2，學(xué)習(xí)PCR技術(shù)的使用二，實驗原理PCR技術(shù)類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火一延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93°C左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55C左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對結(jié)合；③引物的延伸：DNA模板一引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性一退火一延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需2?4分鐘，2?3小時就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。到達(dá)平臺期(Plateau)所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。PCR的三個反應(yīng)步驟反復(fù)進(jìn)行，使DNA擴(kuò)增量呈指數(shù)上升。反應(yīng)最終的DNA擴(kuò)增量可用Y=(1+X)n計算。Y代表DNA片段擴(kuò)增后的拷貝數(shù)，X表示平(Y)均每次的擴(kuò)增效率，n代表循環(huán)次數(shù)。平均擴(kuò)增效率的理論值為100%，但在實際反應(yīng)中平均效率達(dá)不到理論值。反應(yīng)初期，靶序列DNA片段的增加呈指數(shù)形式，隨著PCR產(chǎn)物的逐漸積累，被擴(kuò)增的DNA片段不再呈指數(shù)增加，而進(jìn)入線性增長期或靜止期，即出現(xiàn)“停滯效應(yīng)”，這種效應(yīng)稱平臺期數(shù)、PCR擴(kuò)增效率及DNA聚合酶PCR的種類和活性及非特異性產(chǎn)物的竟?fàn)幍纫蛩?。大多?shù)情況下，平臺期的到來是不可避免的。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物可分為長產(chǎn)物片段和短產(chǎn)物片段兩部分。短產(chǎn)物片段的長度嚴(yán)格地限定在兩個引物鏈5’端之間，是需要擴(kuò)增的特定片段。短產(chǎn)物片段和長產(chǎn)物片段是由于引物所結(jié)合的模板不一樣而形成的，以一個原始模板為例，在第一個反應(yīng)周期中，以兩條互補(bǔ)的DNA為模板，引物是從3’端開始延伸，其5’端是固定的，3’端則沒有固定的止點，長短不一，這就是“長產(chǎn)物片段”。進(jìn)入第二周期后，引物除與原始模板結(jié)合外，還要同新合成的鏈(即“長產(chǎn)物片段”)結(jié)合。引物在與新鏈結(jié)合時，由于新鏈模板的5’端序列是固定的，這就等于這次延伸的片段3’端被固定了止點，保證了新片段的起點和止點都限定于引物擴(kuò)增序列以內(nèi)、形成長短一致的“短產(chǎn)物片段”。不難看出“短產(chǎn)物片段”是按指數(shù)倍數(shù)增加，而“長產(chǎn)物片段”則以算術(shù)倍數(shù)增加，幾乎可以忽略不計，這使得PCR的反應(yīng)產(chǎn)物不需要再純化，就能保證足夠純DNA片段供分析與檢測用。三，實驗材料及儀器高速離心機(jī)，微波爐，電泳儀，制膠槽，電泳槽，梳子，錐形瓶，量筒，移液槍，冰盒，槍尖，Eppendorf管，微量移液器，手套，記號筆，TAE電泳緩沖液(10X)，瓊脂糖，漠化乙錠(EB)，DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)物DNAMarkerk/HindllLDL5000四，實驗步驟一，重組質(zhì)粒的酶切、電泳檢測1，按下表加樣進(jìn)行加樣后37C水浴1h

重組DNA13.2ulddH2O1.6ulBuf2ulHindI2ul2,將酶切后的片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳測試DL50O0DNAMarker一知而一噸一…一瞄我組酶切我組的質(zhì)粒DNA二，一.:匚一結(jié)果woeI2,將酶切后的片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳測試DL50O0DNAMarker一知而一噸一…一瞄我組酶切我組的質(zhì)粒DNA二，一.:匚一結(jié)果woeI3g?5Q5002X11(H)大小在9416—6557bp，之間此帶為插入的DNA片段。在入DNA/Hindl的4361bp和2322bp之間的條帶，并且稍快于DL5000的3000bp的條帶估測可能在2000—3000bp之間，此為切去外源片段以后的載體片段。，在DL5000的100bp和250bp之間的條帶，估計可能為200——150bp之間，此片段也為插入的DNA片段。㈡，第一條帶最為明亮，第二條次之，最后一條非常模糊。這是因為第一條為插入的大片段DNA，所以在片段數(shù)相同的情況下，所含堿基最多其雙螺旋中插入的漠化乙錠最多，因此紫外照射后熒光最亮。第二條帶與DL5000的3000bp條帶對比，其片段大小所差不多，但是亮度幾乎是DL5000的3000bp條帶的兩倍，可見我組提取的質(zhì)粒DNA比較多，即重組子其在細(xì)胞中的拷貝數(shù)比較多。二，PCRPCR反應(yīng)體系如下所示ddH2O13.2ul引物2ulbuf2ul模板1uldNTP1.6ulTqa酶0.2ul㈠引物此次重組用到的載體是pUC19，限制性內(nèi)切酶為HindiL所以選擇Hindi酶切位點兩側(cè)一定距離的序列制作引物。PUC19部分序列為：M13F(-47):?EcoRI

cgccapggffitcccagtcacgacgttgTaaaacgacggccaglgaattcgagctcggtacccggggatcctctagagtcgacctgcaggcatgcflaflCttggcgtaatcatggtcatagctgttcctgtgtgaaattgttatccgctcHindmM13R(-48)(互補(bǔ)鏈)PCR引物為引物名稱引物序列5’一3’引物長度（mers）頃）M13F(-47)CGCCAGGGIIIICCCAGTCACGAC2464.7M13R(-48)GAGCGGATAACAAIIICACACAGG2457.9㈡反應(yīng)程序1,94°C3min預(yù)變性預(yù)變性是讓DNA雙鏈充分解離，然后第一次退火過程時候引物可以盡量多的結(jié)合到模版上面這主要是為了保險起見，使模板DNA的二級結(jié)構(gòu)充分打開。2,94C30s變性通過加熱使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂，雙鏈解離形成單鏈DNA。3,58C30s退火當(dāng)溫度突然降低時由于模板分子結(jié)構(gòu)較引物要復(fù)雜的多，而且反應(yīng)體系中引物DNA量大大多于模板DNA，使引物和其互補(bǔ)的模板在局部形成雜交鏈，而模板DNA雙鏈之間互補(bǔ)的機(jī)會較少。4,72C1min延伸在DNA聚合酶和4種脫氧核糖核苷三磷酸底物及Mg離子存在的條件下，5'-—3’的聚合酶催化以引物為起始點的DNA鏈延伸反應(yīng)。5,72C10min循環(huán)完成后使PCR反應(yīng)完全以提高擴(kuò)增產(chǎn)量，在用普通Taq酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增時在產(chǎn)物末端加A尾的作用，可以直接用于TA克隆的進(jìn)行。6,10C2h1,,如圖所示，我組的PCR條帶在DL5000的第五（1000bp）和第六條帶（750bp）之間。說明該條帶的大小應(yīng)該介于1000bp和750bp之間。2,點樣10ul的情況下與相同量的Marker對比，PCR的DNA條帶極其明亮說明PCR產(chǎn)量很高。五，注意事項①操作時應(yīng)小心輕柔，防止將DNA吸入加樣槍內(nèi)或濺出離心管外。酶切時取酶時注意槍尖不要伸入液面以下太多，以免槍尖外壁沾染過多的酶。分子生物學(xué)實驗中，取樣微