毛細(xì)管電泳與超臨界流體色譜

毛細(xì)管電泳與超臨界流體色譜第1頁(yè)/共83頁(yè)第四部分毛細(xì)管電泳與超臨界流體色譜

第2頁(yè)/共83頁(yè)第一章毛細(xì)管電泳

第一節(jié)概述第3頁(yè)/共83頁(yè)一、毛細(xì)管電泳（capillaryelectrophoresis，CE）又稱高效毛細(xì)管電泳（highperformancecapillaryelectrophoresis，HPCE），是以高壓電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力，以毛細(xì)管為分離通道，依據(jù)樣品中各組分之間淌度和（或）分配系數(shù)的不同而進(jìn)行分離的一類(lèi)新型液相分離技術(shù)。第4頁(yè)/共83頁(yè)二、毛細(xì)管電泳的發(fā)展史及新動(dòng)向

瑞典科學(xué)家Tiselius在1937年首先提出電泳，創(chuàng)造了Tiselius電泳儀，并建立了移動(dòng)界面電泳方法。1948年他獲得了諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。

第5頁(yè)/共83頁(yè)1988年美國(guó)Bio-Rad公司研制出第一臺(tái)毛細(xì)管電泳儀HPE-100型。1989年在Boston召開(kāi)首屆HPCE專(zhuān)題會(huì)議。1981年，Jorgenson創(chuàng)立了毛細(xì)管電泳技術(shù)。第6頁(yè)/共83頁(yè)三、電泳與色譜1.作用原理2.分離過(guò)程3.儀器構(gòu)成4.分離通道的形狀第7頁(yè)/共83頁(yè)四、毛細(xì)管電泳的特點(diǎn)1.高靈敏度

紫外檢測(cè)器的檢測(cè)限可達(dá)10-13～10-15mol，激光誘導(dǎo)檢測(cè)器可達(dá)10-19～10-21mol；

三高二少一廣第8頁(yè)/共83頁(yè)2.高分離效能

每米理論塔板數(shù)可達(dá)幾百萬(wàn)甚至幾千萬(wàn)；

3.高速度

通常的分析時(shí)間不超過(guò)30min。有1.7min內(nèi)分離19種陽(yáng)離子及3min內(nèi)分離30種陰離子的報(bào)道；

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4.樣品用量少

只需納升級(jí)的進(jìn)樣量；

5.分析成本低（消耗少）

只需少量（幾毫升）流動(dòng)相，分析過(guò)程是在價(jià)格低廉的毛細(xì)管柱中進(jìn)行行；

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6.應(yīng)用范圍廣

可分離小分子（氨基酸、藥物等）、離子（無(wú)機(jī)及有機(jī)離子）、生物大分子（蛋白質(zhì)等）、甚至各種顆粒（如細(xì)胞、硅膠顆粒等），具有“萬(wàn)能”分析功能或潛力。

第11頁(yè)/共83頁(yè)五、毛細(xì)管電泳的分類(lèi)1.毛細(xì)管區(qū)帶電泳（CZE）又稱自由溶液毛細(xì)管電泳2.毛細(xì)管凝膠電泳（CGE）屬非自由溶液電泳，含有“分子篩”效應(yīng)。

第12頁(yè)/共83頁(yè)3.毛細(xì)管等速電泳（CITP）電泳型

4.毛細(xì)管等電聚焦（CIEF）按等電點(diǎn)分離，屬電泳型，要求完全抑制電滲流動(dòng)。

第13頁(yè)/共83頁(yè)5.膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜（MECC）又稱電動(dòng)色譜（EKC），是電泳技術(shù)和色譜技術(shù)巧妙結(jié)合的分離新技術(shù)，為CZE擴(kuò)展的色譜型。

6.毛細(xì)管電色譜（CEC）又稱毛細(xì)管電動(dòng)色譜，屬非自由溶液色譜型。

第14頁(yè)/共83頁(yè)7.微乳液電動(dòng)毛細(xì)管色譜（MEEKC）為CZE擴(kuò)展的色譜型

8.非水毛細(xì)管電泳（NACE）屬自由溶液電泳型。

第15頁(yè)/共83頁(yè)第二節(jié)毛細(xì)管電泳理論一、電泳和電泳淌度

電泳是帶電粒子在直流電場(chǎng)作用下于一定介質(zhì)（溶劑）中所發(fā)生的定向移動(dòng)。第16頁(yè)/共83頁(yè)

在電場(chǎng)作用下，帶電粒子定向遷移的速度（電泳速度）可用下式表示：

電泳速度淌度電場(chǎng)強(qiáng)度第17頁(yè)/共83頁(yè)

電場(chǎng)強(qiáng)度是指單位距離的電壓降（V/cm）。

淌度（mobility）是指溶質(zhì)在單位電場(chǎng)下的遷移速度，即單位電場(chǎng)下的電泳速度。第18頁(yè)/共83頁(yè)

在無(wú)限稀釋溶液中（稀溶液數(shù)據(jù)外推）測(cè)得的淌度稱為絕對(duì)淌度（absolutemobility）。

絕對(duì)淌度是在無(wú)限稀釋時(shí)單位電場(chǎng)強(qiáng)度下帶電粒子的平均遷移速度，是該離子在一定溶液中的特征物理常數(shù)。

第19頁(yè)/共83頁(yè)電場(chǎng)力：

根據(jù)流體力學(xué)知道，（球型）離子的流動(dòng)阻力Ff

：離子電荷溶劑粘度離子有效半徑第20頁(yè)/共83頁(yè)

一定時(shí)間后，兩種力的作用達(dá)到平衡，即FE=Ff，此時(shí)離子作勻速運(yùn)動(dòng)，電泳進(jìn)入穩(wěn)態(tài)。

溶液的介電常數(shù)粒子的Zeta電勢(shì)第21頁(yè)/共83頁(yè)棒狀粒子：

顯然，分子半徑小，電荷大的離子具有較大的電泳淌度，而分子半徑大，電荷小的離子具有較小的電泳淌度。

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有效淌度（effectivemobility）是實(shí)際測(cè)出的離子淌度，可表示為：樣品分子中的第i級(jí)解離度活度系數(shù)第23頁(yè)/共83頁(yè)

它與帶電粒子的電荷、形狀、大小、離解度、溶劑化作用，溶劑的介電常數(shù)、粘度、pH值和溫度有關(guān)。

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電泳分離的基礎(chǔ)是建立在各分離組分有效淌度的差異上。

第25頁(yè)/共83頁(yè)二、電滲

電滲流（electroosmoticflow，EOF），簡(jiǎn)稱電滲，是指管內(nèi)溶液在外力電場(chǎng)作用下整體向一個(gè)方向運(yùn)動(dòng)的現(xiàn)象。

第26頁(yè)/共83頁(yè)HPCE通常采用的是石英毛細(xì)管柱，一般情況下（pH＞3），硅醇基（—SiOH）電離為硅氧基負(fù)離子（—SiO），使管壁表面帶負(fù)電，為了保持電荷平衡，溶液中水合離子（一般為陽(yáng)離子）被吸附到表面附近，形成雙電層。當(dāng)在毛細(xì)管兩端加高電壓時(shí)，雙電層中的陽(yáng)離子向陰極移動(dòng)，由于離子是溶劑化的，所以帶動(dòng)了毛細(xì)管中溶液整體向陰極移動(dòng)，產(chǎn)生電滲流。

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電滲流的大小可用電滲速度和電滲淌度μos表示。

一般情況下，電滲流的速度是電泳速度的5～7倍。電滲速度電滲淌度管壁的Zeta電勢(shì)第28頁(yè)/共83頁(yè)三、表觀淌度和權(quán)均淌度

在毛細(xì)管電泳中，同時(shí)存在電泳和電滲，若不考慮它們之間的相互作用，粒子在毛細(xì)管內(nèi)的遷移速度應(yīng)當(dāng)是電泳速度和電滲速度的矢量和，即：第29頁(yè)/共83頁(yè)表觀遷移速度電滲速度電泳速度表觀淌度第30頁(yè)/共83頁(yè)

組分表觀淌度表觀遷移速度正離子中性分子負(fù)離子分離后出峰次序?yàn)椋赫x子＞中性分子＞負(fù)離子第31頁(yè)/共83頁(yè)+圖毛細(xì)管分離示意圖第32頁(yè)/共83頁(yè)四、兩相分配與權(quán)均淌度

如果特意在毛細(xì)管中引入另一相，稱為P相，樣品在電遷移過(guò)程中同時(shí)會(huì)發(fā)生相間分配，其遷移速度或淌度將發(fā)生變化，這樣改變了的粒子遷移速度和淌度，稱為加權(quán)平均速度和加權(quán)平均淌度，簡(jiǎn)稱權(quán)均速度和權(quán)均淌度。

第33頁(yè)/共83頁(yè)設(shè)相分配過(guò)程遠(yuǎn)快于電泳過(guò)程，則有：

容量因子樣品在P相中的分子數(shù)樣品在溶劑相中的分子數(shù)P相的表觀淌度第34頁(yè)/共83頁(yè)P(yáng)相在電場(chǎng)中可靜止，也可遷移，運(yùn)動(dòng)方向可正、可負(fù)。利用引入P相，可使中性組分產(chǎn)生不同的權(quán)均淌度，因而解決了中性組分在毛細(xì)管電泳中的分離問(wèn)題。

第35頁(yè)/共83頁(yè)（一）遷移時(shí)間tR五、分離效率與譜帶展寬

帶電粒子從進(jìn)樣口遷移至檢測(cè)窗所用的時(shí)間，稱為遷移時(shí)間。

遷移時(shí)間毛細(xì)管的有效長(zhǎng)度毛細(xì)管的總長(zhǎng)度外加電壓第36頁(yè)/共83頁(yè)（二）柱效和塔板高度

理論塔板數(shù)遷移時(shí)間半峰寬塔板高度毛細(xì)管的有效長(zhǎng)度第37頁(yè)/共83頁(yè)（三）譜帶展寬

1.流型

以電場(chǎng)力驅(qū)動(dòng)產(chǎn)生的EOF，與HPLC中靠外部泵壓產(chǎn)生的液流不同。EOF的流型屬扁平流型或稱“塞流”。扁平型的塞子流不會(huì)引起樣品區(qū)帶的增寬，是毛細(xì)管電泳高效的重要原因。第38頁(yè)/共83頁(yè)HPLC的流型則是拋物線狀的層流，它在壁上的速度為零，中心速度為平均速度的2倍。

第39頁(yè)/共83頁(yè)VanDeemter方程：

空心毛細(xì)管柱，則用Golay方程式表示：渦流擴(kuò)散項(xiàng)分子擴(kuò)散項(xiàng)傳質(zhì)阻力第40頁(yè)/共83頁(yè)

由于在毛細(xì)管電泳中，無(wú)固定相和流動(dòng)相兩相，因此不存在傳質(zhì)項(xiàng)，而且速度流型又是扁平的，于是只有縱向擴(kuò)散項(xiàng)：擴(kuò)散系數(shù)第41頁(yè)/共83頁(yè)

毛細(xì)管電泳特別適合分離生物大分子。

第42頁(yè)/共83頁(yè)2.自熱

管徑是影響自熱的一個(gè)重要因素。理論上：E=50kV/m，c=0.01mol/L，d＜140m實(shí)際應(yīng)用25～75m的毛細(xì)管第43頁(yè)/共83頁(yè)

使用小內(nèi)徑、大外徑的毛細(xì)管，適當(dāng)降低外加電壓、降低緩沖溶液的濃度以及對(duì)毛細(xì)管恒溫等均可以減小溫度梯度，提高柱效。第44頁(yè)/共83頁(yè)3.擴(kuò)散與吸附（1）擴(kuò)散

（2）吸附組分與毛細(xì)管壁的相互作用主要為管壁對(duì)組分的吸附。。

第45頁(yè)/共83頁(yè)六、分離度

分離度是指將淌度相近的組分分開(kāi)的能力。

遷移時(shí)間峰底寬度標(biāo)準(zhǔn)偏差第46頁(yè)/共83頁(yè)分離度也可表示為柱效的函數(shù)：

不考慮電滲流時(shí)：

第47頁(yè)/共83頁(yè)當(dāng)考慮電滲流時(shí)：

第48頁(yè)/共83頁(yè)第三節(jié)毛細(xì)管電泳儀器系統(tǒng)

毛細(xì)管電泳儀主要包括高壓電源、進(jìn)樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、檢測(cè)系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。

第49頁(yè)/共83頁(yè)1234655圖毛細(xì)管電泳裝置示意圖1．高壓電源2．檢測(cè)器3．液冷溫控毛細(xì)管4．?dāng)?shù)據(jù)記錄系統(tǒng)5．緩沖液槽6．緩沖液第50頁(yè)/共83頁(yè)一、高壓電源

常用的高壓電源為能提供0～30kV，電流為200～300A的連續(xù)可調(diào)的直流高壓電源，為了獲得遷移時(shí)間的高重現(xiàn)性，操作電壓要穩(wěn)定在±0.1%范圍內(nèi)。

第51頁(yè)/共83頁(yè)

高壓電源要能夠切換極性，最好是雙極性高壓源。

必須注意高壓的安全保護(hù)問(wèn)題。

高壓源有恒壓、恒流或恒功率等方式。最常用的是恒壓源。

第52頁(yè)/共83頁(yè)二、進(jìn)樣系統(tǒng)

毛細(xì)管內(nèi)徑很小，進(jìn)樣量必須很少，一般進(jìn)樣長(zhǎng)度為毛細(xì)管總長(zhǎng)度的1%～2%。進(jìn)樣體積為納升（nl）級(jí)。所以毛細(xì)管的進(jìn)樣采用無(wú)死體積的進(jìn)樣方法。第53頁(yè)/共83頁(yè)

毛細(xì)管的進(jìn)樣是讓毛細(xì)管直接與樣品接觸，然后由重力、電場(chǎng)力或其他動(dòng)力來(lái)驅(qū)動(dòng)樣品流入管中，進(jìn)樣量可以通過(guò)控制驅(qū)動(dòng)力的大小或時(shí)間長(zhǎng)短來(lái)控制。第54頁(yè)/共83頁(yè)

在毛細(xì)管電泳中常采用的進(jìn)樣方式為電遷移進(jìn)樣和流體動(dòng)力學(xué)進(jìn)樣，除此還有擴(kuò)散進(jìn)樣。

第55頁(yè)/共83頁(yè)1.電遷移進(jìn)樣進(jìn)樣體積毛細(xì)管的橫截面積進(jìn)樣時(shí)間進(jìn)樣量樣品濃度第56頁(yè)/共83頁(yè)

電動(dòng)進(jìn)樣的控制參數(shù)是電場(chǎng)強(qiáng)度E和進(jìn)樣時(shí)間。通過(guò)改變進(jìn)樣電壓和進(jìn)樣時(shí)間可以控制進(jìn)樣量。其中E是進(jìn)樣動(dòng)力，取值多在1～10kV/60cm之間，僅為分離時(shí)操作電壓的1/5～1/3。是進(jìn)樣時(shí)間，取值通常在1～10s之間，有時(shí)可達(dá)1min或更大。

第57頁(yè)/共83頁(yè)

電動(dòng)進(jìn)樣對(duì)毛細(xì)管內(nèi)的填充介質(zhì)沒(méi)有特別限制，可實(shí)現(xiàn)完全自動(dòng)化，但在電遷移進(jìn)樣中存在一種歧視效應(yīng)，即電泳淌度大的組分進(jìn)樣量大，電泳淌度小的組分進(jìn)樣量小或不進(jìn)，會(huì)降低分析的準(zhǔn)確度和可靠性。第58頁(yè)/共83頁(yè)2.流體動(dòng)力學(xué)進(jìn)樣進(jìn)樣量樣品濃度毛細(xì)管兩端壓力差毛細(xì)管長(zhǎng)度溶液的黏度第59頁(yè)/共83頁(yè)

顯然，P和

是控制參數(shù)，其中P

是進(jìn)樣動(dòng)力，可以通過(guò)如下幾種方式進(jìn)行：（a）在進(jìn)樣端加氣壓（正壓）；（b）在出口端抽真空（管尾抽吸，負(fù)壓）；（c）利用虹吸作用，即所謂的重力進(jìn)樣。第60頁(yè)/共83頁(yè)

P的取值一般在±3450Pa（約3447Pa）附近。

的取值通常在1～5s之間，有時(shí)可超過(guò)60s。

在流體動(dòng)力學(xué)進(jìn)樣中不存在像電遷移進(jìn)樣中的歧視效應(yīng)。第61頁(yè)/共83頁(yè)利用重力虹吸進(jìn)樣：顯然，進(jìn)樣量也可由H控制。H

的取值通常在5～20cm之間，多數(shù)取10cm，對(duì)應(yīng)的多在5～30s間取值。緩沖溶液的密度重力加速度毛細(xì)管進(jìn)、出口的液面落差第62頁(yè)/共83頁(yè)

虹吸進(jìn)樣方式一般為沒(méi)有壓力進(jìn)樣功能的儀器系統(tǒng)所采納。第63頁(yè)/共83頁(yè)3.擴(kuò)散進(jìn)樣

擴(kuò)散進(jìn)樣動(dòng)力屬不可控制參數(shù)，進(jìn)樣量?jī)H由擴(kuò)散時(shí)間控制。擴(kuò)散進(jìn)樣時(shí)間在10～60s間，屬普適性進(jìn)樣方法。

擴(kuò)散系數(shù)第64頁(yè)/共83頁(yè)三、分離系統(tǒng)

分離系統(tǒng)包括毛細(xì)管、毛細(xì)管恒溫系統(tǒng)、電極和緩沖液池。

第65頁(yè)/共83頁(yè)1.毛細(xì)管

目前最常用的是厚壁，內(nèi)徑為25～75m，有效長(zhǎng)度為30～75cm的熔融石英毛細(xì)管柱。并定期清洗。

第66頁(yè)/共83頁(yè)2.毛細(xì)管恒溫系統(tǒng)

毛細(xì)管溫度的控溫精度應(yīng)達(dá)到±0.1℃。目前商品儀器配備的恒溫系統(tǒng)有高速氣流恒溫和液體恒溫兩種。

第67頁(yè)/共83頁(yè)3.電極和緩沖液池

在毛細(xì)管電泳系統(tǒng)中，正負(fù)鉑電極、進(jìn)樣端緩沖液池、檢測(cè)端緩沖液池和充滿運(yùn)行緩沖液的毛細(xì)管構(gòu)成了一個(gè)導(dǎo)電回路。第68頁(yè)/共83頁(yè)

緩沖溶液液面高度控制是保證毛細(xì)管電泳分離效率和遷移時(shí)間重現(xiàn)性的重要因素。

緩沖液要經(jīng)常更新，這樣有助于提高電泳分離的重現(xiàn)性。

第69頁(yè)/共83頁(yè)（一）紫外檢測(cè)四、檢測(cè)系統(tǒng)

紫外吸收檢測(cè)是目前毛細(xì)管電泳最常用的檢測(cè)方法，用于檢測(cè)有紫外吸收的物質(zhì)。依檢測(cè)方式的差異，紫外檢測(cè)器可分為固定波長(zhǎng)、可變波長(zhǎng)、二極管陣列等類(lèi)型．

第70頁(yè)/共83頁(yè)

一般采用柱上檢測(cè)方式，也可實(shí)現(xiàn)柱后檢測(cè)。質(zhì)量檢測(cè)限為10-13～10-16

mol，濃度檢測(cè)限為10-5～10-8mol/L，其特點(diǎn)為通用性好，二極管陣列可提供光譜信息。第71頁(yè)/共83頁(yè)

紫外檢測(cè)器由光源、光路系統(tǒng)、信號(hào)接收和處理系統(tǒng)構(gòu)成。第72頁(yè)/共83頁(yè)（二）熒光檢測(cè)

一般采用柱上檢測(cè)方式。質(zhì)量檢測(cè)限為10-15～10-17mol，濃度檢測(cè)限為10-7～10-9mol/L，靈敏度高，需衍生化。第73頁(yè)/共83頁(yè)（三）激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)

也可采用柱上和柱后兩種檢測(cè)方式。質(zhì)量檢測(cè)限為10-18～10-20mol，濃度檢測(cè)限為10-14～10-16mol/L，靈敏度非常高，通常需樣品衍生化。第74頁(yè)/共83頁(yè)

毛細(xì)管電泳的電化