細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)課件

細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)一：轉(zhuǎn)染的簡介二：轉(zhuǎn)染的分類三：轉(zhuǎn)染的方法一、轉(zhuǎn)染的簡介1.基因轉(zhuǎn)染:將具生物功能的核酸轉(zhuǎn)移或運(yùn)送到細(xì)胞內(nèi)并使核酸在細(xì)胞內(nèi)維持其生物功能。2.基因轉(zhuǎn)染技術(shù)已廣泛應(yīng)用于基因組功能研究和基因治療研究?；蜣D(zhuǎn)染真核細(xì)胞的方法轉(zhuǎn)染方法化學(xué)轉(zhuǎn)染法物理轉(zhuǎn)染法病毒感染法DEAE一葡聚糖法顯微注射法逆轉(zhuǎn)錄病毒磷酸鈣法電穿孔法腺病毒人工脂質(zhì)體法基因槍法

是最早應(yīng)用哺乳動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)染的試劑之一。DEAE-葡聚糖是陽離子多聚體,它與帶負(fù)電的核酸結(jié)合后接近細(xì)胞膜而被攝取。DEAE一葡聚糖轉(zhuǎn)染已成功地應(yīng)用于瞬時(shí)開始，但用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染卻不可靠。DEAE-葡聚糖法

磷酸鈣共沉淀轉(zhuǎn)染法

由于試劑易得、價(jià)格便宜而被廣泛用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定染的研究。方法是，先將DNA和氯化鈣混合，然后加人到PBS中慢慢形成DNA磷酸鈣沉淀，后把含有沉淀的混懸液加到培養(yǎng)的細(xì)胞上，通過胞膜的內(nèi)吞作用攝人DNA。脂質(zhì)體介導(dǎo)法（目前應(yīng)用最廣泛）原理：陽離子脂質(zhì)體試劑與DNA混合后，形成一種穩(wěn)定的脂質(zhì)雙層復(fù)合物，DNA被包在脂質(zhì)體中間，這種脂質(zhì)雙層復(fù)合物可直接加到培養(yǎng)的細(xì)胞中，脂質(zhì)體粘附到細(xì)胞表面并與細(xì)胞膜融合，DNA被釋放到胞漿中?！局饕獞?yīng)用】:瞬時(shí)轉(zhuǎn)染穩(wěn)定轉(zhuǎn)染.【特點(diǎn)】：使用方法簡單，可攜帶大片段DNA，通用于各種類型的裸露DNA或RNA，能轉(zhuǎn)染各種類型的細(xì)胞，沒有免疫原性。雖在體外基因轉(zhuǎn)染中有很高的效率，但在體內(nèi)，能被血清清除，并在肺組織內(nèi)累積，誘發(fā)強(qiáng)烈的抗炎反應(yīng)，導(dǎo)致高水平的毒性，很大程度上應(yīng)用受限制。

利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法最重要的就是防止其毒性，因此脂質(zhì)體與質(zhì)粒的比例，細(xì)胞密度以及轉(zhuǎn)染的時(shí)間長短和培養(yǎng)基中血清的含量都是影響轉(zhuǎn)染效率的重要問題，通過實(shí)驗(yàn)摸索的合適轉(zhuǎn)染條件對于效率的提高有巨大的作用。

(2）顯微注射法該法雖然費(fèi)力，但卻是非常有效的將核酸導(dǎo)人細(xì)胞或細(xì)胞核的方法。這種方法常用來制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，但不適用于需要大量轉(zhuǎn)染細(xì)胞的研究。（3）基因槍法該法依靠攜帶了核酸的高速粒子而將核酸導(dǎo)人細(xì)胞內(nèi)，這種方法適用于培養(yǎng)的細(xì)胞和在體的細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)室用到的轉(zhuǎn)染方法脂質(zhì)體介導(dǎo)法細(xì)胞轉(zhuǎn)染Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑：以HEK193細(xì)胞為例：轉(zhuǎn)染前一天，將細(xì)胞鋪到培養(yǎng)皿中，加入有血清無雙抗的培養(yǎng)基（15ml）；24小時(shí)候換上無血清無雙抗的培養(yǎng)基12ml；將所需的質(zhì)粒用1.5ml無血清無雙抗的培養(yǎng)基稀釋；取40ul的Lipofectamine2000加入無血清無雙抗的培養(yǎng)基稀釋，室溫放置5min；5min后將質(zhì)粒和Lipofectamine2000混合在一起，室溫放置20min后加入培養(yǎng)皿中，4h后換上完全培養(yǎng)基48h培養(yǎng)；注：24h看一次，如果培養(yǎng)基變顏色換培養(yǎng)基；

細(xì)胞（1）分裂細(xì)胞相比較非分裂細(xì)胞（2）貼壁細(xì)胞相比較懸浮細(xì)胞（3）傳代次數(shù)（4）細(xì)胞數(shù)量（融合率）2交叉污染如果同一個(gè)實(shí)驗(yàn)室同時(shí)培養(yǎng)不同種類的細(xì)胞，那就有可能發(fā)生交叉污染，即使遵循最嚴(yán)格的分離操作規(guī)程這種情況也有可能發(fā)生。如有許多細(xì)胞系被HeLa細(xì)胞所污染。和其他細(xì)胞系之間的交叉污染不總是能通過鏡檢發(fā)現(xiàn)。如果有少量某種生長快速的細(xì)胞摻入到培養(yǎng)細(xì)胞種，幾個(gè)月過后它們就會(huì)完全取代目標(biāo)培養(yǎng)物。3載體DNA

對純化所得的載體進(jìn)行質(zhì)量鑒定。