污染物生物效應檢測

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第四章污染物的生物效應檢測

第一節(jié)生物測試及方式

第二節(jié)生物毒性試驗

第三節(jié)生物三致效應檢測

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第一節(jié)生物測試及方式一、生物測試

生物測試（Bioassay）指利用生物反應測定一種或多種污染物或環(huán)境因素單獨或聯(lián)合存在時，所導致的影響或危害。實際上就是用生物去測定污染物的危害?？稍诜肿?、細胞、組織、器官、甚至個體和種群多種水平上進行。3第3頁/共104頁污染物毒性生物測試優(yōu)點：1)生物測試不需特殊儀器、方法簡單。2)可提供污染物的生物毒性，而常規(guī)的物理和化學檢測只能測定污染物的濃度。3）可測定污染物之間的相互作用,以及它們對生物體的綜合效應,而常規(guī)的物理和化學檢測則做不到。4）還可了解環(huán)境因素對污染物毒性的影響。如水體pH、溶氧量、氧化還原電位、水體中有機和元機配位體對污染物毒性的影響等 。

4第4頁/共104頁生物測試意義：1）研究多種污染物聯(lián)合作用的生物效應。2）監(jiān)測環(huán)境質量的變化。3）制訂環(huán)境質量標準。4）對制訂排污標準，以及對污染物生態(tài)風險評價有重要意義。5第5頁/共104頁但注意：（1）污染物結構、性質、毒作用機理不同，同一種生物對不同污染物的反應不同。（2）不同生物解毒機制、及能力不同，因而不同生物對相同污染物有不同的反應。（3）不同發(fā)育階段的生物對同種污染物的反應也不同。（4）受污染毒害的經(jīng)驗也會影響生物對有毒污染物的反應。

6第6頁/共104頁（一）生物測試方式根據(jù)不同的研究要求和目的，可進行不同的測試。測試方法多樣，有按時間分的、有按試驗溶液和氣體給予方式分的。1、短期生物測試（Shorttermbioassays）指被測試的生物在短時間內暴露于高濃度的污染物下，測定污染物對生物有機體的影響。例：急性毒性試驗，以快速估價污染物的毒性。7第7頁/共104頁1)測試目的：（1）快速估計污染物的毒性；（2）評價幾種毒物的相對毒性；（3）評價不同生物對不同條件如溫度、pH的相對敏感性等。主要用于測定半致死濃度(LC50)、或半抑制濃度(IC50)或半效應濃度(EC50)。

2)時間設定：一般小于1周，如一般水蚤類<2d，藻類<3d，魚類<4d。8第8頁/共104頁3)測試特點（1）暴露時間短；僅幾天。（2）污染物濃度高；（3）一般采用靜止式給予有毒溶液或氣體。但對于下列情況，應用流動式給藥：1）不穩(wěn)定且易揮發(fā)的污染物（濃度會漸低)；2）BOD較高的污水(低O2)；3）代謝速率快的受試生物（產(chǎn)生高的代謝產(chǎn)物如CO2和NH3會影響受試生物的代謝。

9第9頁/共104頁2、長期生物測試（Longtermbioassays）在低濃度下，受試生物長期被暴露于污染物下的測試，又稱全部生活史生物測試，常見有慢性毒性試驗。

1）測定目的測定在長期污染下，不造成有害效應的毒物最大濃度，或最大允許毒物濃度（MATC）。測定包括毒物對生物生長、生殖、產(chǎn)卵、孵卵、幼體成活等的影響。10第10頁/共104頁2）時間確定

（1）對動物而言，需要從一個卵期到下一個卵期或更長的連續(xù)測定；（2）對于更小的生物如浮游生物，要持續(xù)好幾代測試；（3）但對生活史特別長的動物，人們則選擇在整個生活史中最敏感的幾個階段測試。如在魚的發(fā)育早期測定，這種測定又稱部分生活史生物測試。11第11頁/共104頁3)長期生物測試要求(1)只能采用流動式染毒性。(2)室內試驗條件，如水溫、pH、硬度等必需和自然季節(jié)變化相符。(3)受試生物的生長、發(fā)育規(guī)律符合季節(jié)變化。

12第12頁/共104頁3、中期生物測試（Intermediatetermbioassays）（1）目的:

介于短期和長期之間的一類生物測試。如亞慢性毒性試驗。對毒物的毒作用、靶器官和最大無作用劑量或中毒閾值作出估計。（2）測試時間：8天之內算是短期，8-90天之間中期。（3）毒物給予方式：無論毒物是溶液還是氣體，給予方式一般采用流動式，少數(shù)可采用靜止式。13第13頁/共104頁（二）受試生物的選擇1）對毒物敏感性：SO2的敏感植物：紫苜蓿、大麥、棉花、小麥、三葉草、甜菜、萵苣、大豆、向日葵。O3敏感植物：煙草、番茄、矮牽牛、菠菜、土豆、燕麥、丁香、秋海棠、女貞、梓樹。2）具生態(tài)學價值或經(jīng)濟價值。3）實驗室內易培養(yǎng)和繁殖。4）具清楚的生物學背景資料如生活史、生長、發(fā)育特點等；5）足夠的數(shù)量。6）對毒物的反應的易測性。此外，個體大小、生活史長短，以及以前受污染情況也需考慮。14第14頁/共104頁二、生物測試標準化（一）影響生物測試的因素

1、受試生物：受試生物的種類、生長年齡（生活階段、尺寸大小、脫皮階段）、發(fā)育階段、食物供應程度等均影響生物對毒物的敏感性。

2、試驗條件：如試驗水質的溫度和含鹽量、水流速度和溶解氧、水域的酸堿度、受試生物的總量，不僅影響生物對毒物的反應，而且影響作用于生物的毒物濃度、性質和形態(tài)。3、實驗操作：實驗結果還受人員操作水平、儀器設備的精度、測定方法的影響。15第15頁/共104頁（二）標準化測試的優(yōu)點1）增加數(shù)據(jù)的精確度，利于數(shù)據(jù)的比較。2）測試可以被其它實驗室重復。3）篩選不同實驗室一致的實驗結果。4）可為環(huán)境標準的建立提供可靠的數(shù)據(jù)，如飲用水環(huán)境質量標準等。16第16頁/共104頁（三）標準化的生物測試方法有《水質物質對蚤類急性毒性測定方法《B/T13266-91)》、《水質物質對淡水魚（斑馬魚）急性毒性測定方法(GB/T13267-91)》等。

主要對1）毒物的分析方法、環(huán)境條件的測定方法，2）儀器設備,3）生物大小、生物量，4）水的溶解氧和pH,5）統(tǒng)計方法作出了國家規(guī)定。但對那些易分解、非常見和混合污染物的測定還很難進行標準化測定。17第17頁/共104頁

第二節(jié)生物毒性試驗一、生物毒性（一）生物毒性的基本概念1、毒物（Toxicant）和毒性（1）毒物：在一定條件下，以較小劑量給予有機體時，與生物相互作用后而引起功能或器質性損傷的化學物質稱毒物?；騽┝侩m微，但積累到一定量時，就能干擾或破壞機體的正常生理功能，而引起暫時或持久性病變，甚至危及生命的化合物，稱毒物。18第18頁/共104頁

（2）毒性(Toxicity):指毒物產(chǎn)生有害作用的能力。與下列因素有關：1）進入機體的劑量。體內潛在性有毒物質存在并不意味發(fā)生中毒，通常只有達中毒劑量時，才可引起中毒。2）進入機體的方式（如經(jīng)口、皮膚或呼吸）。3）接觸時間及頻率。時間越長、頻率越高，越引起中毒。

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2、中毒（toxication）受到毒物作用，引起生物有機體功能和器質性損傷后，所出現(xiàn)的疾病狀態(tài)稱中毒。如有機磷中毒后出現(xiàn)的震顫、出汗、瞳孔縮小等。中毒是在各種毒物作用下，在局部或全身的綜合表現(xiàn)。（1）毒效應或毒性作用化學物引起生物有機體的損傷的總稱為毒性作用或毒效應。可用相關生理生化指標表示。如有機磷農(nóng)藥對膽堿酯酶活性的抑制；苯抑制造血功能而引起貧血。20第20頁/共104頁

（2）毒物反應（reaction）

指接觸化學物質后，表現(xiàn)某種效應的個體在一個群體中所占的比例。（3）毒物危險性和危害性

1）毒物危險性指某一化學物質在正常生產(chǎn)、使用過程中，能引起有機體發(fā)生中毒的可能性，稱毒物危險性，是毒物對個人或群體的毒性效應和產(chǎn)生疾病甚至死亡的定量估計。21第21頁/共104頁

2）毒物危害性：指有毒物質與有機體接觸和使用過程中，有引起中毒的可能性，稱毒物危害性，用來定性表示毒物對人群健康引起的有害作用。物質危害性的大小一般與物質進入體內的能力和數(shù)量有關，揮發(fā)性小，易溶于水或血液中，并能迅速達到中毒濃度的物質的危害性大。

22第22頁/共104頁（二）毒性參數(shù)1、常用毒性參數(shù)

（1）致死劑量或致死濃度(LD，lethaldoseorLC，lethalconcentration)①絕對致死劑量或濃度（LD100，AbsolutelethaldoseorLC100，Absolutelethalconcentration）指一群動物全部死亡的最低劑量或濃度。②半致死劑量或濃度（LD50，MedianlethaldoseorLC50，Medianlethalconcentration）指能引起一群動物死亡50%的最低劑量或濃度。23第23頁/共104頁③最小致死劑量或濃度（MLD，Minimumlethaldose，MLC，Minimumlethalconcentration）：能使一群動物僅個別死亡的最高劑量或濃度。(2)最大耐受劑量和最大無作用劑量①最大耐受劑量或濃度（MTD0，MaximumtolerancedoseorMTC0，Maximumtoleranceconcentration）能使一群動物雖然發(fā)生嚴重中毒，但全部存活無一死亡的最高劑量或濃度。24第24頁/共104頁

②最大無作用劑量（Maximumnoeffectdose）污染物對生物產(chǎn)生效應隨污染物濃度或劑量的降低而減弱，當外來化學物劑量減到一定量時，生物學變化已達到0，不能觀察到任何損害作用的最高劑量稱最大無作用劑量。其是制訂人體每日容許攝入量、最高容許濃度和評定污染物毒性作用的主要依據(jù)。25第25頁/共104頁③最小有作用劑量（Minimaleffectlevel）指能使有機體發(fā)生某種異常變化所需的最小劑量。其一般大于最大無作用劑量，因此又稱中毒閾劑量。④半數(shù)效應濃度(EC50,Medianeffectconcentration)指能引起50%受試生物的某種效應變化的濃度。⑤半數(shù)抑制濃度(IC50,Medianinhibitionconcentration)指能引起受試生物的某種效應50%抑制的濃度。26第26頁/共104頁（3）毒作用帶（Toxiceffectzone）：是恒量污染物危險性大小的一個指標。

①急性毒性作用帶：為半致死量與急性毒性最小有作用劑量的比值。此值愈大，污染物危險性愈小，反之危險性愈大。27第27頁/共104頁

②慢性毒性作用帶：是恒量毒物急、慢性毒性的一個指標，急性毒性最小有作用劑量與慢性毒性最小有作用劑量之比。比值愈小，表明引起急性中毒的危險性相對較大。反之，引起慢性毒性中毒的可能性愈大。28第28頁/共104頁2、毒物單位與分級

（1）毒物單位（濃度）：毒物在空氣中的濃度以mg/m3或mg/L表示；哺乳動物以mg/Kg或ml/kg體重表示；水環(huán)境中的毒物以mg/L或μg/L表示。

（2）毒物分級：毒物毒性的大小與半數(shù)致死量成反比，但不同化合物之間毒性差別很大，可達百萬甚至幾千萬倍。為了加強毒物在生產(chǎn)、運輸、使用和貯存方面的管理；便于制訂和比較環(huán)境質量標準；在發(fā)生意外時,采取相應的保護措施，必須對毒物進行分級。

29第29頁/共104頁1）我國工業(yè)毒物急性毒性分級

30第30頁/共104頁2）我國農(nóng)藥急性毒性分級

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3）水生生物評價體系

32第32頁/共104頁二、毒性試驗（一）急性毒性試驗指研究化學物質大劑量一次染毒或者說24h內多次染毒，動物所引起的毒性試驗。目的：為了在短期內了解某物質的毒性大小，需做急性毒性試驗(Acutetoxicitytest)。有哺乳動物急性毒性試驗、水生生物急性毒性試驗和蚯蚓急性毒性試驗。33第33頁/共104頁1、哺乳動物急性毒性試驗：（1）實驗材料：小鼠和大鼠，若進行毒物皮試實驗，還可用家兔和豚鼠。（2）確定動物全活和全致死量查閱文獻中與受試物的類似物的LD50(LC50)，一般以3倍之差配制三個劑量組進行預試驗（1/3LD50，LD50,3LD50），每組3只動物，求出全致死量和全活劑量。34第34頁/共104頁35第35頁/共104頁（3）在預試驗的全活量和全致死量之間，以各組間距1.2~1.5的“等比級數(shù)”，計設5~6個劑量組，進行染毒。觀察2周內的死亡情況。（4）病理解剖檢查：剖檢死亡或瀕死動物及部分存活的動物，計算LD50或LC50。（5）依急性毒性分級標準，根據(jù)LD50或LC50，評定毒物的毒性，LD50值愈小，毒性愈大。36第36頁/共104頁2、水生生物急性毒性試驗根據(jù)試驗對象，可分為魚類、水蚤類和藻類毒性試驗。

（1）實驗用魚：選擇有區(qū)域代表性、便于實驗飼養(yǎng)、對物質敏感的魚苗，如青、草、鰱及鳙四大淡水魚。體長一般小于7cm為宜。有時還可用體長小于3cm的金魚。（2）實驗條件：采用玻璃缸或白搪瓷桶。盛水量以每條2~3L水為宜，pH6.7~8.5，冷水溫度12~18℃，溫水溫度20~28℃，水溫變化±2℃，水中溶解氧不能低于4mg/L，可用清潔河水、湖水或放置3天的自來水。37第37頁/共104頁38第38頁/共104頁（3）LC50測定1）確定魚全活和全致死量：方法同哺乳動物，也從文獻中查閱與受試物的類似物的LD50(LC50)，做預試驗，確定全致死量和全活劑量。2）以此濃度范圍，按“等對數(shù)間距”確定5~7個濃度組。每組10~20尾魚，染毒48~96h。染毒剛開始8h內經(jīng)常觀察，以后作24、48、72和96小時定期觀察，記錄中毒反應和死亡時間。（實驗期間注意保持水體溶解氧、pH、水溫的穩(wěn)定，并立即取出死魚）。3）根據(jù)24、48和96h各組魚的死亡數(shù)，計算LC50。39第39頁/共104頁（二）亞慢性毒性試驗（Subchronictoxicitytest）人類接觸的環(huán)境污染物水平通常低于急性中毒劑量或濃度，為了得到更接近實際情況的毒作用資料，需進行亞慢性和慢性毒性試驗。在較長時期內（約動物生命周期的1/30~1/20），使動物每日或反復多次染毒所進行的實驗。目的是為對毒物的毒作用機理、靶器官和最大無作用劑量或中毒閾值作出估計。

40第40頁/共104頁1、動物選擇（1）一般選用對毒物敏感的動物種和品系，且應與慢性毒性作用試驗中預計使用的動物相同。（2）要求選擇兩種試驗動物，嚙齒類和非嚙齒類各一種，嚙齒動物常用鼠和兔，非嚙齒常用狗和貓。這樣可更全面了解受試物的毒草效應。41第41頁/共104頁（3）動物大小、只數(shù)和雌雄選用健康、年幼的動物。小鼠約14~17g，大鼠50~80g，家兔和貓體重約1~2kg，狗體重為5~8Kg。各動物體重不應超過組平均體重的±20%。大鼠各組不少于20只，兔、貓和狗較大動物不少于4~6只。雌雄各半。

42第42頁/共104頁2、染毒劑量和實驗期限（1）染毒劑量:一般用LD50或LC50的1/80~1/50作為亞慢性試驗劑量，也設三個劑量組。1）高劑量組：能引起明顯的中毒反應，但又不引起很多動物死亡為高劑量組。2）低劑量組：不引起任何中毒反應為低劑量組。3）中間劑量組：介于二者之間。（2）實驗期限:試驗期限隨目的和要求或動物大小而異。大鼠可90天，較大動物可4~6月。43第43頁/共104頁3、染毒途徑

主要經(jīng)胃腸道、呼吸道和皮膚接觸。注意：染毒途徑應與預期進行的慢性毒性作用試驗相一致。4、指標觀察與檢查：3個（1）綜合指標觀察：1）觀察動物的一般活動、癥狀和死亡情況。2）每周稱重一次，記錄飼料或飲水量，計算生長率（各組每周攝入食量與體重增加量之比）。3）各臟器鮮重與單位體重的比重（臟器系數(shù)）。44第44頁/共104頁（2）血液及生化檢查：主要指血清、肝和腎功能檢驗。常規(guī)項目包括血紅蛋白、紅、白細胞數(shù)、血小板數(shù)、谷草轉氨酶、血清尿素氮等。（3）病理組織學檢查：尸檢死亡和瀕死的動物，以及實驗結束后的被處死的動物。主要對肝、腎、睪丸等器官進行檢查。必要時還需進行組織化學和電鏡檢查。45第45頁/共104頁5、試驗評價對受試物的主要毒作用、靶器官和最大無作用劑量及中毒閾劑量作出初步估價，并為進一步開展慢性毒性試驗提供依據(jù)。

46第46頁/共104頁（三）慢性毒性試驗(哺乳動物)（Chronictoxicitytest）以低劑量外來化合物，長期與試驗動物接觸，觀察其對試驗動物所產(chǎn)生的生物學效應的試驗。目的是確定最大無作用劑量，為制訂人體每日允許攝入量(ADI，Allowabledailyintake)和最高容許濃度(MAC，Maximumallowableconcentration)提供毒理學依據(jù)。有哺乳動物、水生生物慢性毒性試驗。

47第47頁/共104頁1、試驗動物和分組1）試驗動物的年齡應低于亞慢性試驗。一般選用斷奶動物，如出生后3周的小鼠，體重約10~12g，出生后3~4周的大鼠，體重50~70g。2）試驗動物雌雄各半。其它與亞慢性試驗相同。48第48頁/共104頁2、染毒劑量和實驗期限根據(jù)亞慢性試驗，取其最低中毒劑量的1/10、1/20和1/50或LD50的1/100~1/20中取3~4個劑量作為慢性試驗劑量。（1）高劑量組：能引起明顯的中毒反應為高劑量組。（2）低劑量組：不引起中毒反應為低劑量組。（3）中間劑量組：介于二者之間。試驗期限：一般1~12月，若是致癌實驗則需18~24月。49第49頁/共104頁3、染毒途徑

經(jīng)胃腸道、呼吸道和皮膚接觸同亞慢性試驗4、觀察指標基本同亞慢性試驗，此外：（1）在試驗的第1個月，每周稱體重一次，在4~6個月期間，每2周稱體重一次，以后每4周稱體重一次。（2）每2月進行一次血液及其它生長指標(生長率、臟器系數(shù))測定。（3）對病理檢查作半定量評定，即隨染毒時間的延長，器官形態(tài)結構會發(fā)生變化，需根據(jù)病變程度加以分級評分。

50第50頁/共104頁51第51頁/共104頁5、試驗評價:評價受試物在低劑量長時間接觸有機體時所引起的毒性作用。有2個方面：1）依據(jù)敏感觀察指標，出現(xiàn)異常的最小閾劑量，找出該受試物的慢性毒作用的最大無作用劑量，為受試物能否可被應用或為制訂其在環(huán)境中的衛(wèi)生標準，提供依據(jù)。2）通過對動物的一般觀察及其對各臟器的病理學檢查，對受試物的致癌性評定提供依據(jù)。52第52頁/共104頁（四）蓄積毒性試驗1、低于中毒閾劑量的外來化合物，反復多次地與機體持續(xù)接觸，經(jīng)一定時間后使機體出現(xiàn)明顯的中毒表現(xiàn)，即為蓄積毒性作用(Cumulativetoxicityaction)。

（1）物質蓄積：環(huán)境污染物不斷進入有機體，若吸收量大于排出量，使其在體內的量逐漸積累增多。

（2）功能蓄積：不斷進入有機體的污染物反復作用于機體，引起機體一定結構或功能的變化，并逐漸累積加重，最后導致出現(xiàn)損害作用。53第53頁/共104頁2、試驗方法（1）蓄積系數(shù)法（CumulativeCoefficientmethod）

蓄積系數(shù)（CumulativeCoefficient）：指多次給受試物后，引起50%受試動物出現(xiàn)某種毒效應的總劑量()，與一次給受試物后引起50%受試動物出現(xiàn)同一毒效應的劑量（）的比值。比值愈大，說明引起50%動物出現(xiàn)某種毒效應的使用劑量較大，藥物代謝作用強，而蓄積作用較小，反之，表示蓄積作用愈強。54第54頁/共104頁

55第55頁/共104頁有兩種實驗方法測定K1）固定劑量每天連續(xù)染毒法對受試動物以1/10~1/20LD50的固定劑量，每天進行染毒一次，觀察記錄動物死亡情況。當染毒累計達5個LD50以上時，若受試動物死亡數(shù)未超過半數(shù)，此時的蓄積系數(shù)已大于5，表明該受試動物的蓄積作用不明顯。

56第56頁/共104頁2）劑量定期遞增染毒法取一組受試動物，每天染毒一次，以4天為一期，開始的第一期每天染毒劑量為1/10LD50,隨后染毒劑量每隔4天按1.5倍遞增一次。

57第57頁/共104頁每天記錄動物的死亡情況，若連續(xù)染毒已達20天，此時,每天的染毒劑量0.5LD50(=1.54×LD50/10)，累計總劑量達[(1+1.5+1.52+1.53+1.54)×4×LD50/10]=5.30LD50。如果受試動物死亡未達到50%,則表示該受試物的蓄積作用不明顯，試驗可停止。如果受試動物出現(xiàn)死亡達50%，就可算出染毒系數(shù)K。58第58頁/共104頁（2）20天蓄積試驗法按的LD50的1/20、1/10、1/5、1/2和0隨機分成5組，每天對動物進行染毒，連續(xù)20天，各組總劑量分別為0、1、2、4、10LD50。觀察停藥7天內的死亡情況。1）如1/2LD50組有死亡，且各劑量組呈劑量-反應關系，則受試動物有較強的蓄積作用。2）若1/20LD50組有死亡，且各劑量組呈劑量-反應關系，則為中等蓄積作用。3）若1/20LD50組無死亡，且各劑量組無劑量-反應關系，則為無明顯蓄積作用。

59第59頁/共104頁（3）受試物生物半減期測定法

生物半減期（T1/2）：指一種外來化合物在體內的量或濃度下降到原來濃度或量的一半所需的時間。T1/2越大，表明在體內存留時間越長，蓄積作用越大。測定方法：機體接觸污染物后，在間隔一定時間內分別測定血液、尿液、器官組織中該物質的濃度，然后求出T?。

（y1和y2分別是t1和t2時間測得該物質的濃度）60第60頁/共104頁

第三節(jié)生物致突變、致畸和致癌效應檢測一、生物致突變1、突變：生物體的遺傳物質發(fā)生了基因結構的改變稱為突變（mutation）?？煞譃榛蛲蛔兒腿旧w突變兩大類，此兩類突變本質上無差異，只是染色體突變可憑光學顯微鏡觀察。

61第61頁/共104頁2、突變意義（1）農(nóng)業(yè)作物育種：在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，農(nóng)作物就是通過定向突變篩選獲得優(yōu)良品種。（2）從理論上講，突變可能會出現(xiàn)有益的后果，但由于概率極小，且無法鑒別和控制，所以，外來化學物對人類引起的致突變可能有很大的潛在危險。所以，從毒理學角度，突變一般認為是外來化合物毒性作用的表現(xiàn)。62第62頁/共104頁3、致突變試驗試驗方法致突變試驗：可分基因點突變試驗、染色體畸變試驗和DNA損傷試驗等，可在活體或體外進行。有（1）體外基因突變試驗，（2）細胞遺傳學實驗，（3）體內基因突變試驗，（4）DNA損傷試驗等。

63第63頁/共104頁（一）體外基因突變試驗（Invitromutationtest）

1、鼠傷寒沙門氏菌試驗法（1）基本原理

將一種營養(yǎng)缺陷型如不能合成組氨酸的鼠傷寒沙門氏菌和化學致突變物接觸，若此化合物是致突變性的，則可使此突變微生物發(fā)生回復突變，重新成為野生型，而能在不含或少含His的培養(yǎng)基中生長。據(jù)此鑒定化合物的致突變作用。為使受試物在體外測試中獲得同活體類似的代謝活性，在培養(yǎng)基中常加入哺乳動物肝細胞的微粒體和受氫系統(tǒng)。64第64頁/共104頁（2）方法優(yōu)缺點優(yōu)點：方法簡單；快速，一般在48h內可得出結論；費用低；靈敏，檢測結果與動物致癌性相符率達90%。缺點：1）微生物的遺傳信息含量低，僅為哺乳動物的1/6。2）微生物DNA修復系統(tǒng)沒有哺乳動物復雜而精巧。3）微生物無免疫功能。4）對于不在肝臟代謝轉化的化合物，如蘇鐵素，不能檢測其突變性。65第65頁/共104頁2、哺乳動物體細胞株突變試驗基本原理：有些哺乳動物突變細胞株系，當與化學致突變物接觸后會發(fā)生回復突變，代謝發(fā)生改變，依此確定毒物的致突變性。常用細胞突變系：中國地鼠肺細胞V79、中國地鼠卵巢細胞株CHO和小鼠淋巴瘤L5178Y細胞株等。66第66頁/共104頁（1）肺細胞V79和卵巢細胞株CHO細胞突變株系由于嘌呤堿類似物如6-巰基嘌呤可抑制DNA的合成，正常細胞株系生長會受到抑制。而V79和CHO細胞突變株系由于缺乏次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶(HGPRT)，當在培養(yǎng)基中加入某些嘌呤堿類似物如6-巰基嘌呤等時，它們仍能生長。當V79和CHO細胞突變系與這些嘌呤堿類似物接觸后，會發(fā)生回復突變成正常株，生長受到抑制，說明發(fā)生了致突變。

67第67頁/共104頁

（2）小鼠淋巴瘤L5178Y細胞株

此細胞株系缺乏胸苷激酶(TK),如在培養(yǎng)基中加入細胞毒素5-溴脫氧尿苷，仍能生長。但當此種細胞系與致突變物接觸后會發(fā)生回復突變，又轉化為正常細胞，而恢復對此毒素的利用，而抑制其生長。說明發(fā)生了致突變。68第68頁/共104頁（二）細胞遺傳學實驗(CytogeneticsTest)1、染色體畸變試驗(Chromosomeaberrationtest)利用光學顯微鏡直接觀察生物體細胞在受致突變物作用后,染色體數(shù)目和結構的變化。

(1)離體試驗：常用中國地鼠卵巢細胞株CHO（缺乏次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶)和人類外周血（指進入血液循環(huán)的血液，即平時所采血），檢測卵巢細胞株CHO和人類淋巴細胞的染色體變化。

(2)體內試驗：常檢查骨髓細胞、胸腺、脾、精原細胞的染色體的畸變。

69第69頁/共104頁CHO細胞系或人類淋巴細胞染色體畸變分析1）選用細胞培養(yǎng)液如DMEM、RPM或1640任一種，加入化學致突變物，在3℃下，培養(yǎng)CHO（缺乏次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶)細胞24h或人類淋巴細胞為72h。2）在收獲細胞前2h，向培養(yǎng)液中加入秋水仙堿，以終止細胞分裂，使細胞分裂同步于分裂中期。3）離心得到沉淀細胞，然后制片鏡檢有無染色體畸變。4）觀察染色體有無斷裂、缺失、易位、形成環(huán)狀結構等畸變，以及出現(xiàn)多處斷裂的百分率。70第70頁/共104頁71第71頁/共104頁染色體畸變結果評定

確定受試物能否引起染色體損傷或數(shù)目的改變，以及要確定有這些改變的細胞能否存活一個細胞周期以上。1）一些小缺失和相互易位的畸變，因其可能長期存在而比大缺失有更大的危險性。2）染色體斷裂、缺失、易位、形成環(huán)狀結構等是染色體開放性斷裂的結果，但也可能是斷裂后修復的結果。3）有些化合物只作用于細胞分裂某一時期，故試驗時要注意收獲時間。

72第72頁/共104頁2、微核試驗（Micronucleustest）（1）微核形成

核膜受損：在受化學致突變作用下，若核膜受損，核物質會向外突出延伸，形成一個或幾個規(guī)則圓形或橢圓形小體，稱微核。

紡錘體受傷：由于紡錘體受傷或染色體的無著絲點斷裂，受傷染色體在分裂后期仍停留在細胞質，而形成微核結構。有動物細胞微核率試驗、細胞培養(yǎng)微核試驗和蠶豆根尖微核試驗等。73第73頁/共104頁74第74頁/共104頁

（2）動物細胞微核率試驗

1）骨髓嗜多染紅細胞微核試驗以頸椎脫臼處死動物，用小牛血清將骨髓細胞沖洗入離心管。離心，棄去上清液，留少量血清懸浮細胞后進行涂片。甲醇固定、Giemsa染色（核染色）后進行觀察。每只動物要求觀察計數(shù)1000個嗜多染紅細胞，求出出現(xiàn)微核細胞的頻率。75第75頁/共104頁2）外周血淋巴細胞微核試驗取人或動物的外周血2~3滴(骨髓外血），于盛有1.5mlTris-NH4Cl緩沖液的離心管中，混勻后置于37℃下保溫5h，使紅細胞溶解。取5滴溶解液，混勻后離心，棄上清液，于沉淀物中再加5ml固定液，放置10min后離心，棄上清液，取沉淀物涂片，鏡檢。

76第76頁/共104頁二、致畸效應（一）基本概念1、致畸作用（Teratogenesis）

胚胎的細胞分化和器官形成不正常，而造成組織器官上的缺陷，并出現(xiàn)肉眼可見的形態(tài)結構異常稱畸形。致畸物通過母體作用于胚胎，引起胎兒畸形的現(xiàn)象稱致畸作用。目前已知1000多種環(huán)境因素可引起動物及人的畸胎。60年代初，孕婦因服用“反應?！倍鴮е陆f名畸形兒。許多國家對一些藥物、農(nóng)藥、食品添加劑、防腐劑以及工業(yè)化學品規(guī)定應經(jīng)過致畸試驗。

77第77頁/共104頁78第78頁/共104頁2、致畸作用的毒理學特點(1)不同發(fā)育階段的胚胎對致畸物有不同的敏感性，一般在胚胎形成早期，對致畸物最敏感。致畸物在接觸胚胎時，可因胚胎處于不同發(fā)育階段而引起不同的畸形。(2)不同種系的動物，由于代謝和胎盤結構的不同，對致畸物呈現(xiàn)不同的敏感性。（3）致畸作用劑量-反應曲線很陡，最大無作用劑量與引起胚胎死亡最低劑量僅相差2~3倍。

79第79頁/共104頁3、化學致畸作用機理(1)母體正常代謝過程受到破壞致畸物使母體正常代謝過程受到破壞，使子代細胞在生物合成過程中缺乏必需的物質，而影響胚胎的正常發(fā)育。(2)生殖細胞分裂過程的障礙致畸物可干擾細胞的分裂過程,引起生殖細胞減數(shù)分裂或合子的細胞有絲分裂過程的障礙,導致細胞死亡,胚胎出現(xiàn)畸形。

80第80頁/共104頁(3)突變引起胚胎體細胞發(fā)育異常致畸物可使胚胎的體細胞發(fā)生突變,有時還可引起酶分子的氨基酸組成發(fā)生改變,而引起代謝功能的缺陷,胚胎致畸。(4)通過抑制或破壞重要代謝酶的活性起作用這些致畸物雖不影響生殖細胞減數(shù)分裂或細胞有絲分裂或誘發(fā)染色體突變，但可通過抑制或破壞對細胞生長分化較為重要的酶的活性,如DNA聚合酶、核糖核苷酸還原酶等活性，而影響胚胎的正常發(fā)育。81第81頁/共104頁（二）試驗方法致畸試驗：是檢測某些環(huán)境污染物能否通過妊娠母體引起胚胎畸形的一種動物試驗法。1、動物選擇要求：(1)選擇與人類代謝相似的動物，并具與人類相似的胎盤結構，如胎盤層數(shù)和厚度。(2)妊娠期短,利于觀察。(3)產(chǎn)仔多,以獲得足夠的標本。(4)此外,還應符合試驗動物的一般要求,如體型小、易馴服、繁殖以及價廉。一般選擇大鼠和小鼠和家兔。82第82頁/共104頁2、劑量設定(1)受試物劑量的大小，應根據(jù)試驗時給予受試物的次數(shù)及連續(xù)時間的長短而定，若試驗期間只給一次，此時劑量稍大，反之則小。（2）高劑量組，以不使母體產(chǎn)生明顯中毒而導致流產(chǎn)為限度。一般可以LD50的1/3~1/2為最高劑量組，LD50的1/30~1/100為低劑量組。（3）試驗動物數(shù)：均以經(jīng)交配確定已受精的雌性動物為計數(shù)對象，每組不少于15~20只，家兔7~8只。83第83頁/共104頁3、受試動物的處理（1）動物受孕：選擇一批性成熟，未交配過的雌鼠和雄鼠，以一雄一雌或二雌一雄比例，同籠過夜，次日清晨檢查雌鼠是否受孕。查到日為孕期0天，次日為第一天，孕期約1月。（2）藥物處理方法和時間：一般多采用灌胃方法，在胚胎敏感期給藥。若過早給予可影響受精卵著床，過遲則對發(fā)育成熟的胚胎往往不能顯示致畸作用。84第84頁/共104頁4、試驗動物的解剖（1）解剖時間：預計自然分娩前1~2天為宜，以防止胎仔自然分娩后被吃或被咬傷?？闪?/4的動物待其自然分娩，并將胎仔喂養(yǎng)到斷奶，進行仔細觀察和檢查。（2）解剖檢查1）胎仔外部檢查：如活胎數(shù)、早、晚期死胎數(shù)和吸收胎數(shù)；對活胎要檢查性別、體重、身長、尾長及全窩胎盤總重量等。85第85頁/共104頁2）胎仔的骨骼檢查先用75%~90%乙醇-1%KOH固定至肌肉透明;再用茜素紅染色2~5d，至骨骼染成桃或紫紅色;再經(jīng)透明處理后，檢查骨骼的形態(tài)、大小、數(shù)量有無異常及骨化程度。

3）胎仔內臟檢查經(jīng)外觀檢查后的活胎仔，按隨機法，將胎仔數(shù)的1/2~1/3置于Bouin氏液中固定1~2周后，取內臟和軟組織如腭裂、腎等，用徒手切片法制片，觀察結構變化。P126，表3-11（外觀畸形）；表3-12（骨骼畸形）；表3-13（臟器畸形）。86第86頁/共104頁5、致畸作用的評價為科學的評價受試物有無致畸作用。應注意：(1)試驗結果中出現(xiàn)的畸形率高低,須從出現(xiàn)畸胎的孕仔率、胎仔發(fā)生畸形率、單項畸形率、總畸形率等多方面進行統(tǒng)計綜合分析；比較試驗組與對照組有無差異；有無劑量-反應關系；而后才能作用評定。(2)同種動物重復試驗和多種動物試驗的結果一致,才能得出一致的結論。

87第87頁/共104頁(3)生物在正常情況下也有變異，有時難以區(qū)分。但一般致畸率高、有特異性、且有劑量-效應或反應關系，應作致畸論。(4)不同種系的動物對同種致畸物的致畸作用可能有差異。當在其它動物上試驗的結果，和從臨床觀察、流行病學調查等如果也獲得同樣的結果，才能下正確的結論。

88第88頁/共104頁三、致癌效應（一）基本概念目前的中國癌癥診斷率6人/min，其中有1人得肺癌。據(jù)估計人類腫瘤有80%~90%與環(huán)境因素有關，其中化學因素有關者占80%~85%，因此，化學致癌作用極其重要。化學物質（有機、無機、合成）引起腫瘤的過程稱化學致癌作用。能誘發(fā)腫瘤的化學物質稱化學致癌物。89第89頁/共104頁癌細胞的主要特征1、喪失細胞接觸性生長抑制特性，惡性增長不死細胞。2、形態(tài)顯著改變的變態(tài)細胞。3、細胞膜上的糖蛋白減少，易在體內分散和轉移。為粘著性降低的擴散細胞。

90第90頁/共104頁癌變誘發(fā)因子：1、物理致癌因子：紫外線、X射線、輻射等。2、化學致癌因子：1）無機物：砷化物、鉻化物、鎘化物、石棉等。2）有機物：聯(lián)苯胺、烯環(huán)烴、亞硝胺、黃曲霉毒素等。3、病毒致癌因子：肝炎病毒：肝癌，Rous肉瘤病毒91第91頁/共104頁

世界衛(wèi)生組織下屬的“國際癌癥研究中心”對900多個因素進行評估，公布116種明確致癌物和66種可能致癌物（2016年搜狐網(wǎng)）。其中，明確致癌物中有：

（1）食品類：酒精、煙草、發(fā)霉谷物或堅果（黃曲霉素）、檳榔果、烤熏食品（苯并芘）、火腿、培根等加工類肉食、自來水中的亞硝基二甲胺。

（2）環(huán)境類：空氣污染（PM2.5)、電離輻射、紫外輻射、劣質裝修建材：苯和甲醛

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