細菌內(nèi)毒素檢測技術(shù)與應用

細菌內(nèi)毒素檢測技術(shù)與應用第1頁，共69頁，2023年，2月20日，星期二一、細菌內(nèi)毒素檢測技術(shù)的應用與進展1、熱原2、歷史回顧-鱟試劑與細菌內(nèi)毒素檢查3、BET的發(fā)展趨勢與特點

第2頁，共69頁，2023年，2月20日，星期二1、熱原

--熱原是指臨床上引起哺乳動物發(fā)熱反應的物質(zhì)。--Webster將熱原定義為“致熱劑”。

第3頁，共69頁，2023年，2月20日，星期二1)早期的熱原研究

–靜脈療法的研究與熱原的研究密切相關–在18,19世紀有很多關于靜脈療法的報道,所有病人在注射后都伴隨有發(fā)熱反應,當時的醫(yī)生都深信發(fā)熱對人體有益–1912年,Hort和Penfold闡明注射發(fā)熱的真正本質(zhì),將細菌分為熱原和非熱原兩種:

A、革蘭氏陰性細菌為熱原細菌B、革蘭氏陽性細菌為非熱原細菌

–他們推斷出所有的注射發(fā)熱都是由革蘭氏陰性細菌產(chǎn)生的可濾過的,熱穩(wěn)定的物質(zhì)導致的

第4頁，共69頁，2023年，2月20日，星期二2)熱原的檢測–1941年,美國USP,FDA和NIH(美國國家衛(wèi)生研究所)邀請了14個制藥廠商參與第一次熱原的協(xié)作研究。–1942年,美國藥典第一次收載熱原檢查法

該方法是將一定量的供試品通過靜脈注入家兔體內(nèi),在規(guī)定時間內(nèi),觀察家兔體溫升高的情況來判定供試品中所含熱原量是否符合規(guī)定。3)細菌內(nèi)毒素檢查(BET)

–利用鱟試劑來檢測由革蘭氏陰性菌產(chǎn)生的細菌內(nèi)毒素,用以判斷供試品中細菌內(nèi)毒素含量是否符合規(guī)定

第5頁，共69頁，2023年，2月20日，星期二2、歷史回顧——鱟試劑與細菌內(nèi)毒素檢查1)國際

–1956年,美國科學家FredericBang發(fā)表論文《鱟的一種細菌性疾病》,闡述了細菌內(nèi)毒素使鱟血凝固的現(xiàn)象.隨后,Bang和Levin發(fā)明了鱟試劑。

–1980年,FDA發(fā)表使用鱟試劑檢查人用和獸用注射藥終成品內(nèi)毒素的準則;美國藥典20版(USPXX)收載BET法。–1989年英國藥典收載BET法–1991年日本藥局方收載BET法。

第6頁，共69頁，2023年，2月20日，星期二

–1999年,USPXXIV版規(guī)定670種藥品用BET法檢查,保留熱原檢查的藥品約20種。–2000年,國際調(diào)和委員會使USP,EP和JP達成《BET的國際調(diào)和案》,統(tǒng)一的BET法收載于USPXXIV版NF19的第二增補本中,并于2001年1月1日生效

第7頁，共69頁，2023年，2月20日，星期二2)國內(nèi)

–1983年,由11個單位參加的衛(wèi)生部鱟試劑研究協(xié)作組的成立。–1988年,衛(wèi)生部頒布《細菌內(nèi)毒素檢查法》和鱟試劑標準–1991年,衛(wèi)生部部頒標準規(guī)定4種藥品可使用細菌內(nèi)毒素檢查法。–1993年,中國藥典(CP)九零版第二增補本收載BET法。–1995年版CP規(guī)定13個品種使用BET法。

第8頁，共69頁，2023年，2月20日，星期二

–2000年,CP2000版細菌內(nèi)毒素檢查品種增至69種;附錄《細菌內(nèi)毒素檢查法應用指導原則》中收錄了BET定量法。–2005年,CP2005版細菌內(nèi)毒素檢查品種增至168種;BET法正式收載光度測定法。

第9頁，共69頁，2023年，2月20日，星期二3、BET發(fā)展趨勢與特1)BET技術(shù)的發(fā)展趨勢

(1)細菌內(nèi)毒素檢查取代熱原檢查

-BET法所具有的優(yōu)點:快速,靈敏,可標準化等

(2)走向統(tǒng)一的BET法-WHO實現(xiàn)了內(nèi)毒素的國際標準品(IS)的效價(IU)與各國內(nèi)毒素標準品的效價(EU)的統(tǒng)一,即1IU=1EU。

第10頁，共69頁，2023年，2月20日，星期二2)BET技術(shù)及應用發(fā)展的特點

(1)BET方法呈多樣化

–凝膠法

–比濁法-動態(tài)比濁法-終點比濁法–比色法-動態(tài)比色法-終點比色法

(2)BET趨向自動化

–凝膠法恒溫設備方面,干式恒溫儀器逐步取代水浴恒溫箱

–定量BET試管式定量檢測儀酶標板式定量檢測儀全自動的BET系統(tǒng)專用的數(shù)據(jù)軟件

第11頁，共69頁，2023年，2月20日，星期二3)BET試劑的發(fā)展

–鱟試劑的靈敏度越來越高

凝膠法最高達0.0075EU/ml,商品試劑0.015EU/ml定量法高達0.001EU/ml4)BET應用的領域越來越廣

–藥品檢驗–藥品生產(chǎn)過程質(zhì)控–臨床應用:輔助診斷–其它領域:食品衛(wèi)生,環(huán)境保護

第12頁，共69頁，2023年，2月20日，星期二二、細菌內(nèi)毒素的理論基礎1、細菌內(nèi)毒素2、鱟試劑3、BET檢查用水4、BET檢查程序5、5,2005年版細菌內(nèi)毒素檢查法6、相關參數(shù)的計算7、試驗相關知識

第13頁，共69頁，2023年，2月20日，星期二1、細菌內(nèi)毒素

1)化學成分及特性

–革蘭氏陰性細菌細胞壁的產(chǎn)物

–是高分子量脂多糖復合物(LPS)

單體分子量介于10,000至20,000道爾頓典型地以100,000至500,000道爾頓的聚合體形式存在

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(1)特性

-致熱性：內(nèi)毒素作用于人體細胞,使之釋放內(nèi)原性熱原,再刺激下丘腦體溫調(diào)節(jié)中樞,引起發(fā)熱反應。

-耐熱性：需要在250攝氏度干熱30分鐘才能徹底滅活。

-分子極性：多糖鏈有親水性,脂肪鏈具有疏水性,在水中呈不均勻分布。

-酸堿性：與強酸強堿水解反應。

-鱟反應性：能與鱟試劑發(fā)生多級酶促反應,形成凝膠。除上述性質(zhì)外,LPS還有許多其它的生物活性

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(2)化學結(jié)構(gòu)

–含有3個截然不同的區(qū)域

O-特異側(cè)鏈

核心多糖

類脂A

第16頁，共69頁，2023年，2月20日，星期二2)細菌內(nèi)毒素與熱原的關系

–內(nèi)毒素是熱原之一種。

–醫(yī)藥工業(yè)接受的觀點是,內(nèi)毒素是目前醫(yī)藥工業(yè)中最普遍和最主要的外源性熱原,控制內(nèi)毒素污染就等于控制熱原污染。3)標準內(nèi)毒素與環(huán)境內(nèi)毒素

–標準內(nèi)毒素

–環(huán)境內(nèi)毒素(主要檢測對象)

第17頁，共69頁，2023年，2月20日，星期二4)標準內(nèi)毒素溶液的制備

–中國藥典2005年版BET法要求,將細菌內(nèi)毒素國家標準品用BET檢查用水溶解后,需在旋渦混合器上混勻15分鐘,以后每稀釋一步均應在旋渦混合器上混合30秒鐘.其他國家的BET法也有類似的要求.

–具有兩極活性的內(nèi)毒素分子在水中呈現(xiàn)不均勻分布

第18頁，共69頁，2023年，2月20日，星期二5)內(nèi)毒素的清除方法

(1)沖洗(2)蒸餾

(3)反滲透

(4)超濾(5)活性炭吸附6)內(nèi)毒素的滅活方法

(1)酸/堿水解(2)氧化(H2O2)(3)干熱(180℃2h或250℃30min)

第19頁，共69頁，2023年，2月20日，星期二2、鱟試劑

1)鱟試劑的分類

(1)種類：美洲鱟試劑和中國鱟試劑；(2)檢測方法：凝膠法和光度法；(3)特異性：普通和特異性鱟試劑。

第20頁，共69頁，2023年，2月20日，星期二2)鱟試劑的規(guī)格

(1)單次實驗試劑(2)多次試驗試劑3)鱟試劑的質(zhì)量標準

(1)靈敏度

●定義：在細菌內(nèi)毒素檢查法規(guī)定的條件下，能使鱟試劑產(chǎn)生陽性的標準內(nèi)毒素的最低濃度，單位為EU/ml。常用的鱟試劑的靈敏度有：0.25、0.125、0.03。

(2)自身凝集：陰性對照在37度4h不產(chǎn)生陽性反應。

第21頁，共69頁，2023年，2月20日，星期二4)鱟試劑的使用

(1)使用前，應將鱟試劑置于室溫環(huán)境下使其達到室溫后再復溶使用；(2)復溶鱟試劑后，應避免強烈振動產(chǎn)生泡沫；

(3)由于鱟試劑與內(nèi)毒素凝集反應的不可逆性，反應過程中必須避免反應試管的振動造成假陰性；(4)對鱟試劑有過敏癥者應小心使用，小心鱟試劑粉末逸出。

第22頁，共69頁，2023年，2月20日，星期二5)鱟試劑與內(nèi)毒素的反應機理

第23頁，共69頁，2023年，2月20日，星期二3、細菌內(nèi)毒素檢查用水（BET水）

定義

(1)2010年藥典，BET水系指內(nèi)毒素含量小于0.015EU/ml（用于凝膠法）或0.005EU/ml（用于光度測定法）且對內(nèi)毒素試驗無干擾作用的滅菌注射用水；(2)美國藥典要求的BET水是指與所使用的鱟試劑不發(fā)生反應的滅菌注射用水或其它水。

第24頁，共69頁，2023年，2月20日，星期二4、細菌內(nèi)毒素檢查和程序

1)驗證實驗

(1)凝膠法；I、靈敏度復核試驗；II、干擾實驗(2)光度法；I、標準曲線可靠性驗證；II、干擾實驗

第25頁，共69頁，2023年，2月20日，星期二2)檢查法

(1)凝膠法；I、凝膠限量試驗；II、凝膠半限量試驗(2)光度法；I、動態(tài)法（比濁法、比色法）；II、終點法（比濁法、比色法）；

第26頁，共69頁，2023年，2月20日，星期二三、相關計算1、內(nèi)毒素限值2、最大有效稀釋倍數(shù)3、最低有效濃度4、樣品稱稀釋過程中加液量的計算

第27頁，共69頁，2023年，2月20日，星期二1、內(nèi)毒素限值

--一般按公式L=K/M來確定。A.L為供試品的細菌內(nèi)毒素限值；B.K為人每公斤體重每小時可接受的最大內(nèi)毒素劑量，注射劑K=5EU/(kg*h)C.M為人每公斤體重每小時的最大供試品劑量。人均體重按60kg計算。

第28頁，共69頁，2023年，2月20日，星期二例子1：注射用頭孢曲松鈉舒巴坦鈉，成人最大劑量為1500mg/次。例子2：注射用人頭孢孟多酯鈉，成人每日劑量為2.0~8.0g，分3~4次給藥，一日最高劑量不超過12g.

第29頁，共69頁，2023年，2月20日，星期二2、最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）

--供試品MVD按下式計算：MVD=cL/λA.C為供試品濃度，其中當L以EU/ml表示時，c為1.0ml/ml；B.M為內(nèi)毒素限值；C.λ為鱟試劑的靈敏度（凝膠法）或標準曲線最低點濃度（光度法）。

第30頁，共69頁，2023年，2月20日，星期二例子：如果使用鱟試劑靈敏度為0.25EU/ml，注射用頭孢曲松鈉舒巴坦鈉（濃度為10mg/ml，L=0.2EU/mg）的最大有效稀釋倍數(shù)為：

第31頁，共69頁，2023年，2月20日，星期二3、最低有效濃度（MVC）

MVC=λ/LA.λ為鱟試劑的靈敏度（凝膠法）或標準曲線最低點濃度（光度法）；B.L為內(nèi)毒素限值；

第32頁，共69頁，2023年，2月20日，星期二例子：如果用鱟試劑靈敏度為0.25EU/ml，注射用頭孢曲松鈉舒巴坦鈉的最低有效濃度為：

第33頁，共69頁，2023年，2月20日，星期二4、樣品稀釋過程中加液量的計算稀釋過程中，假設從溶液S1?。╔）ml溶液稀釋（n）倍至S2，加液量為（y）,則滿足

Y=（n-1）*x例子：如從溶液S1取0.5ml稀釋3.8倍至S2,則加液量為：Y=（3.8-1）*0.5=1.4（ml）,即0.5ml的S1加1.4ml稀釋液即得S1的3.8倍稀釋液S2。

第34頁，共69頁，2023年，2月20日，星期二5、計算A、2010版藥典：紫杉醇注射液細菌內(nèi)毒素檢查：

取本品，加內(nèi)毒素檢查用水稀釋制成每1ml中含紫杉醇0.15mg或更低濃度，依法檢查每1mg紫杉醇中含內(nèi)毒素的量應小于0.40EU，問應該選用靈敏度為多少的鱟試劑來做檢測？？

第35頁，共69頁，2023年，2月20日，星期二解答：

λ=MVC*L=MVC*0.4EU/mg

藥典要求：MVC≤0.15mg/ml，

則選用鱟試劑靈敏度λ

≤0.15mg/ml*0.4EU/mg=0.06EU/ml

第36頁，共69頁，2023年，2月20日，星期二

B、注射用頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉細菌內(nèi)毒素：

取本品，用內(nèi)毒素檢查用水制成每1ml中含0.6mg的溶液，依法檢查，每1mg本品中含內(nèi)毒素的量應小于0.050EU，問應該選用靈敏度為多少的鱟試劑來做檢測？？

第37頁，共69頁，2023年，2月20日，星期二解答：

λ=MVC*L=MVC*0.050EU/mg

藥典要求：MVC=0.6mg/ml，

則選用鱟試劑靈敏度λ

=0.6mg/ml*0.050EU/mg=0.03EU/ml

第38頁，共69頁，2023年，2月20日，星期二五、凝膠法細菌內(nèi)毒素檢查技術(shù)1、凝膠法BET試驗程序2、試驗器具3、鱟試劑靈敏度復核4、干擾初篩試驗5、檢查法6、實驗相關知識及技巧

第39頁，共69頁，2023年，2月20日，星期二1、凝膠法BET試驗程序A、試驗準備；B、確定供試品的內(nèi)毒素限值；C、選擇鱟試劑D、計算最大有效稀釋倍數(shù)或最低有效濃度；E、鱟試劑靈敏度復核；F、干擾初篩實驗；G、干擾實驗；H、日常檢測

第40頁，共69頁，2023年，2月20日，星期二2、試驗器具

器具分類器具名稱稀釋容器無熱原小試管移液器具移液槍(1000ul、200ul)無熱原吸嘴(1000ul、200ul)孵育儀器恒溫水浴鍋

混合食品渦旋混合儀其它試管架、異丙醇浸泡的無紡布、鑷子、剪刀、砂輪、標記筆、錫箔紙第41頁，共69頁，2023年，2月20日，星期二1）試驗器具的要求及處理；A、玻璃器皿需經(jīng)除熱原處理，以除去可能存在的外源性內(nèi)毒素，常用方法是玻璃器皿經(jīng)清洗后≥250℃干烤至少30min；B、塑料器械應選用標明無內(nèi)毒素并且對試驗無干擾的器械；2）孵育反應儀器反應溫度的要求（37±1℃）

第42頁，共69頁，2023年，2月20日，星期二3、鱟試劑標示靈敏度的復核試驗1）實驗目的A、驗證實驗的條件是否滿足BET實驗的要求；B、驗證實驗人員的操作技能是否滿足BET實驗的要求；C、驗證實驗所用試劑是否滿足BET實驗的要求；D、驗證實驗所用器具是否滿足BET實驗的要求；

第43頁，共69頁，2023年，2月20日，星期二2）實驗步驟A、開啟恒溫儀器預熱；B、標準內(nèi)毒素溶液的制備；C、鱟試劑的準備；D、加樣及恒溫反應；E、結(jié)果判斷；F、數(shù)據(jù)處理。

第44頁，共69頁，2023年，2月20日，星期二3）操作步驟示意圖

內(nèi)毒素毒素RSE和CSEBET水復溶混勻稀釋為2λ、λ、0.5λ、0.25λ內(nèi)毒素標準溶液旋渦混合器混合15分鐘鱟試劑TALBET水復溶混勻單次管：原安瓿多次管：反應試管輕輕轉(zhuǎn)動瓶壁搖勻每步稀釋于旋渦混合器混合30秒0.1mlTAL+0.1mlCSE（RSE），平行4管NC：0.1mlTAL+0.1mlBET水，平行2管第45頁，共69頁，2023年，2月20日，星期二37℃±1℃,60±2min結(jié)果判斷：反應管緩緩倒轉(zhuǎn)1800陽性（+）：凝膠不變形，不從管壁滑脫者陰性（-）：凝膠不能保持完整，從管壁滑脫者實驗有效：NC管全部呈陰性（--）

2.0λ管全部呈陽性（++++）

0.25λ管全部呈陰性（----）數(shù)據(jù)處理：靈敏度測定值λc＝antilg(∑X/4)X：為反應終點濃度的對數(shù)值（lg）鱟試劑靈敏度標示值λ有效：2λ≥λc≥0.5λ封口，混勻

反應終點濃度是系列濃度遞減的內(nèi)毒素溶液中最后一個呈陽性結(jié)果的濃度第46頁，共69頁，2023年，2月20日，星期二4）靈敏度復核實驗舉例A、試劑

名稱廠家規(guī)格標志效價數(shù)量TAL安度斯0.1ml/支0.25EU/ml18支CSE安度斯10EU/支10EU/支1瓶BET水安度斯5ml/瓶<0.003EU/ml10瓶第47頁，共69頁，2023年，2月20日，星期二B、標準內(nèi)毒素的制備

3.0ml3.0ml3.0ml3.0ml3.6ml1.0ml0.4ml3.0mlBET水CSE3.0ml3.0ml3.0ml15min30s30s30s30s10EU/ml1EU/ml0.5EU/ml0.25EU/ml0.125EU/ml0.06EU/ml2λ1λ0.5λ0.25λ第48頁，共69頁，2023年，2月20日，星期二C、鱟試劑的準備和加樣

0.1mlBET水0.1mlBET水0.1mlBET水0.1mlBET水0.1mlBET水0.1mlBET水0.1ml0.5EU/ml0.1ml0.25EU/ml0.1ml0.125EU/ml0.1ml0.06EU/ml加樣順序從低濃度到高濃度第49頁，共69頁，2023年，2月20日，星期二D、恒溫反應

將加樣完的鱟試劑混合液輕輕搖均（避免產(chǎn)生氣泡），放入37±1℃的恒溫器中孵育60±2min(孵育過程中避免振動影響凝膠形成)。

若恒溫裝置是水浴恒溫箱，那么在加樣后需將反應管封口，避免水蒸汽進入反應管內(nèi)造成污染。

第50頁，共69頁，2023年，2月20日，星期二E、結(jié)果判斷

陰性陽性第51頁，共69頁，2023年，2月20日，星期二靈敏度實驗符合要求的基本條件①NC（陰性對照）管全部為陰性（----）②2λ全部為陽性（++++）③0.25λ全部為陰性（----）計算：

按λc=antilg(ΣX/4)計算反應終點（最后一個呈陽性結(jié)果的濃度）的幾何平均值；

其中X為反應終點濃度的對數(shù)值；

當λc在[0.5λ~2λ]時，靈敏度驗證合格。

第52頁，共69頁，2023年，2月20日，星期二F、數(shù)據(jù)處理例子：

計算：λc=antilg{[(log0.125)+(log0.25)+(log0.25)+(log0.25)]/4}=10-0.67731749=0.210EU/ml∈[0.125,0.5]

平行管內(nèi)毒素標準溶液濃度（EU/ml）NC0.50.250.1250.061+++--2++---3++--4++--第53頁，共69頁，2023年，2月20日，星期二4、干擾初篩試驗1）目的及原理A、本試驗是檢測樣品與鱟試試劑相容性的篩選試驗，通過對一系列含2λ內(nèi)毒素濃度的樣品溶液與鱟試劑的反應，初步篩選出對鱟試驗無干擾的濃度；B、本試驗可減少干擾實驗的盲目性。

第54頁，共69頁，2023年，2月20日，星期二2）實驗步驟A、供試品限值的確定；B、供試品最大有效稀釋倍數(shù)的確定；C、試劑的選擇；D、反應溶液的制備；E、加樣與反應；F、結(jié)果判斷。

第55頁，共69頁，2023年，2月20日，星期二3）干擾初篩實驗舉例A、供試品限度；

硫酸慶大霉素（S），100ml/瓶，20000U/ml;藥典要求其限值L=0.5EU/1000U。B、最大有效稀釋倍數(shù)的確定（MVD=cL/λ）;

靈敏度λ（EU/ml）0.50.250.1250.060.03對應的MVD（倍）204080160320第56頁，共69頁，2023年，2月20日，星期二C、試劑的選擇；

為了方便試驗，干擾初篩試驗一般選擇靈敏度較低的鱟試劑作為試驗；考慮的時候還要考慮稀釋倍數(shù)，稀釋倍數(shù)越大，試驗數(shù)據(jù)越不可靠。

所以本次檢測選用靈敏度為0.25EU/ml的鱟試劑做為檢測試劑，稀釋倍數(shù)最大為40倍。

名稱廠家規(guī)格標志效價數(shù)量TAL安度斯0.1ml/支0.25EU/ml24支CSE安度斯10EU/支10EU/支1瓶BET水安度斯5ml/瓶<0.003EU/ml10瓶第57頁，共69頁，2023年，2月20日，星期二溶液AS4S8S16S32S40各2支溶液B

S4E2λ

S8E2λS16E2λ

S32E2λS40E2λ各2支溶液C

E2λ

各2支溶液DW各2支C、各反應溶液的制備；①溶液C的制備

第58頁，共69頁，2023年，2月20日，星期二②溶液A的制備

1.4ml1.4ml3.2ml0.8ml1.4mlBET水原液1.4ml15min30s30sS原液