ADC藥物的深度表征

———ADC藥物的深度表征

抗體偶聯(lián)藥物（antibody-drugconjugate，ADC）是一類通過(guò)特定的連接子將靶向單克隆抗體與高殺傷性的細(xì)胞毒性小分子藥物偶聯(lián)起來(lái)的生物藥，以單克隆抗體為載體將小分子細(xì)胞毒性藥物高效地運(yùn)輸至目標(biāo)腫瘤細(xì)胞中，起到治療的目的。

與傳統(tǒng)抗體藥相比，ADC藥物的結(jié)構(gòu)復(fù)雜度和異質(zhì)性更高，因?yàn)樘砑恿硕嘧兊挠行лd荷和連接子1。為確保藥物安全性和有效性，ADC的深度表征在其開發(fā)過(guò)程中至關(guān)重要。這不僅包括對(duì)mAb的翻譯后修飾（PTM）的鑒定和定位，還包括藥物偶聯(lián)的鑒定。由于質(zhì)譜技術(shù)的飛速發(fā)展，質(zhì)譜已經(jīng)成為ADC藥物表征中最廣泛使用的方法。完整質(zhì)量分析是用于確定小分子藥物與抗體比率（DAR）的常規(guī)方法，而對(duì)結(jié)合位點(diǎn)的深入表征，通常依賴于bottom-up的方法?，F(xiàn)在最廣泛采用的碰撞誘導(dǎo)解離（CID）技術(shù)能夠提供氨基酸序列確認(rèn)，但是這種能量比較大的碎裂技術(shù)也將有效載荷碎裂為更小的片段，從這種方法獲得的高度復(fù)雜的譜圖可能很難解析。而能量更柔和的碎裂方法可以促進(jìn)此類復(fù)雜樣品的解析，一種基于電子活化裂解（EAD）2,3的創(chuàng)新、高度可重復(fù)的碎裂方法用于分析來(lái)自商業(yè)化ADC藥物的偶聯(lián)肽。使用10Hz快速非靶向的數(shù)據(jù)依賴采集（DDA）方法采集數(shù)據(jù)，通過(guò)此工作流程，一次進(jìn)樣就可以應(yīng)用基于EAD的碎片進(jìn)行常規(guī)和高級(jí)表征。曲妥珠單抗美坦新偶聯(lián)物（T-DM1）是最早的ADC治療藥物之一，于2023年獲得FDA批準(zhǔn)用于治療人表皮生長(zhǎng)因子受體2（HER2）陽(yáng)性轉(zhuǎn)移性乳腺癌。T-DM1是由單克隆抗體曲妥珠單抗和細(xì)胞毒素美坦新（DM1）通過(guò)不可裂解連接子共價(jià)偶聯(lián)而成（圖1）。將單克隆抗體（mAb）的靶標(biāo)特異性與細(xì)胞毒性藥物的高效率相結(jié)合，可充分利用兩個(gè)方面的優(yōu)勢(shì)，最大限度地減少副作用3。T-DM1是與氨基連接，如連接在曲妥珠單抗的賴氨酸殘基的側(cè)鏈中。先前的完整質(zhì)量研究表明，T-DM1的平均DAR約為3.5.1,4。但是曲妥珠單抗中有88個(gè)賴氨酸殘基和4個(gè)N端基團(tuán)，可能會(huì)出現(xiàn)450萬(wàn)個(gè)以上的不同分子形式1。有效載荷的位點(diǎn)和結(jié)構(gòu)將直接影響藥物的功效和安全性，因此將其歸類為關(guān)鍵質(zhì)量屬性（CQA），并且需要在開發(fā)過(guò)程中進(jìn)行全面表征和嚴(yán)格監(jiān)控。

圖1.細(xì)胞毒藥物有效載荷和連接子與mAb偶聯(lián)的示意圖。T-DM1由DM1（黑色），靶向連接氨基殘基的MCC連接子（linker，藍(lán)色）和單克隆抗體組成。

本研究選擇了與ZenoEAD相結(jié)合的DDA方法。采用這種方法，不僅可以執(zhí)行常規(guī)的肽圖分析，而且EAD可以在同一針?lè)治鲋羞M(jìn)行高級(jí)表征。此外，ZenoEAD增強(qiáng)了碎片離子的檢測(cè)能力，從而正確鑒定了低豐度物質(zhì)。圖2展示了在偶聯(lián)肽SCDK[DM1]THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPK上觀察到的碎裂模式的例子。在分析中未觀察到?jīng)]有連接子和藥物或其部分的肽，表明其完全偶聯(lián)。獲得了此肽段高質(zhì)量的MS/MS譜圖，從而使該特定肽段的MS/MS序列覆蓋率達(dá)到96.6％。一個(gè)更占優(yōu)勢(shì)的碎片從m/z大于500的有效載荷產(chǎn)生（請(qǐng)見圖2中的標(biāo)記）。觀察到的有效載荷結(jié)構(gòu)的主要裂解位點(diǎn)是DM1的COO-C鍵，這種碎裂模式與先前利用CID技術(shù)產(chǎn)生的一系列小碎片的數(shù)據(jù)不同1。較大分子量的藥物碎片可以用作特征碎片，以更具體地確認(rèn)有效載荷的存在，并可以用來(lái)確認(rèn)有效載荷的結(jié)構(gòu)。圖2.應(yīng)用ZenoEAD得到的偶聯(lián)肽SCDK[DM1]THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPK（z=+4）的碎片數(shù)據(jù)。來(lái)自肽段主鏈指定偶聯(lián)肽段離子的全掃描MS/MS數(shù)據(jù)，以及有效載荷中的碎離子信息。此外，通過(guò)將ZenoEAD技術(shù)用于增強(qiáng)的碎片離子檢測(cè)，還可以很好地檢測(cè)到來(lái)自肽段主鏈的片段信息，從而提供有關(guān)肽段的分子完整性的信息。由于酶的空間位阻，抗體上偶聯(lián)藥物的存在會(huì)導(dǎo)致樣品制備酶解過(guò)程中的更多漏切位點(diǎn)。另外，賴氨酸殘基和有效載荷之間的結(jié)合過(guò)程是隨機(jī)反應(yīng)，偶聯(lián)的比率并不總是100％，這導(dǎo)致了多樣性和低豐度物質(zhì)存在。當(dāng)一個(gè)肽段中存在多個(gè)潛在連接形式時(shí)，鑒定正確的連接位點(diǎn)可能是一個(gè)挑戰(zhàn)。肽段ASQDVNTAVAWYKPGKAPK是這種具有挑戰(zhàn)性的另一個(gè)例子（圖3）。它包含一個(gè)漏切位點(diǎn)和一個(gè)脯氨酸相鄰的N端賴氨酸，導(dǎo)致偶聯(lián)位點(diǎn)的多種選擇。但是，有了從EAD技術(shù)碎裂得到豐富、高質(zhì)量的MS/MS質(zhì)譜圖，就可以實(shí)現(xiàn)藥物定位的自動(dòng)匹配（圖3A）。由于有效載荷靠近肽的C端，因此檢測(cè)到的C離子比Z離子豐富（圖3A），而未結(jié)合的肽顯示出來(lái)自C端和N端的豐富片段（圖3B）。眾所周知因?yàn)殡娮踊罨怆x技術(shù)不會(huì)解離脯氨酸的N端，我們還檢測(cè)到了除了C15以外的從C3到C17的全系列C片段7。這提供了確鑿的證據(jù)表明K15未與細(xì)胞毒藥物偶聯(lián)。此外，z4，z5和z7表明K18（而非K21）是藥物偶聯(lián)的正確位點(diǎn)。

圖3.應(yīng)用ZenoEAD得到的來(lái)自偶聯(lián)/非偶聯(lián)肽ASQDVNTAVAWYKPGK[DM1]APK（z=+3）的碎片的數(shù)據(jù)。A：來(lái)自肽段主鏈指定偶聯(lián)肽段離子的全掃描MS/MS數(shù)據(jù)，以及有效載荷中的碎離子信息。B：來(lái)自肽段主鏈指定非偶聯(lián)肽的全掃描MS/MS數(shù)據(jù)。連接子顯示為藍(lán)色，DM1藥物顯示為黑色。

結(jié)論：

通過(guò)EAD的新型碎裂模式，實(shí)現(xiàn)了具有多個(gè)潛在位點(diǎn)的多肽中藥物偶聯(lián)的準(zhǔn)確定位

與傳統(tǒng)的MS/MS分析相比，EAD技術(shù)獲得更豐富的MS/MS碎片信息。應(yīng)用ZenoEAD技術(shù)，即使對(duì)于中等強(qiáng)度或極低強(qiáng)度的母離子（例如低豐度的偶聯(lián)肽），也能獲得令人信服的二級(jí)碎片和出色的數(shù)據(jù)質(zhì)量

SCIEXZenoTOF7600系統(tǒng)強(qiáng)大、高重現(xiàn)性且易于