三種方法建立大鼠腰椎間盤退變模型

三種方法建立大鼠腰椎間盤退變模型白榮飛;張震;林一峰;原超;汪盛玉;方勝;遲立業(yè)【摘要】BACKGROUND:Numerousstudiesfocusonanimalmodelsofintervertebraldiscdegeneration(IDD),butcriteriaforestablishingtheanimalmodelsofIDDhavenotbeenconfirmed,andthereisalackofsystematiccomparisonamongmodels.OBJECTIVE:TocomparetheratmodelsofIDDestablishedbypuncturingatannulus,endplateinjectionandtheircombination,thusprovidingreferenceforIDDmodelselection.METHODS:EightySprague-Dawleyratswereequivalentlyrandomizedintofourgroups:puncturinggroup(puncturingattheannulus),endplateinjectiongroup(endplateinjectedwithethylalcohol),combinationgroup(puncturingattheL5-6annulusandendplateinjectionatthesamesegment)andshamoperationgroup.Threeratsineachgroupweretakenatpostoperative4,8,and12weeksforX-rayexaminationtomeasurethedischeight;andthediscswereremovedforhistologicalobservationandimmunohistochemicalstaining.RESULTSANDCONCLUSION:TheresultsofX-rayexamination,hematoxylin-eosinstainingandimmunohistochemicalstainingallshowedthattheIDDdegreewasgraduallyaggravatedinallgroupsexcepttheshamoperationgroup.Atpostoperative4weeks,comparedwiththeshamoperationgroup,intheendplateinjectionandcombinationgroups,thepercentdischeightwassignificantlydecreased,thepathologicalscoresweresignificantlyincreasedandtheaveragegrayvalueofcollagentypeIwassignificantlyreduced(P<0.05).Atpostoperative8and12weeks,comparedwiththeshamoperationgroup,thepercentdischeightintheotherthreegroupswereallsignificantlydecreased,thepathologicalscorewassignificantlyincreased,andtheaveragegrayvalueofcollagentypeIwassignificantlydecreased（P<0.05）.Comparedwiththepuncturingandendplateinjectiongroup,inthecombinationgroup,thepercentdischeightatpostoperative8weekswassignificantlydecreased,andtheaveragegrayvalueofcollagentypeIatpostoperative12weekswassignificantlydecreased（P<0.05）.TheseresultssuggestthattheratIDDmodelcanbesuccessfullyconstructedbyabovethreemethods.PuncturingattheannulusiseasytooperateandcontrolIDDprogression,whichcanbeusedtostudydifferentstagesofIDD.EndplateinjectionissuitablefortheetiologicalstudyofIDD,andinducesIDDearlierthanpuncturing,butthefinalresultsaresimilar.ThecombinationmethodcansignificantlyaccelerateIDDaggravation,andthusisnottimeconsuming.%背景:目前國內(nèi)夕卜學者對椎間盤退變動物模型進行了大量研究,但尚缺乏公認的最佳實驗動物模型，且不同模型之間缺乏系統(tǒng)的比較.目的:通過針刺纖維環(huán)法、終板注射法以及兩者聯(lián)合法建立大鼠腰椎間盤退變模型，比較3種方法的造模效果，為椎間盤退變動物模型的選擇提供參考.方法:SD大鼠80只，隨機等分為4組,分別為針刺組（針刺纖維環(huán)）、終板注射組（終板注射無水乙醇）、聯(lián)合組（即先針刺L5/6纖維環(huán)，再用無水乙醇注射同節(jié)段上下終板）以及對照組（假手術(shù)對照）.分別于術(shù)后4,8,12周每組各隨機抽取3只動物行X射線檢查，測量椎間盤相對高度;取椎間盤組織，行病理學檢查及免疫組織化學染色.結(jié)果與結(jié)論:①綜合X射線檢查、蘇木精-伊紅染色及免疫組織化學染色結(jié)果,除對照組外,針刺組、終板注射組及聯(lián)合組椎間盤退變均逐漸加重;②術(shù)后4周,與對照組相比，終板注射組和聯(lián)合組椎間盤相對高度明顯降低，病理學評分明顯升高,1型膠原染色平均灰度值顯著降低(P<0.05);③術(shù)后8,12周,與對照組相比，其他3組椎間盤相對高度均明顯降低，病理學評分均明顯升高,1型膠原染色平均灰度值均顯著降低(P<0.05);與針刺組及終板注射組比較,聯(lián)合組8周椎間盤相對高度顯著降低(P<0.05),12周I型膠原染色平均灰度值顯著降低(P<0.05);④結(jié)果表明,3種方法均能誘導椎間盤退變;針刺纖維環(huán)法手術(shù)操作較簡單，造模結(jié)果可靠，退變嚴重程度易于控制，可以滿足椎間盤退變的各期研究需要;終板注射法適合于椎間盤退變的病因?qū)W研究,較針刺纖維環(huán)法較早引起退變，但二者誘導退變程度在后期基本相同;聯(lián)合法較單一方法可明顯加快并加重椎間盤退變,有效縮短實驗周期.【期刊名稱】《中國組織工程研究》【年(卷)，期】2018(022)016【總頁數(shù)】6頁(P2514-2519)【關(guān)鍵詞】椎間盤退變;大鼠;動物模型;纖維環(huán)穿刺法;終板注射法;組織構(gòu)建【作者】白榮飛;張震;林一峰;原超;汪盛玉;方勝;遲立業(yè)【作者單位】廣州中醫(yī)藥大學第三臨床醫(yī)學院廣東省廣州市510405;廣州醫(yī)科大學附屬深圳沙井醫(yī)院，廣東省深圳市518000;廣州中醫(yī)藥大學附屬骨傷科醫(yī)院，廣東省廣州市510240;廣州中醫(yī)藥大學附屬骨傷科醫(yī)院廣東省廣州市510240;廣州中醫(yī)藥大學第三臨床醫(yī)學院廣東省廣州市510405;廣州中醫(yī)藥大學第三臨床醫(yī)學院,廣東省廣州市510405;廣州中醫(yī)藥大學第三臨床醫(yī)學院廣東省廣州市510405【正文語種】中文【中圖分類】R3180弓1言Introduction由椎間盤退變(intervertebraldiscdegeneration,IDD)弓I起的疾病稱為椎間盤退變性疾病，包括頸椎病、腰椎間盤突出癥、退變性脊柱側(cè)彎癥等一系列臨床常見的脊柱病，是臨床常見病和多發(fā)病。據(jù)統(tǒng)計，有40%的腰腿痛患者是由椎間盤退變引起［1］,腰痛已經(jīng)成為影響人們工作以及就醫(yī)的首要原因，并給社會造成巨大經(jīng)濟負擔［2］。目前關(guān)于椎間盤退變的具體病理過程仍不確切［3］，因此，只有建立有效、可靠的椎間盤退變動物模型作為實驗載體，才能夠更為深入地探究椎間盤退變的影響因素、發(fā)病機制以及各種治療方法的有效性。現(xiàn)己建立的各類動物模型主要有改變力學模型、椎間盤損傷模型及其他模型。其中椎間盤損傷動物模型是采用手術(shù)方式對纖維環(huán)、髓核或終板進行損傷，造成相應(yīng)的病理改變，進而造成椎間盤退行性變，多屬實驗誘發(fā)性退變模型，目前應(yīng)用廣泛［4］。但目前對不同手術(shù)損傷方式誘導的退變模型之間進行比較的研究較為缺乏，對于椎間盤退變模型的選擇仍有許多爭議［5］。實驗分別采用纖維環(huán)針刺法與終板注射法及兩者的聯(lián)合法建立椎間盤退變動物模型，并通過影像學檢查、病理及免疫組織化學染色方法進行觀察和比較，以期為椎間盤退變的相關(guān)研究中動物模型的選擇提供參考，為后期研究椎間盤退變的臨床治療提供可靠科研平臺。材料和方法Materialsandmethods1.1設(shè)計隨機對照動物實驗。1.2時間及地點實驗于2016年4月至10月在廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心完成。1.3材料健康4月齡雄性SPF級SD大鼠80只，體質(zhì)量(250±20)g，由廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，實驗動物合格證號：SYXK［粵］2013-0001。標準條件下適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。1.4實驗方法1.4.1分組及造模將實驗動物按體質(zhì)量分層隨機法分為針刺纖維環(huán)組（針刺組）、終板注射組、聯(lián)合組以及對照組4組，每組20只動物。所有動物術(shù)前1d禁食水，稱體質(zhì)量并計算麻醉劑量，以體積分數(shù)7%水合氯醛0.5mL/kg腹腔注射全麻。待疼痛反應(yīng)消失后，腹部剃毛備皮約6cmx4cm,大鼠取仰臥位，用乙醇消毒后鋪—次性手術(shù)單，取右側(cè)旁正中切口，依次切開皮膚、皮下組織，打開腹腔，剪開后腹膜，暴露L5/6椎間盤和終板，然后針刺組用21G微量穿刺針以針頭帽制作的套筒為保護裝置，對以上椎間盤節(jié)段穿刺，平行于軟骨終板進針，進針深度為纖維環(huán)全層針刺（控制刺入深度為2.3mm）［6-7］;終板注射組采用21G穿刺針在距L5/6椎間盤上下軟骨終板2.0-3.0mm處局部穿刺進針至骨髓腔內(nèi)，然后連接1mL注射器針管通過加壓作用勻速緩慢注入30pL無水乙醇，保持30s后出針；聯(lián)合組依次進行上述兩項操作。操作完成后依次縫合皮下筋膜及皮膚。而對照組實驗動物直接縫合皮下筋膜及皮膚。1.4.2術(shù)后處理術(shù)后放入單籠飼養(yǎng)，術(shù)后連續(xù)3d每只大鼠給予青霉素8x104U肌注抗感染，觀察實驗動物下肢活動情況、穿刺切口愈合情況以及死亡情況。1.5主要觀察指標1.5.1X射線攝片檢查術(shù)后第4,8,12周每組各隨機取3只大鼠，在體積分數(shù)7%水合氯醛腹腔麻醉下右側(cè)臥位進行X射線檢查，據(jù)Kim等［8］提出的〃三中線法”，測得手術(shù)節(jié)段L5/6椎間盤高度值為X,相鄰節(jié)段L4/5的椎間盤高度值為Y,則X與Y的比值即為手術(shù)節(jié)段椎間盤的相對高度H。所有影像結(jié)果請高年資影像科醫(yī)師行單盲評估。1.5.2組織病理學檢測以上實驗大鼠行X射線檢查后安樂處死，迅速完整截取第5,6腰椎及其間的椎間盤組織，用尖刀沿白色的骨性終板邊緣平行于終板方向完整截取椎間盤組織，用無菌生理鹽水沖洗血跡，體積分數(shù)40g/L的多聚甲醛溶液固定24h，石蠟包埋，以4pm厚度切片連續(xù)橫斷面切片，每個標本至少選取2片髓核與纖維環(huán)組織較完整的切片進行蘇木精-伊紅染色。用光學顯微鏡觀察，按照Masuda[9]椎間盤病理組織形態(tài)學分級進行評價。1.5.3免疫組織化學檢測選取上述石蠟切片的椎間盤組織，用二甲苯脫蠟，逐級乙醇水化；滴加按1:100比例配制好的I型膠原一抗，陰性對照切片則滴加PBS;在4°C孵育過夜，用辣根過氧化物酶一生物素標記的二抗孵育；DAB顯色，邊顯色邊觀察。蘇木精復染，中性樹膠封固。在光學顯微鏡下觀察，髓核細胞或纖維細胞周圍基質(zhì)染色呈棕黃色者為陽性，無染色者為陰性，針對每張切片中央髓核區(qū)域隨機選取4個高倍視野，采用Image-ProPlus6.0圖像分析軟件計算其灰度值(灰度值越小說明蛋白的表達越好)，取均值進行統(tǒng)計學分析。1.6統(tǒng)計學分析實驗數(shù)據(jù)用SPSS22.0統(tǒng)計學軟件處理。計量資料采用單因素方差分析，用SNK法進行組間比較；非參數(shù)資料采用秩和檢驗比較各組間的統(tǒng)計學差異；P<0.05為差異有顯著性意義。結(jié)果Results2.1實驗動物數(shù)量分析針刺組、終板注射組各有1只大鼠因麻醉意外死亡；聯(lián)合組2只大鼠因術(shù)中誤傷腹主動脈導致大出血死亡，1只因術(shù)后感染死亡。術(shù)后各時間點在剩余75只大鼠中隨機每組選取3只進行各項指標檢測，并進入結(jié)果分析。2.2X射線檢查結(jié)果除對照組外，針刺組、終板注射組及聯(lián)合組手術(shù)節(jié)段的椎間隙隨時間延長均逐漸降低，上下軟骨終板出現(xiàn)不同程度鈣化，椎體邊緣骨螯形成(圖1),各期大鼠椎間盤高度相對值見表1。術(shù)后4周，與對照組相比，針刺組椎間盤相對高度下降不明顯(P>0.05)，而終板注射組和聯(lián)合組則均明顯降低(P<0.05)。術(shù)后8周，針刺組、終板注射組及聯(lián)合組椎間盤相對高度較對照組均有明顯降低(P<0.05)；且針刺組、終板注射組及聯(lián)合組之間比較也都存在明顯差異(P<0.05)。術(shù)后12周，與對照組比較，針刺組、終板注射組及聯(lián)合組椎間盤相對高度均存在明顯差異(P<0.05)，但針刺組、終板注射組之間比較差異無顯著性意義(P>0.05)。以上結(jié)果說明纖維環(huán)針刺法比終板注射法造成椎間隙高度下降的速度更慢，但最終下降程度無明顯差異。表1造模后不同時間點各組大鼠的椎間盤高度(±s，相對值)Table1Discheightoftheratsineachgroupatdifferenttimepointsaftermodeling表注：與對照組比較，aP<0.05；與聯(lián)合組比較，bP<0.05；與終板注射組比較，cP<0.05。組別4周8周12周針刺組0.90±0.050.81±0.05abc0.70±0.02a終板注射組0.70±0.07a0.67±0.09ab0.65±0.05a聯(lián)合組0.63±0.05a0.51±0.03a0.50±0.04a對照組0.97±0.020.96±0.030.95±0.032.3椎間盤蘇木精-伊紅染色結(jié)果對照組各個時間點無明顯差異，椎間盤髓核完整，中央髓核呈類圓形，可見大量脊索細胞及少量類軟骨細胞，夕卜周纖維環(huán)組織環(huán)形排列，與髓核分界清晰；而針刺組、終板注射組及聯(lián)合組椎間盤髓核及纖維環(huán)隨時間推移退變呈逐漸加深趨勢，纖維環(huán)內(nèi)層纖維扭曲，向椎間盤凸入，與髓核分界不清，髓核內(nèi)出現(xiàn)裂隙，脊索細胞被纖維軟骨細胞替代，可見炎性細胞浸潤(圖2)。各組椎間盤組織病理評分見圖3，對照組術(shù)后各時間點評分無明顯差異，而針刺組、終板注射組及聯(lián)合組差異明顯(P<0.05)；術(shù)后4周，與對照組相比，終板注射組及聯(lián)合組椎間盤組織病理評分顯著升高，而針刺組升高不明顯；術(shù)后8周，針刺組、終板注射組及聯(lián)合組椎間盤病理評分較對照組均顯著升高(P<0.05),且針刺組、終板注射組及聯(lián)合組之間比較也都存在明顯差異(P<0.05)；術(shù)后12周，針刺組、終板注射組及聯(lián)合組椎間盤病理評分較對照組均明顯升高(P<0.05)，而針刺組、終板注射組之間比較差異無顯著性意義(P>0.05)。2.4免疫組織化學染色結(jié)果術(shù)后各時間點，對照組椎間盤纖維環(huán)外層I型膠原染色呈強陽性，纖維環(huán)內(nèi)層染色較弱，髓核中幾乎無染色；隨著造模時間的延長，針刺組、終板注射組及聯(lián)合組椎間盤髓核I型膠原染色逐漸增強，終板注射組及聯(lián)合組術(shù)后4周即可見髓核呈淡黃色，術(shù)后8周髓核染色加深，呈黃色，術(shù)后12周則呈棕黃色；而針刺組術(shù)后8周髓核呈淡黃色，術(shù)后12周呈黃色(圖4)。4組各時間點I型膠原免疫組織化學染色平均灰度值見表2。圖1造模后8周各組大鼠腰椎X射線片(箭頭示手術(shù)節(jié)段L5/6椎間盤)Figure1X-rayradiographsoftheratlumbarvertebraeineachgroupatpostoperative8weeksaftermodeling(arrowsindicatesurgicalL5-6segments)圖注：針刺組(A)、終板注射組(B)以及聯(lián)合組(C)X射線可見椎間隙不同程度變窄，上下終板骨質(zhì)硬化，椎體邊緣骨螯形成，而對照組(D)未見明顯變化。圖2術(shù)后8周各組椎間盤病理蘇木精-伊紅染色(x400)Figure2Hematoxylin-eosinstainingresultsoftheratintervertebraldiscineachgroupatpostoperative8weeksaftermodeling(x400)圖注：圖中A為針刺組，A1顯示纖維環(huán)出現(xiàn)層離裂隙，細胞排列紊亂；A2可見髓核細胞紊亂，出現(xiàn)輕度纖維化；B為終板注射組，B1顯示纖維環(huán)中度扭曲伴裂隙形成；B2可見髓核細胞減少，纖維化明顯；C為聯(lián)合組，C1可見纖維環(huán)重度扭曲，排列松散；C2顯示髓核細胞稀少，基本纖維化；D為對照組，D1顯示纖維環(huán)排列有序；D2為髓核細胞排列有序，可見較多脊索細胞。圖3各組椎間盤組織病理評分結(jié)果Figure3Pathologicalscoresoftheintervertebraldiscineachgroup表2造模后不同時間點各組大鼠I型膠原染色灰度值(士s,相對值)Table2AveragegreyvalueofcollagentypeIinratintervertebraldiscineachgroupatdifferenttimepointsaftermodeling表注：除對照組外，其他3組4,8,12周灰度值依次變小(說明I型膠原表達逐漸增多)；與對照組比較，aP<0.05；與聯(lián)合組比較，bP<0.05。組別4周8周12周針刺組177.84±2.23173.46±1.55a168.70±2.06ab終板注射組175.67±1.37a169.95±1.43a165.78±1.93ab聯(lián)合組173.89±1.65a167.51±1.26a160.90±2.04a對照組180.33±2.11178.96±2.53176.75±3.02圖4造模后8周各組椎間盤I型膠原免疫組織化學染色(x400)Figure4ImmunohistochemicalstainingofcollagentypeIinratintervertebraldiscineachgroupatpostoperative8weeksaftermodeling(x400)圖注：圖A為針刺組髓核I型膠原染色，可見髓核區(qū)染色呈陽性(黃色)；B為終板注射組，髓核細胞稀少，可見染色呈陽性(黃色)的纖維軟骨細胞；C為聯(lián)合組，髓核細胞染色呈強陽性(棕黃色)；D為對照組，髓核細胞基本無染色。統(tǒng)計學分析發(fā)現(xiàn)，在同一組內(nèi)不同時間點比較中，對照組各時間點結(jié)果差異無顯著性意義(P>0.05)，而針刺組、終板注射組及聯(lián)合組結(jié)果差異均有顯著性意義(P<0.05),提示3種方法均可使椎間盤髓核內(nèi)I型膠原表達增多。在術(shù)后4周，與對照組相比，針刺組I型膠原染色平均灰度值降低不明顯(P>0.05)，而終板注射組及聯(lián)合組則明顯降低(P<0.05)，表明術(shù)后4周時，纖維環(huán)針刺尚未引起髓核內(nèi)I型膠原表達明顯增多，而終板注射法及聯(lián)合法則能使I型膠原表達明顯增多。在術(shù)后8周，4組I型膠原染色平均灰度值比較差異均有顯著性意義(P<0.05)。術(shù)后12周，針刺組、終板注射組及聯(lián)合組I型膠原染色平均灰度值與對照組相比均明顯降低(P<0.05),而聯(lián)合組又明顯低于另夕卜兩組(P<0.05),針刺組與終板注射組比較差異無顯著性意義(P>0.05)。以上結(jié)果提示3種方法均可使I型膠原在椎間盤髓核內(nèi)表達明顯增多，標志著椎間盤不同程度的退變，纖維環(huán)針刺法術(shù)后8周才造成明顯的椎間盤退變，但其與終板注射法所引起的椎間盤退變程度在術(shù)后12周差異不明顯。討論Discussion椎間盤退變是一個復雜的過程，是在包括自然因素、環(huán)境因素等多種因素共同作用下逐漸形成的[10],近年來，由于腰痛對個人、家庭以及社會造成的負擔日益加重，所以關(guān)于椎間盤退變的病因及發(fā)病機制的研究一直是個熱點。大量臨床前實驗研究表明，椎間盤退變機制可能是椎間盤組織的營養(yǎng)供應(yīng)減少、椎間盤細胞外基質(zhì)成分改變、細胞過度凋亡、生物力學改變、自身免疫等因素共同導致的一種復雜的病理現(xiàn)象，而其確切機制尚未闡明［3，11-12］。因此建立可靠的椎間盤退變動物模型對相關(guān)研究是非常重要的，良好的椎間盤退變動物模型要求與人類的椎間盤退變具有相似性和可比擬性，所選動物解剖和生理特點應(yīng)盡可能與人類相似，模型重復性好，能再現(xiàn)椎間盤退變的客觀規(guī)律。然而目前已報道的各種動物模型雖各有優(yōu)點，但每一種都不能完美契合以上要求，這就需要通過比較來進行選擇，考慮到動物數(shù)量，經(jīng)濟條件。目前研究應(yīng)用最廣泛的是以鼠或兔制作的誘發(fā)性椎間盤退變模型［13］。纖維環(huán)穿刺法是一種較為成熟的造模方式，多數(shù)學者更傾向于行開放手術(shù)，采用21G微量穿刺針并將穿刺深度控制在2.3mm［5］，這種方法能有效損傷纖維環(huán)但不會造成髓核組織的過度丟失，椎間盤損傷后隨著時間的進展而緩慢退變，可以穩(wěn)定地誘導椎間盤退變，其機制可能為纖維環(huán)的破損造成椎間盤突出，水分丟失，然后髓核組織壓力及微環(huán)境改變，既而發(fā)生變性，其退變過程慢，所需時間為4-8周［14-15］。軟骨終板是椎間盤主要營養(yǎng)供應(yīng)途徑，約占正常椎間盤營養(yǎng)的80%，諸如水、膠原及蛋白多糖等營養(yǎng)成分都由此通道傳遞。Yuan等［16］研究表明，通過向大鼠尾椎體內(nèi)終板下注入無水乙醇，可引起終板供血障礙，椎間盤失去營養(yǎng)供應(yīng)，最終導致椎間盤發(fā)生退變，此種方法造模術(shù)后4周即可觀察到明顯的椎間盤退變。通過腰椎X射線片上測量椎間隙高度改變及骨質(zhì)改變，進而推測椎間盤的變化，可初步判斷椎間盤退變的嚴重程度，此方法廣泛應(yīng)用于椎間盤退變動物實驗研究中，研究證實其與病理學、免疫組織化學檢測有較高的一致性［17］。在椎間盤退變過程中，椎間盤纖維環(huán)、髓核組織結(jié)構(gòu)以及膠原蛋白成分會發(fā)生改變，這種變化可通過病理染色及免疫組織化學染色法觀察。其中蘇木精-伊紅染色操作簡便，能顯示椎間盤各層組織結(jié)構(gòu)及其變化，是研究椎間盤組織形態(tài)的重要技術(shù)。免疫組織化學染色作為分子生物學研究的常規(guī)技術(shù)，可以定量地分析腰椎椎間盤內(nèi)各種生化物質(zhì)的改變，正常的腰椎椎間盤含有大量膠原蛋白，其中I型膠原蛋白只存在于正常椎間盤外層纖維環(huán)中，構(gòu)成支架結(jié)構(gòu)，起到保護髓核組織、維持椎間盤高度的作用，而正常的髓核組織幾乎不表達。最近的一項遺傳學研究表明，1型膠原蛋白基因多態(tài)性可能是中國漢族老年人群椎間盤退變的危險因素［18］,另動物實驗研究發(fā)現(xiàn)，髓核及纖維環(huán)中I型膠原蛋白的表達在腰椎椎間盤發(fā)生退變后明顯增加，且退變越嚴重，髓核纖維化程度越高，1型膠原蛋白的表達升高越明顯［19］，因此髓核中I型膠原蛋白表達的升高是椎間盤退變的重要標志。本研究首次采用終板注射無水乙醇法處理大鼠腰椎間盤，并結(jié)合經(jīng)典的纖維環(huán)穿刺法，分3個時間點對比觀察其退變情況，綜合影像學、病理及免疫組織化學檢測結(jié)果表明，3種造模方法處理后的相應(yīng)椎間隙隨時間延長均逐漸降低，同時伴有軟骨終板鈣化、椎體邊緣骨螯形成，纖維環(huán)結(jié)構(gòu)紊亂，髓核組織脫水，髓核內(nèi)I型膠原蛋白表達明顯增多，提示3種造模方法均能不同程度地誘導椎間盤退變，但又各有特點，總結(jié)如下：聯(lián)合法較單一方法同期可造成更嚴重的椎間盤退變；針刺纖維環(huán)法致退變進展緩慢，術(shù)后8周才觀察到明顯退變，而與之相比，終板注射法能更早引起退變，但后期兩者均可造成椎間盤重度退變，各指標對比差異不明顯，其原因可能是椎間盤重度退變時，椎間隙明顯變窄，髓核大面積縮小，組織基本纖維化，故其椎間盤高度、組織結(jié)構(gòu)及細胞外基質(zhì)膠原蛋白含量變化不明顯。實際上，在椎間盤退變過程中，除了椎間盤高度、組織結(jié)構(gòu)、I型膠原蛋白成分發(fā)生改變外，髓核區(qū)的H型膠原蛋白、蛋白多糖、轉(zhuǎn)化生長因子等的含量以及各種基因的表達在退變各期亦發(fā)生變化[20-21],另外椎間盤組織退變早期含水量的改變可通過MRI檢查進行準確評價[22]。作者在實驗中，沒有進行磁共振及其他分子生物學的檢測，此為本研究的不足之處。綜上所述，聯(lián)合法較單一方法可明顯加快并加重椎間盤退變過程，有效縮短實驗周期，提高效率，但其對實驗動物創(chuàng)傷大，對操作要求高；針刺纖維環(huán)法手術(shù)操作較成熟，結(jié)果可靠，易于控制，無需特殊的實驗設(shè)備，可以選用不同型號的穿刺針及不同的穿刺深度，從而達到理想的造模程度，以滿足椎間盤退變的各期研究需要；終板注射無水乙醇法不直接損傷椎間盤，而是阻斷了軟骨終板向內(nèi)層纖維環(huán)及髓核的營養(yǎng)滲透，導致其代謝紊亂，其結(jié)果符合人椎間盤自然退變過程，此法適合于椎間盤退變的病因?qū)W研究，且對于評估新的椎間盤退變和修復的生物學干預措施也有重要意義。致謝：感謝導師原超教授的教導，感謝廣州中醫(yī)藥大學嶺南醫(yī)學研究中心詹冬香老師給予的幫助。作者貢獻：白榮飛、張震進行實驗設(shè)計，實驗實施為白榮飛、張震、汪盛玉，資料收集為白榮飛，白榮飛成文，林一峰、原超評估并審校，經(jīng)費支持：該文章接受了〃國家自然科學基金項目(81574000)”的資助。所有作者聲明，經(jīng)費支持沒有影響文章觀點和對研究數(shù)據(jù)客觀結(jié)果的統(tǒng)計分析及其報道。利益沖突：文章的全部作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程，沒有因其崗位角色影響文章觀點和對數(shù)據(jù)結(jié)果的報道，不存在利益沖突。倫理問題：實驗方案經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學動物實驗倫理委員會審查批準。實驗過程遵循了國際獸醫(yī)學編輯協(xié)會《關(guān)于動物倫理與福利的作者指南共識》和本地及國家法規(guī)。實驗動物在麻醉下進行所有的手術(shù)，并盡一切努力最大限度地減少其疼痛、痛苦和死亡。文章的撰寫與編輯修改后文章遵守了《動物實驗體內(nèi)實驗研究報告規(guī)范指南》(ARRIVE指南)。文章查重：文章出版前已經(jīng)過CNKI反剽竊文獻檢測系統(tǒng)進行3次查重。文章外審：文章經(jīng)國內(nèi)小同行外審專家雙盲外審，符合本刊發(fā)稿宗旨。作者聲明：第一作者和通訊作者對研究和撰寫的論文中出現(xiàn)的不端行為承擔責任。論文中涉及的原始圖片、數(shù)據(jù)(包括計算機數(shù)據(jù)庫)記錄及樣本已按照有關(guān)規(guī)定保存、分享和銷毀，可接受核查。文章版權(quán)：文章出版前雜志已與全體作者授權(quán)人簽署了版權(quán)相關(guān)協(xié)議。開放獲取聲明：這是一篇開放獲取文章，根據(jù)《知識共享許可協(xié)議》〃署名-非商業(yè)性使用-相同方式共享3.0”條款，在合理弓I用的情況下，允許他人以非商業(yè)性目的基于原文內(nèi)容編輯、調(diào)整和擴展，同時允許任何用戶閱讀、下載、拷貝、傳遞、打印、檢索、超級鏈接該文獻，并為之建立索引，用作軟件的輸入數(shù)據(jù)或其它任何合法用途。4參考文獻ReferencesColombierP,ClouetJ,HamelO,etal.Thelumbarintervertebraldisc:Fromembryonicdevelopmenttodegeneration.JointBoneSpine.2014;81(2):125-129.PranjicN,Males-BilicL.Lowbackpainatnewworkingambientineraofneweconomy:asystematicreviewaboutoccupationalriskfactors.ActaMedicaCroaticaCasopisHravatskeAkademijeMedicinskihZnanosti.2015;69(1):49.deCamposMF,deOliveiraCP,NeffCB,etal.Studiesofmolecularchangesinintervertebraldiscdegenerationinanimalmodel.ActaOrtopBras.2016;24(1):16-21.馬晟，賈育松孫旗.體內(nèi)腰椎間盤退變動物模型的研究與進展[J].中國組織工程研究2017,21(11):1790-1797.SunF,QuJN,ZhangYG.Animalmodelsofdiscdegenerationandmajorgeneticstrategies.PainPhysician.2013;16(3):E267-E275.崔力揚，劉尚禮,丁悅等.大鼠腰椎間盤針刺退變模型的建立[J].中國矯形外科雜志,2007,15(13):1008-1011.SilveiraJW,IssyAC,CastaniaVA,etal.Protectiveeffectsofcannabidiolonlesion-inducedintervertebraldiscdegeneration.PlosOne.2014;9(12):e113161.KimKS,YoonST,LiJ,etal.Discdegenerationintherabbit:abiochemicalandradiologicalcomparisonbetweenfourdiscinjurymodels.Spine.2005;30(1):33-37.MasudaK,AotaY,MuehlemanC,etal.Anovelrabhitmodelofmild,reproducihlediscdegenerationbyananulusneedlepuncture:correlationbetweenthedegreeofdiscinjuryandradiologicalandhistologicalappearancesofdiscdegeneration.Spine(PhilaPa1976).2005;30(1):5-14.JinL,BalianG,LiXJ.Animalmodelsfordiscdegeneration-an叩date.HistolHistopathol.2017:119110.Tao-TaoXU,FeiL,JinHT,etal.Researchadvanceonintervertebraldiscdegenerationandcelldeath.ZhongguoGuShang.2015;28(7):673-678.VergroesenPP,KingmaI,EmanuelKS,etal.Mechanicsandbiologyinintervertebraldiscdegeneration:aviciouscircle.OsteoarthritisCartilage.2015;23(7):1057-1070.LiuB,ZhangL,TianF,etal.[Progressindiscdegenerationmodelsandcalcitonintherapy].Zhongg