犬小孢子菌的學(xué)習(xí)教案

犬小孢子菌的學(xué)習(xí)教案第1頁/共36頁研究背景1.兒童皮脂腺發(fā)育不完全2.犬小孢子菌蛋白酶的作用犬小孢子菌兒童頭癬發(fā)病機制推測兒童頭皮是否誘導(dǎo)犬小孢子菌毒力因子

？第2頁/共36頁材料前期試驗克?。壕篜CR，菌液克隆

主要試劑：

1.DIGHighPrimeLabeling&DetectionStarterKitI2.雜交膜

3.RealtimePCRKit

主要儀器：

1.CL1000紫外交聯(lián)儀（UVP）

2.AppliedBiosystems7500RealTimePCRSystem第3頁/共36頁兒童頭皮培養(yǎng)菌株(tester)兒童光滑皮膚培養(yǎng)菌株(driver1)成人頭皮組織培養(yǎng)菌株(driver2)

斑點雜交實時PCR技術(shù)路線獲得差異基因前期完成試驗消減文庫SSH第4頁/共36頁方法---斑點雜交正反向消減文庫PCR擴增制備探針酶切回收雜交膜DIG-HighPrimer

探針菌液PCR產(chǎn)物第5頁/共36頁陽性克隆測序陽性克隆菌液送大連寶生物測序：菌種為DH10B，載體為PMD-T18測序使用引物為：FPrimer（M13-47）；RPrimer（RV-M）第6頁/共36頁測序分析序列預(yù)處理去除混雜基因同源性比對功能分類第7頁/共36頁實時PCRTestermRNADriver1mRNADriver2mRNA2個基因

2個基因

18SrRNA

3個RNA池均為構(gòu)建消減文庫時保存的總RNA

第8頁/共36頁探針引物序列第9頁/共36頁結(jié)果—消減文庫酶切前后結(jié)果第10頁/共36頁結(jié)果---斑點雜交消減文庫1斑點雜交部分結(jié)果正向反向第11頁/共36頁正向反向消減文庫2斑點雜交部分結(jié)果

結(jié)果---斑點雜交第12頁/共36頁陽性克隆測序及分析

共得到106個有效序列共得到13個ESTs8個ESTs找到了同源基因6個同源基因具有功能分類第13頁/共36頁消減文庫1差異基因比對結(jié)果第14頁/共36頁消減文庫2差異基因比對結(jié)果第15頁/共36頁蛋白功能分類第16頁/共36頁實時PCR--18srRNA18srRNA基因在3個RNA池中的實時PCR表達情況

第17頁/共36頁FSH1基因在testerRNA池和driver1RNA池中的實時PCR表達情況

實時PCR--FSH1第18頁/共36頁PQ-LRP基因在testerRNA和driver1RNA池中的實時PCR表達情況

實時PCR--PQ-LRP第19頁/共36頁

P-GAL4基因在testerRNA池和driver2RNA池中的實時PCR表達情況

實時PCR--P-GAL4第20頁/共36頁NADH1基因在testerRNA池和driver2RNA池中的實時PCR表達情況

實時PCR--NADH1第21頁/共36頁4個ESTs表達的相對表達倍數(shù)關(guān)系

第22頁/共36頁討論犬小孢子菌致病因子表達犬小孢子菌主要致兒童頭癬兒童頭皮組織結(jié)構(gòu)蛋白差異利用SSH可能影響第23頁/共36頁討論Tester和driver作為探針低豐度基因的丟失正反向消減DNA作為探針避免低豐度基因的丟失高背景，陽性率降低去掉接頭降低背景，篩選差異基因第24頁/共36頁實時PCR實時監(jiān)測

高特異性高靈敏性

討論第25頁/共36頁兒童頭皮培養(yǎng)菌株兒童光滑皮膚培養(yǎng)菌株構(gòu)建文庫富集差異基因成人頭皮培養(yǎng)菌株討論第26頁/共36頁討論--FSH1目前對FSH1的研究主要是對其結(jié)構(gòu)的分析FSH1是酯酶，水解疏水磷酸酯、油酯化合物FSH家族功能較多：蛋白酶作用、調(diào)控因子作用等FSH1在此發(fā)揮蛋白酶作用還是調(diào)控因子作用還不清楚SophieQuevillpn-cheruel

第27頁/共36頁討論--PQ-LRPPQ-LRP蛋白是膜綁定蛋白，擁有一對重復(fù)的環(huán)結(jié)構(gòu)（環(huán)1和環(huán)2）環(huán)2對半胱氨酸載體定位于溶酶體至關(guān)重要半胱氨酸載體調(diào)控半胱氨酸代謝PQ-LRP基因的上調(diào)表達，可能與半胱氨酸的代謝增強有關(guān)PQ-LRP基因可能是犬小孢子菌的重要致病因子

第28頁/共36頁討論--NADH1NADH1是呼吸鏈的組成部分，參與ATP的生成犬小孢子菌ATP利用率的增加，可能與其在兒童頭皮組織中生長更活躍有關(guān)第29頁/共36頁討論--P-GAL4P-GAL4基因?qū)儆贕AL4家族，含有一個真菌中獨有的GAL4域GAL4家族普遍的功能是轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，主要調(diào)控氮源代謝、生殖繁殖等在本研究中，P-GAL4基因在此可能是調(diào)控真菌的生殖，導(dǎo)致犬小孢子菌在兒童的頭皮組織中大量繁殖，導(dǎo)致頭癬的發(fā)生第30頁/共36頁結(jié)論SSH1文庫得到5個差異基因：

1.FSH12.PQ-LRP3.multidrugresistanceproteinMDR4.RINGzincfingerprotein5.RINGzincfingerprotein,putative第31頁/共36頁結(jié)論SSH2文庫3個差異基因：

1.P-GAL42.NADH13.DNA-directedRNApolymeraseIsubunit第32頁/共36頁結(jié)論FSH1和PQ-LRP基因可能在犬小孢子菌致頭癬的發(fā)病機制中起重要作