生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)血清γ球蛋白的分離純化與鑒定

生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)血清γ球蛋白的分離純化與鑒定第1頁/共41頁生物化學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)

血清γ球蛋白的分離純化與鑒定

生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)CQMU第2頁/共41頁實(shí)驗(yàn)?zāi)康膹娜搜逯蟹蛛x純化γ-球蛋白

實(shí)驗(yàn)方法

一、鹽析法粗分γ-球蛋白二、凝膠過濾方法脫鹽三、離子交換層析方法純化γ-球蛋白四、醋酸纖維素薄膜電泳法鑒定γ-球蛋白的純度

本實(shí)驗(yàn)綜合多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)和方法，共同完成一個實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)，所以屬于綜合性實(shí)驗(yàn)。

第3頁/共41頁血清γ球蛋白的分離純化與鑒定【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?．學(xué)習(xí)了解凝膠層析和離子交換層析分離純化蛋白質(zhì)的基本原理及應(yīng)用2．掌握醋酸纖維薄膜電泳技術(shù)的原理及應(yīng)用第4頁/共41頁蛋白質(zhì)分離純化與鑒定【基本原理】

蛋白質(zhì)的分離、純化及鑒定是研究蛋白質(zhì)化學(xué)性質(zhì)及生物學(xué)功能的重要手段之一。

分離純化蛋白質(zhì)的方法是利用不同蛋白質(zhì)的某些物理、化學(xué)性質(zhì)的不同而建立的方法，其中有鹽析、離子交換、凝膠過濾、親和層析、制備電泳、離心等。在分離純化時(shí)，根據(jù)情況選用幾種方法，相互配合才能達(dá)到分離純化一種蛋白質(zhì)的目的。第5頁/共41頁血清γ球蛋白的分離純化與鑒定【實(shí)驗(yàn)原理】

本實(shí)驗(yàn)采用硫酸銨鹽析、葡聚糖凝膠過濾、離子交換層析方法，分離純化血清γ-球蛋白。最后用醋酸纖維素薄膜電泳法鑒定γ-球蛋白的純度。

第6頁/共41頁一、鹽析法粗分離血清γ-球蛋白原理

鹽析法是根據(jù)不同蛋白質(zhì)在一定濃度的鹽溶液中溶解度度不同，從而分別析出，達(dá)到彼此分離的分離方法。

本實(shí)驗(yàn)在半飽和硫酸銨溶液中，清蛋白溶解，球蛋白將沉淀析出，經(jīng)離心所得的沉淀即為球蛋白的粗提液。第7頁/共41頁鹽析法分離血清球蛋白

硫酸銨是蛋白質(zhì)鹽析常用的中性鹽，在0～30℃范圍內(nèi)溶解度變化不大；25℃時(shí)飽和溶解度為4.1mol/l，0℃時(shí)飽和溶解度為3.9mol/l。在這一溶解度范圍內(nèi)，許多蛋白質(zhì)和酶都可以析出來。而且硫酸銨價(jià)廉易得，分段鹽析效果好，不容易引起蛋白質(zhì)變性。

第8頁/共41頁具體操作硫酸銨分段鹽析：血清1.0ml，一邊搖一邊緩慢加入飽和硫酸銨1.0ml，混勻后室溫下靜置10分鐘，3000rpm離心10分鐘。用滴管仔細(xì)地吸出上清，棄去。沉淀加0.02mol/lpH6.5磷酸緩沖液4.0ml溶解，此為球蛋白粗提液，留作進(jìn)一步純化。

第9頁/共41頁二、葡聚糖凝膠柱層析脫鹽

欲去除鹽析法分離得到的球蛋白粗提液中大量鹽，通常有兩種方法：

凝膠層析法透析本試驗(yàn)采用葡聚糖凝膠——SephadexG25層析方法除去球蛋白粗提液中的鹽硫酸銨，以便下一步用離子交換層析方法進(jìn)一步提純球蛋白。

第10頁/共41頁凝膠柱層析脫鹽第11頁/共41頁目的與要求1.學(xué)習(xí)了解凝膠層析的原理2.熟練了解凝膠層析的用途第12頁/共41頁凝膠層析原理：

凝膠層析法是按混合物各組分分子量大小不同隨流動相經(jīng)過層析柱的時(shí)間不同而被分離的技術(shù)。

凝膠是一類具有三維多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的干燥顆粒，當(dāng)吸收一定量溶液后溶漲成柔軟、富有彈性、不帶電荷、不與溶質(zhì)相互作用的惰性物質(zhì)，凝膠層析以其為固定相。層析時(shí)，直徑大于凝膠網(wǎng)孔的大分子物質(zhì)不能進(jìn)入凝膠內(nèi)部，只能沿著凝膠顆粒間的間隙隨流動相向下移動，所以流程短、流速快，首先流出層析柱；而小分子物質(zhì)直徑小于凝膠網(wǎng)孔能自由出入，洗脫時(shí)間長，后流出層析柱，經(jīng)過一定時(shí)間層析，分子大小不同的物質(zhì)彼此分開，達(dá)到分離的目的。

第13頁/共41頁凝膠層析法原理

凝膠層析法又叫凝膠過濾?；驹硎怯靡话愕闹鶎游龇椒ㄊ狗肿恿坎煌娜苜|(zhì)通過具有分子篩性質(zhì)的固定相從而使物質(zhì)分離。它利用一些多孔的細(xì)珠支持物，這些小孔大小不一，可以允許半徑在一定范圍內(nèi)的分子透過它。把經(jīng)過充分溶脹的凝膠裝入層析柱中，加入樣品后，由于凝膠的三維空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，分子量小的物質(zhì)能進(jìn)入凝膠，流程長，移動速度慢。分子量大的物質(zhì)則被排阻在交聯(lián)網(wǎng)狀物之外，沿著凝膠顆粒間的孔隙隨溶劑流動，其流程短，移動速度快，先流出層析床。經(jīng)過分部收集流出液，分子量不同的物質(zhì)便互相分離。

第14頁/共41頁分子篩層析第15頁/共41頁葡聚糖凝膠（Sephadex)交聯(lián)度網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)網(wǎng)孔徑吸水量機(jī)械強(qiáng)度耐壓力大致密小小大高小疏松大大小低應(yīng)用最多的凝膠！第16頁/共41頁▲SephadexG-50的準(zhǔn)備▲裝柱（15~20cm）操作步驟：1、層析柱保持垂直。2、放蒸餾水，排沙芯下空氣，關(guān)閉出口。3、加入攪拌均勻的SephadexG-50懸液，調(diào)節(jié)流速10滴/min，使凝膠均勻沉降，不斷補(bǔ)充，直至15cm。4、上留1—2mm的水，關(guān)閉出口。

注意：★床面上要保持少許水，防止膠床露出液面。

★膠面不平，用玻棒輕輕攪動，讓凝膠自然沉降，使表面平整。第17頁/共41頁▲

加樣與洗脫▲

凝膠的再生1、加樣：用滴管將鹽析后樣品加入柱床面，打開出口使樣品溶液滲入凝膠。2、洗脫：加入洗脫液，打開出口，保持流速10滴/min，收集洗脫液，用鈉氏試劑檢測胺。3、保存：檢測洗脫液的蛋白質(zhì)量，保存含量高的進(jìn)一步純化

不斷加洗脫液，使銨全部流出，為下次實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備。第18頁/共41頁注意事項(xiàng)：

1.凝膠柱的制備質(zhì)量決定分離效果的好壞。

2.加樣分離時(shí)，滴速越慢，分離效果越好?！?/p>

以管號為橫軸，蛋白質(zhì)含量為縱軸繪制洗脫曲線，分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。第19頁/共41頁三、DEAE－纖維素離子交換層析

【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/p>

1.通過使用DEAE－纖維素離子交換層析法，進(jìn)一步純化γ-球蛋白脫鹽液，得到較純的γ-球蛋白溶液

2.學(xué)習(xí)了解離子交換層析方法的基本原理和應(yīng)用范圍

第20頁/共41頁離子交換層析的基本原理

離子交換層析是一種常用的、通過使用各種類型的離子交換劑達(dá)到分離純化目的的層析方法。離子交換劑是通過化學(xué)反應(yīng)將帶電基團(tuán)引入到惰性支持物上形成的固體物質(zhì)，在實(shí)驗(yàn)中作為固定相。如果其帶負(fù)電，則能結(jié)合陽離子，成為陽離子交換劑；如果其帶正電，則能結(jié)合陰離子，稱為陰離子交換劑?？筛鶕?jù)實(shí)驗(yàn)需要，選擇不同的離子交換劑進(jìn)行離子交換層析。

DEAE（二乙基氨基乙基）

－纖維素含有可離子化的堿基，可與氫離子結(jié)合，成為帶正電荷的陰離子交換劑。

第21頁/共41頁離子交換層析的基本原理

靠靜電引力結(jié)合在交換劑上的離子，叫做平衡離子應(yīng)用離子交換層析時(shí)要找到適當(dāng)?shù)臈l件，使一些化合物帶電結(jié)合到交換劑上，而使另一些化合物不結(jié)合到交換劑上。在本實(shí)驗(yàn)條件下，DEAE－纖維素是具有帶多個正電荷游離堿基的聚合物，所以主要靠靜電吸引與帶負(fù)電的蛋白質(zhì)形成離子鍵，對蛋白質(zhì)提純有很大好處第22頁/共41頁蛋白質(zhì)的電離示意圖

第23頁/共41頁DEAE－纖維素離子交換層析純化γ－球蛋白

血清α、β、γ－球蛋白、清蛋白的等電點(diǎn)為：清蛋白pI=4.64，

α2球蛋白

pI=5.06，

β球蛋白pI=5.12，

γ球蛋白pI=7.3本實(shí)驗(yàn)采用0.02mol/lpH6.5NH4Ac緩沖液進(jìn)行洗脫。在此pH條件下，DEAE帶正電荷，可與帶負(fù)電荷的α、β-球蛋白和清蛋白結(jié)合，而帶正電荷的γ-球蛋白不與DEAE結(jié)合，首先從層析柱中洗脫出來，首先收集到的既是純化的γ-球蛋白。第24頁/共41頁操作

將脫鹽后的球蛋白加于DEAE柱上（方法同凝膠過濾），用0.02mol/lpH6.5NH4Ac緩沖液洗脫，流速10滴～15滴/分，用小試管連續(xù)收集流出液（約1.5ml/管），用紫外分光光度計(jì)在λ280nm下測其吸光度值，收集含量最高的部分，濃縮作純度鑒定。用該緩沖液洗脫下來的是γ－球蛋白。第25頁/共41頁四、γ－球蛋白純化液的濃縮

利用葡聚糖凝膠富含羥基，吸水，不允許大分子蛋白進(jìn)入微孔的特性，在樣品溶液中加少量凝膠，離心，濃縮蛋白。

每ml純化γ－球蛋白溶液加SephadexG250.25g，搖動2～3分鐘，室溫靜止2小時(shí)離心，上清即為濃縮γ-球蛋白（或用冷凍干燥儀使其濃縮）。

第26頁/共41頁五、γ－球蛋白鑒定

用醋酸纖維素薄膜電泳的方法，以血清電泳圖譜為對照，鑒定所分離的蛋白質(zhì)種類和純度（參見血清蛋白質(zhì)醋酸纖維素薄膜電泳）。

第27頁/共41頁血清蛋白質(zhì)乙酸纖維素薄膜電泳第28頁/共41頁目的要求掌握醋酸纖維薄膜電泳的原理；學(xué)習(xí)電泳技術(shù)。第29頁/共41頁原理以醋酸纖維薄膜作為支持體的一種電泳方法。在pH8.6巴比妥緩沖液中，血清蛋白質(zhì)在電場中均帶負(fù)電荷，向正極移動。帶電荷多、分子量相對小的泳動速度快；帶電荷少、分子量相對大的泳動速度慢。第30頁/共41頁醋酸纖維素薄膜電泳鑒定

點(diǎn)樣：全血清：點(diǎn)樣一次脫鹽后的粗蛋白溶液：點(diǎn)樣3～5次

濃縮后的純γ－球蛋白溶液：點(diǎn)樣3～5次第31頁/共41頁醋酸纖維素薄膜電泳電泳條件：電壓：90－110V；時(shí)間：50分鐘。染色：電泳畢，關(guān)電源。取出薄膜浸入盛有氨基黑10B染色液的染色缸中染色5分鐘，用2.5%醋酸洗脫液漂洗，直至背景呈白色。取寬薄膜一張，3個樣品點(diǎn)在同一水平，以血清蛋白圖譜為對照，觀察提純物屬哪種蛋白，其純度如何。

第32頁/共41頁操作步驟：1、裝置電泳箱。區(qū)分電泳箱正負(fù)極。2、點(diǎn)樣：浸于巴比妥溶液中的薄膜，濾紙輕輕吸干—半干燥態(tài)。鉛筆標(biāo)記；點(diǎn)樣器沾適量新鮮血清，垂直點(diǎn)樣。3、放入電泳槽，使膜保持水平。4、通電：110伏，1小時(shí)。斷電后，取膜。5、染色：氨基黑10B染色10min。6、浸洗：浸洗液浸洗3次，每次5-10min?？斓?3頁/共41頁+鉛筆標(biāo)記，垂直點(diǎn)樣保持膜不下垂半干燥態(tài)第34頁/共41頁按泳動快慢順序分為：

清蛋白、α1、α2、β、γ—球蛋白。第35頁/共41頁注意事項(xiàng)：1、區(qū)分電泳槽正負(fù)極。2、點(diǎn)樣處放在負(fù)極端，保持膜水平。第36頁/共41頁試劑材料飽和硫酸銨溶液納氏試劑SephadexG25DEAE－纖維素醋酸纖維素薄膜

第37頁/共41頁儀器離心機(jī)層析柱紫外分光光度計(jì)小燒杯小試管鐵架臺及鐵夾電泳槽白瓷板等。第38頁/共41頁注意事項(xiàng)

1．鹽析時(shí)應(yīng)逐滴加入飽和硫酸銨，邊加邊搖，靜止要充分。2．裝柱時(shí)柱內(nèi)要嚴(yán)防斷層與氣泡，凝膠床面要平整。3．準(zhǔn)確配制NH4Ac緩沖液并嚴(yán)格調(diào)整其PH至6.5。

4．保持層析柱床表面完整,上樣或加緩沖液時(shí),動作應(yīng)輕、慢，切勿將柱床表面沖起.上樣時(shí)小心控制下端聚乙烯管.嚴(yán)防空氣進(jìn)入層析柱床內(nèi)。5．樣品進(jìn)入床內(nèi),打開出口后應(yīng)立即收集.洗脫時(shí)注意收集樣品,切勿使樣品丟失,并注意不