第三章第一,二節(jié)酶及細(xì)胞的固定

第三章化學(xué)酶工程教學(xué)內(nèi)容及教學(xué)要求：了解酶在實(shí)際應(yīng)用中的缺陷；掌握酶的固定化，輔酶的固定化，細(xì)胞的固定化，固定化酶和固定化細(xì)胞的表征，固定化酶和固定化細(xì)胞的應(yīng)用；理解酶蛋白化學(xué)修飾的原理，了解酶蛋白化學(xué)修飾的方法，酶蛋白側(cè)連的修飾，酶的親和修飾，酶化學(xué)修飾的應(yīng)用。重點(diǎn)：掌握酶的固定化，輔酶的固定化，細(xì)胞的固定化，固定化酶和固定化細(xì)胞的表征，固定化酶和固定化細(xì)胞的應(yīng)用；理解酶蛋白化學(xué)修飾的原理。難點(diǎn)：理解酶蛋白化學(xué)修飾的原理現(xiàn)在是1頁\一共有97頁\編輯于星期四第一節(jié)酶的固定化一、游離酶在實(shí)際應(yīng)用中的缺點(diǎn)1、穩(wěn)定性差，易失活，易水解2、難回收利用3、難連續(xù)化生產(chǎn)4、酶與產(chǎn)物混合，難分離現(xiàn)在是2頁\一共有97頁\編輯于星期四二、固定化酶的定義及基本要求1、定義：借助物理或化學(xué)方法將酶固定于水不溶性或者水溶性載體，使酶與整體流體分開，但仍然能進(jìn)行底物和效應(yīng)物分子交換并發(fā)揮其催化效能的一種酶制劑形式。2、固定化生物催化劑酶微生物細(xì)胞細(xì)胞器動(dòng)植物細(xì)胞、組織和器官現(xiàn)在是3頁\一共有97頁\編輯于星期四3、酶固定的基本要求保持酶活性和專一性載體與酶結(jié)合牢固載體不與底物發(fā)生反應(yīng)酶固定化后的位阻效應(yīng)小酶固定成本應(yīng)盡可能的低現(xiàn)在是4頁\一共有97頁\編輯于星期四三、酶固定的方法現(xiàn)在是5頁\一共有97頁\編輯于星期四1、吸附法通過氫鍵、疏水作用、離子鍵等物理作用，將酶固定于水不溶性載體表面的固定化方法。1）、物理吸附：通過氫鍵、疏水作用、范德華力等物理作用，將酶固定于水不溶性載體表面的固定化方法。有機(jī)載體：纖維素、面筋、骨膠原和淀粉無機(jī)載體：氧化鈣、硅澡土、高嶺土和二氧化鈦2）、離子交換吸附：將酶分子通過離子鍵固定到含有離子交換基團(tuán)的固相載體上的固定方法。陰離子交換劑：DEAE（二乙基氨基乙基）-纖維素陽離子交換劑：CM（羧甲基）-纖維素現(xiàn)在是6頁\一共有97頁\編輯于星期四優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)制備簡(jiǎn)單，酶活力受到的影響?。还潭ɑM(fèi)用低；酶容易從載體上脫落現(xiàn)在是7頁\一共有97頁\編輯于星期四

2、包埋法將酶分子截留在具有特定網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的載體中。常用的包埋材料有：瓊脂，海藻酸鈣，明膠等天然高分子以及聚丙烯酰胺，光交聯(lián)樹脂等合成大分子。

1）、凝膠包埋：聚丙烯酰胺：制備簡(jiǎn)單，酶活力不易破壞，缺點(diǎn)是酶容易漏失。丙烯酰單體有毒性，注意清洗?，F(xiàn)在是8頁\一共有97頁\編輯于星期四海藻酸鈣

現(xiàn)在是9頁\一共有97頁\編輯于星期四瓊脂和輻射

瓊脂包埋法：利用熔化的瓊脂在溫度低于50℃凝固的特性來包埋酶分子。特點(diǎn)是包埋活性高，制作容易，容易受到擴(kuò)散限制。輻射包埋法：酶溶于純單體水溶液、單體加聚合物水溶液或純聚合物溶液中，在常溫或低溫下，用x—射線、Y—射線或電子束輻照。可得到包埋酶的親水凝膠。如用X—射線引發(fā)聚丙烯酰胺聚合，可以固定胰蛋白酶。1973年H．Maeda等用聚乙烯水溶液輻照包埋了多種酶。（光交聯(lián)樹脂）現(xiàn)在是10頁\一共有97頁\編輯于星期四③其他凝膠包埋法。

a.淀粉凝膠包埋法。將氨基甲酸乙酯的泡沫墊浸入溫?zé)岬牡矸廴芤汉鸵阴Ｄ憠A脂酶的混合物中，再經(jīng)冷卻、干燥，便制得固定化乙酰膽堿脂酶。為增強(qiáng)機(jī)械強(qiáng)度和重新水合可加入—定量的甘油。

b.膠原包埋法即大分子絡(luò)合法。膠原有纖維性，易成膜，能在生理pH下自發(fā)的聚焦成束，膠束末端可以通過多種次級(jí)鍵與酶分子相互作用，通過酶和膠原分子形成網(wǎng)架而將酶固定化。其制備方法極為簡(jiǎn)單：將酶加到膠原懸浮液中、鋪膜、干燥即得固定化酶?；蛘呓?jīng)過透析的酶和膠原混合，插入電極，酶—膠原復(fù)合物便在電極上沉淀?，F(xiàn)在是11頁\一共有97頁\編輯于星期四c.卡拉膠包埋法：卡拉膠(K—Carrageenin)是由角叉菜(又名鹿角菜:Cawageen)中提取的一種多糖，可以用來包埋酶。具體方法：將酶在37—50℃溶于水中，又將卡拉膠在40一60℃溶于生理鹽水中，二者混合后冷至10℃，所成凝膠浸在0.3mol/LKCl溶液中硬化，作成適當(dāng)大小的顆粒,即為固定化酶。ｄ.大豆蛋白包埋法。含葡萄糖異構(gòu)酶的鏈霉菌菌株與大豆蛋白溶液混合，在60℃用碳酸鎂處理使其凝結(jié)，過濾。制球，干燥后用戊二醛和六甲叉二胺處理，硬化。從而制得固定化葡萄糖異構(gòu)酶。現(xiàn)在是12頁\一共有97頁\編輯于星期四2）、纖維包埋將酶溶液在高聚物的有機(jī)溶劑溶液中乳化，然后通過多孔噴絲頭將乳化液擠壓進(jìn)入凝結(jié)液中，即形成絲狀的纖維包埋體，酶即包埋在纖維束中。血纖維不會(huì)引起抗體形成，且無毒。在檸檬酸緩沖液中使酶和血纖蛋白原及凝血酶混合、便制得血纖蛋白包埋的固定化酶。酶分子的氨基和血纖蛋白的谷氨酰胺殘基之間發(fā)生交聯(lián)而將酶固定化?，F(xiàn)在是13頁\一共有97頁\編輯于星期四此法是將酶包埋于具有半透性聚合物膜的微囊內(nèi)。它使酶存在于類似細(xì)胞內(nèi)的環(huán)境中，可以防止酶的脫落，防止微囊外環(huán)境直接接觸．從而增加了酶的穩(wěn)定性．同時(shí)，小分子底物能通過膜與酶作用，產(chǎn)物經(jīng)擴(kuò)散而輸出。微囊一般直徑約1～100um，膜厚約100nm，膜上孔徑約3.6nm，表面積與體積之比極大，物質(zhì)能很快達(dá)到平衡，能有效的包埋許多種酶。同時(shí)、可用不同類型、不同濃度的酶、細(xì)胞提取物或細(xì)胞，不同組成和含量的膜包裹組建成人工細(xì)胞.因此，此法在醫(yī)療上極為有用。例如固定化天門冬酰胺酶(治療白血病)就是用這種方法制成的微膠囊。微膠囊的制備方法有4種。３)、微囊化法（半透膜包埋法）現(xiàn)在是14頁\一共有97頁\編輯于星期四①界面沉淀法。是利用某些高聚物在水相和有機(jī)相的界面上溶解度極低而形成膜，從而將酶包埋的方法。如，含有高濃度血紅蛋白的酶溶液在與水不互溶、沸點(diǎn)比水低的有機(jī)相中乳化，加入油溶性表面活性劑，形成油包水的微滴，再將溶于有機(jī)溶劑的高聚物在攪拌下加入乳化液中，然后加入一種不溶解高聚物的有機(jī)溶劑．使高聚物在油一水界面上沉淀形成膜，最后移于水相，從而制成固定化酶。作為高聚物有硝酸纖維素、聚苯乙烯和聚甲基丙烯酸甲酯等。如“人造細(xì)胞”制備：25ml10%％血紅蛋白水溶液(內(nèi)含適當(dāng)酶）?，F(xiàn)在是15頁\一共有97頁\編輯于星期四②界面聚合法。界面聚合法是將疏水性和親水性單體在界面進(jìn)行聚合，形成半透膜,使酶包埋于半透膜微囊中。

此法曾用來制備Asn酶、脲酶等。制備方法一般是：將酶水溶液與親水單體(如乙二醇)用一種水不溶混的有機(jī)溶劑制成乳化液，再將溶于同一有機(jī)溶劑疏水單體(如多異氰酸)溶液在攪拌下加入到上述乳化液，便在乳化液中的水相和有機(jī)溶劑之間的界面發(fā)生聚合化。這樣水相中酶便包埋在聚合體(聚脲)膜內(nèi)。（例如用含酶的10％血紅蛋白水溶液與己甲叉二胺的水溶液混合，立即在1％Span85的氯仿-環(huán)已烷中分散乳化,加人癸二酰氯(疏水單體)后，便在油-水界面發(fā)生聚合反應(yīng)，棄除上清液，加入Tween-20去乳化，洗除有機(jī)溶劑，除去未聚合單體后，轉(zhuǎn)入水相，制得固定化酶。）現(xiàn)在是16頁\一共有97頁\編輯于星期四③液體干燥法。此法曾用乙基纖維素和聚苯乙烯包埋過氧化氫酶、脂肪酶等。它是將一種聚合物溶于一種沸點(diǎn)比水低，且與水不混溶的溶劑中。加入酶液后，加入油溶性表面活性劑為乳化劑使之乳化。再把它分散于含有保護(hù)性膠質(zhì)如明膠、聚丙烯醇和表面活性劑的水溶液中，第二次乳化。在不斷攪拌下，低溫真空除去有機(jī)溶劑，便得含酶微囊。常用聚合體有乙基纖維素、聚苯乙烯、氯橡皮等，有機(jī)溶劑有苯、環(huán)己烷和氯仿?，F(xiàn)在是17頁\一共有97頁\編輯于星期四④紅血球包埋法。在高滲溶液中紅細(xì)胞膨脹伸展后，細(xì)胞內(nèi)血紅蛋白漏出，同時(shí)胞外蛋白也能擴(kuò)散進(jìn)紅血球．再放進(jìn)等滲溶液中，紅血球膜又回復(fù)至正常狀態(tài)和透性，進(jìn)入的酶不會(huì)漏出來?，F(xiàn)在是18頁\一共有97頁\編輯于星期四

⑤脂質(zhì)體包埋法。上述微囊法是一種半透性膜將酶包埋，近年來采用雙層脂質(zhì)體形成極細(xì)球粒包埋酶。例如：將卵磷脂、膽甾醇和二鯨臘磷酯按7：2：1溶于氯仿中。再加入酶液，混合物在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中，在氮?dú)庀?2℃轉(zhuǎn)動(dòng)乳化。然后在室溫下保持2h，再在氮?dú)鈿饬髦校?℃用超聲波處理10s，在室溫下保持2h，過Sepharose6B柱，收集脂質(zhì)體，離心分離脂質(zhì)體，所得球粒懸浮于緩沖液中，繼續(xù)超聲波處理，并過Sepharose（瓊脂糖凝膠）6B柱，可得含酶的微囊。這種微囊液膜當(dāng)?shù)孜锂a(chǎn)物穿過時(shí)、與膜的徑無關(guān)。但與產(chǎn)物或底物對(duì)膜成分的溶解度有關(guān)?，F(xiàn)在是19頁\一共有97頁\編輯于星期四優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)操作簡(jiǎn)單，對(duì)酶活力有影響（但?。m合于酶甚至是細(xì)胞。存在擴(kuò)散限制，不適合于底物或產(chǎn)物分子過大的酶催化反應(yīng)；容易發(fā)生酶的漏失?，F(xiàn)在是20頁\一共有97頁\編輯于星期四3、共價(jià)結(jié)合定義：酶分子與載體間以共價(jià)鍵作用而實(shí)現(xiàn)結(jié)合的固定方法。①對(duì)載體的要求：盡量選擇親水性強(qiáng)的載體結(jié)構(gòu)疏松，表面積大，有一定的機(jī)械強(qiáng)度與酶共價(jià)反應(yīng)的條件溫和非專一性鍵合易獲得現(xiàn)在是21頁\一共有97頁\編輯于星期四②對(duì)酶(蛋白)上結(jié)合基團(tuán)的要求現(xiàn)在是22頁\一共有97頁\編輯于星期四載體活化共價(jià)法的反應(yīng)條件較為劇烈，因此一般選擇首先將載體的功能基團(tuán)進(jìn)行活化，然后再加入酶進(jìn)行偶連。

活化原則：不影響酶活性中心，酶活性不能損失過多；偶連試劑的獲得價(jià)格和安全性。

現(xiàn)在是23頁\一共有97頁\編輯于星期四1)、溴化氫法現(xiàn)在是24頁\一共有97頁\編輯于星期四2）、乙基氯甲酸酯法

3）、碳二亞胺法現(xiàn)在是25頁\一共有97頁\編輯于星期四4）、重氮法現(xiàn)在是26頁\一共有97頁\編輯于星期四5）、3-氨基丙基三乙基氧硅烷法現(xiàn)在是27頁\一共有97頁\編輯于星期四6）、戊二醛法現(xiàn)在是28頁\一共有97頁\編輯于星期四優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)結(jié)合牢固，不易脫落；反應(yīng)條件苛刻，操作復(fù)雜，酶易發(fā)生結(jié)構(gòu)的破壞而降低活性?，F(xiàn)在是29頁\一共有97頁\編輯于星期四4、交聯(lián)法定義：利用雙功能或多功能試劑在酶分子間，酶分子與惰性蛋白（或載體）間進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)。

雙功能或多功能試劑有：戊二醛、己二胺、順丁烯二酸酐、雙偶氮苯。

1）、共價(jià)交聯(lián)法（載體交聯(lián)法）是指酶分子在雙功能試劑或多功能試劑的作用下，與一些惰性蛋白或水不溶性的載體之間發(fā)生交聯(lián)。

現(xiàn)在是30頁\一共有97頁\編輯于星期四2）、交聯(lián)酶法（直接交聯(lián)或交聯(lián)可溶性酶法）借助雙功能試劑使可溶性酶分子之間發(fā)生交聯(lián)，制成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的固定化酶的方法。現(xiàn)在是31頁\一共有97頁\編輯于星期四優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)操作簡(jiǎn)單，但固定化的條件控制比較困難；酶活力影響較大?，F(xiàn)在是32頁\一共有97頁\編輯于星期四5、無載體固定化1）、定義就是在無外來載體的情況下固定酶的方法。現(xiàn)在是33頁\一共有97頁\編輯于星期四現(xiàn)在是34頁\一共有97頁\編輯于星期四現(xiàn)在是35頁\一共有97頁\編輯于星期四3）、交聯(lián)酶聚集體

采用物理方法使酶分子聚集，再經(jīng)交聯(lián)劑交聯(lián)而成的不溶性酶聚集體?，F(xiàn)在是36頁\一共有97頁\編輯于星期四現(xiàn)在是37頁\一共有97頁\編輯于星期四優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)回收方便，便于重復(fù)利用；催化活性高；穩(wěn)定好。制備較難，固定化成本高。現(xiàn)在是38頁\一共有97頁\編輯于星期四6、不同固定方法的優(yōu)缺點(diǎn)及聯(lián)用現(xiàn)在是39頁\一共有97頁\編輯于星期四1、酶活性的改變1)、構(gòu)象改變2）、屏蔽效應(yīng)四、固定化酶的性質(zhì)現(xiàn)在是40頁\一共有97頁\編輯于星期四3）、微擾由于固定化載體的親水、疏水性質(zhì)與介質(zhì)的介電常數(shù)等直接或間接地影響酶的催化能力，或影響酶對(duì)效應(yīng)物作出反應(yīng)的能力。4）、分配效應(yīng)跟載體的種類,底物,產(chǎn)物的性質(zhì)以及反應(yīng)離子強(qiáng)度有關(guān)。（所帶電荷，極性）現(xiàn)在是41頁\一共有97頁\編輯于星期四5）、擴(kuò)散限制

現(xiàn)在是42頁\一共有97頁\編輯于星期四2、穩(wěn)定性的改變現(xiàn)在是43頁\一共有97頁\編輯于星期四3、最適溫度

溫度一般提高現(xiàn)在是44頁\一共有97頁\編輯于星期四4、最適PH載體電荷性質(zhì)的影響造成酶催化的微環(huán)境發(fā)生改變：載體帶負(fù)電，PH升高載體帶正電，PH下降現(xiàn)在是45頁\一共有97頁\編輯于星期四5、動(dòng)力學(xué)載體的帶電性質(zhì)和極性可以影響固定化酶的表觀Km值：載體所帶電荷與底物的電荷相反時(shí)，Km值減小，親和力增大，反之親和力減??；載體的極性與底物的極性相似時(shí)，Km值減小，親和力增大，反之親和力減小?，F(xiàn)在是46頁\一共有97頁\編輯于星期四6、專一性

作用于低分子底物的酶，特異性不會(huì)改變;

既可作用于大分子底物，又能作用于低分子底物的酶，特異性將發(fā)生改變，大分子底物由于空間位阻的影響將難于接近酶分子，小分子則不受影響?，F(xiàn)在是47頁\一共有97頁\編輯于星期四五、固定化酶的表征（評(píng)價(jià)）1、酶活力固定化酶的活力即是固定化酶催化某一特定化學(xué)反應(yīng)的能力。其大小可以用在一定條件下它所催化的某一反應(yīng)的反應(yīng)初速度來表示。它的單位可定義為每毫克干重固定化酶每分鐘轉(zhuǎn)化底物的量：用μmol/min·mg。活力測(cè)定方法分為：間歇測(cè)定：在攪拌或振蕩反應(yīng)器中，在與溶液酶同樣測(cè)定條件下進(jìn)行，然后間隔一定時(shí)間取樣，過濾后按常規(guī)進(jìn)行測(cè)定。連續(xù)測(cè)定：固定化酶裝入具有恒溫水夾套的柱中，以不同流速流過底物，測(cè)定酶柱流出液，根據(jù)流速和反應(yīng)速度之間關(guān)系，算出酶活力?，F(xiàn)在是48頁\一共有97頁\編輯于星期四2、酶比活力一般采用每克固定化酶所具有的酶活力單位數(shù)3、固定化效率酶在固定化時(shí)并非所有酶都被固定，總有一部分沒有固定，因此需要計(jì)算酶與載體結(jié)合的百分率，體現(xiàn)固定化的效果?，F(xiàn)在是49頁\一共有97頁\編輯于星期四4、活力回收率同時(shí)酶在固定化后會(huì)造成程度不等的酶活力損失，因此需要測(cè)定活力回收率。固定化效率＞活力回收率5、相對(duì)酶活：具有相同酶蛋白量的固定化酶活力與游離酶活力的比值。反映固定化酶的應(yīng)用價(jià)值。

現(xiàn)在是50頁\一共有97頁\編輯于星期四6、操作半衰期（用來評(píng)價(jià)固定化酶的穩(wěn)定性和實(shí)用性）固定化酶在連續(xù)長(zhǎng)期使用過程中，活力會(huì)發(fā)生衰減即半衰期(t1/2)，酶活性達(dá)到原有酶活性一半時(shí)所需的時(shí)間?？砂聪率接?jì)算：式中ED為反應(yīng)t時(shí)的酶濃度，E為原有酶濃度。一些固定化酶的半衰期如下表:現(xiàn)在是51頁\一共有97頁\編輯于星期四現(xiàn)在是52頁\一共有97頁\編輯于星期四

六、固定化酶的應(yīng)用

1、固定化酶在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用：現(xiàn)已用于工業(yè)化生產(chǎn)的固定化酶主要有：

(1)氨基?；福哼@是世界上第一種工業(yè)化生產(chǎn)的固定化酶，1969年，日本田邊制藥公司將從米曲霉中提取分離得到的氨基?；?，用DEAE-葡聚糖凝膠為載體通過離子鍵結(jié)合法制成固定化酶，用來拆分DL-乙酰氨基酸，連續(xù)生產(chǎn)L-氨基酸；生產(chǎn)成本僅為用游離酶生產(chǎn)成本的60％左右?，F(xiàn)在是53頁\一共有97頁\編輯于星期四(2)葡萄糖異構(gòu)酶

這是世界上生產(chǎn)規(guī)模最大的一種固定化酶。將培養(yǎng)好的含葡萄糖異構(gòu)酶的放線菌細(xì)胞用60～65℃熱處理15min，該酶就固定在菌體上，制成固定化酶，用于連續(xù)生產(chǎn)果葡糖漿。此固定化酶在國(guó)內(nèi)外均進(jìn)行過廣泛的研究和應(yīng)用，1973年就已用于工業(yè)化生產(chǎn)。固定化葡萄糖異構(gòu)酶的制備，除用上述熱處理法外，也可用吸附法、結(jié)合法、凝膠包埋法、交聯(lián)法或雙重固定化法等進(jìn)行固定化?，F(xiàn)在是54頁\一共有97頁\編輯于星期四(3)天門冬氨酸酶

1973年日本用聚丙烯酰胺凝膠為載體，將具有高活力天門冬氨酸酶的大腸桿菌菌體包埋制成固定化天門冬氨酸酶，用于工業(yè)化生產(chǎn)，將延胡索酸轉(zhuǎn)化生產(chǎn)天門冬氨酸。1978年以后，改用角叉菜膠為載體制備固定化酶，也可將天門冬氨酸酶從大腸桿菌細(xì)胞中提取分離出來，再用離子鍵結(jié)合法制成固定化酶，用于工業(yè)化生產(chǎn)?，F(xiàn)在是55頁\一共有97頁\編輯于星期四(4)青霉素?；福哼@是在醫(yī)藥工業(yè)上廣泛應(yīng)用的一種固定化酶?？捎枚喾N方法固定化。1973年已用于工業(yè)化生產(chǎn)，用于制造各種半合成青霉素和頭孢霉素。用同一種固定化青霉素酰化酶，只要改變pH等條件，就既可以催化青霉素或頭孢霉素水解生成6-氨基青霉烷酸(6-APA)或7-氨基頭孢霉烷酸(7-ACA)，也可以催化6-APA或7-ACA與其他的羧酸衍生物進(jìn)行反應(yīng)，以合成新的具有不同側(cè)鍵基團(tuán)的青霉素或頭孢霉素。

其他用于工業(yè)生產(chǎn)中的固定化酶見下表現(xiàn)在是56頁\一共有97頁\編輯于星期四現(xiàn)在是57頁\一共有97頁\編輯于星期四酶反應(yīng)器的選擇定義：以固定化酶作為催化劑進(jìn)行酶促反應(yīng)的設(shè)備。類型：類似于發(fā)酵過程中的生物反應(yīng)器?，F(xiàn)在是58頁\一共有97頁\編輯于星期四罐式攪拌結(jié)合牢固，載體機(jī)械強(qiáng)度高流化床和鼓泡式固定化酶的顆粒不宜過大，密度接近1固定化床結(jié)合牢固，載體機(jī)械強(qiáng)度高，顆粒不宜過小膜式顆粒狀以外的其他固定化酶現(xiàn)在是59頁\一共有97頁\編輯于星期四2、固定化酶在傳感器方面的應(yīng)用傳感器：獲取、放大與處理信息的裝置。生物傳感器：以固定化的生物材料作為敏感元件（探頭）（1）酶?jìng)鞲衅髅競(jìng)鞲衅魇怯晒潭ɑ概c能量轉(zhuǎn)換器(電極、場(chǎng)效應(yīng)管、離子選擇場(chǎng)效應(yīng)管等)密切結(jié)合而成的傳感裝置，是生物傳感器的一種。已廣泛應(yīng)用于臨床診斷、工業(yè)發(fā)酵過程控制和環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域。其中研究最多、應(yīng)用最廣的是酶電極?，F(xiàn)在是60頁\一共有97頁\編輯于星期四親和型與催化型，酶屬于催化型。現(xiàn)在是61頁\一共有97頁\編輯于星期四（2）酶電極酶電極是由固定化酶與各種電極密切結(jié)合的傳感裝置。電位型和電流型。（P212，表9-1）葡萄糖氧化酶電極（電流型）

1962年Clark和Lyons提出模型，1967年Updike和Hicks首先制造出葡萄糖氧化酶電極并把它用于葡萄糖的定量分析。（見下圖）

現(xiàn)在是62頁\一共有97頁\編輯于星期四

用聚丙烯酰胺凝膠包埋法將葡萄糖氧化酶固定化，制成厚度為20～50μm的酶膜，再與氧電極和使氧容易通過的聚四氟乙烯等高分子薄膜密切結(jié)合，組成葡萄糖氧化酶電極。使用時(shí)，把酶電極浸入樣品溶液中，樣品液中的葡萄糖擴(kuò)散到酶膜中，酶催化葡萄糖與氧反應(yīng)，生成葡萄糖酸，使氧被消耗，再由氧電極測(cè)定氧濃度的變化，即可知道樣品中葡萄糖的濃度?，F(xiàn)在是63頁\一共有97頁\編輯于星期四青霉素酶電極以固定化青霉素酶的酶膜與pH電極結(jié)合而成。將青霉素酶固定在聚丙烯酰胺凝膠或光交聯(lián)樹脂膜內(nèi)，然后緊貼在玻璃(pH)電極上即成。當(dāng)酶電極浸入含青霉素的溶液中時(shí)，青霉素酶催化青霉素水解生成青霉烷酸，引起溶液中氫離子濃度增加，通過pH電極測(cè)出pH值變化，即可測(cè)出樣品溶液中青霉素的含量?，F(xiàn)在是64頁\一共有97頁\編輯于星期四（3）離子敏場(chǎng)效應(yīng)晶體管酶?jìng)鞲衅鳜F(xiàn)在是65頁\一共有97頁\編輯于星期四（4）其它酶?jìng)鞲衅鳎≒214）1、熱敏電阻（圖9-12）2、光纖（圖9-13）3、聲波現(xiàn)在是66頁\一共有97頁\編輯于星期四3、固定化酶在醫(yī)療治療上的應(yīng)用：（1）作為治療藥物固定化酶由于其高穩(wěn)定性，低免疫性，使其在作為治療藥物時(shí)，較之溶液酶，表現(xiàn)出極大的優(yōu)勢(shì)。作為治療藥物，溶液酶具有一些“致命”弱點(diǎn)：①酶作為異體物質(zhì)，反復(fù)應(yīng)用會(huì)導(dǎo)致免疫反應(yīng)②酶是蛋白質(zhì)，在體內(nèi)易被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)移除和被蛋白酶水解破壞。③由于稀釋效應(yīng)，藥物酶無法集中于靶器官組織以達(dá)到治療所需的最適高濃度。溶液酶的這些缺點(diǎn)，通過選擇適宜的載體與方法將它們固定化以后就能逐一地加以解決。現(xiàn)在是67頁\一共有97頁\編輯于星期四（2）作為“人工臟器”

固定化酶可做成“人工臟器”參與體外循環(huán)，其應(yīng)用主要有兩方面：

a.用于除去有害的毒性物質(zhì)及有潛在毒害作用的代謝廢物

如清除尿毒癥病人體內(nèi)積累的尿素；進(jìn)行這類應(yīng)用時(shí)除了要考慮半壽期、免疫過敏等問題外，還要在“人工臟器”中偶聯(lián)多種組成成分以徹底除去毒性產(chǎn)物。如處理尿素時(shí)，除了脲酶外，還要解決尿素分解生成氨的問題，這就需要另外加入谷氨酰胺合成酶或加入去氨的樹脂等?，F(xiàn)在是68頁\一共有97頁\編輯于星期四b.除去(一種或多種)氨基酸，使需要這些物質(zhì)的病變組織“餓死”治療時(shí)只需將患者的血液引出體外，通過由固定化酶等構(gòu)成的“人工臟器”加以處理，然后再流回體內(nèi)。現(xiàn)在是69頁\一共有97頁\編輯于星期四

酶應(yīng)用方式

載體應(yīng)用對(duì)象半壽期

優(yōu)缺點(diǎn)尿酸酶門冬酰胺酶脲酶脂肪酶酪氨酸酶谷氨酰胺酶β-葡糖苷酸酶β-葡糖苷酸酶膽紅素葡糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶過氧化氫酶組成體外循環(huán)移接體內(nèi)循環(huán)口服體內(nèi)循環(huán)體內(nèi)循環(huán)體內(nèi)循環(huán)體內(nèi)循環(huán)體內(nèi)循環(huán)體內(nèi)循環(huán)血液透析裝置Dacron脈管修復(fù)用和移接管尼龍微囊腸衣包被可溶性的聚順丁烯二酸與聚丙烯酸聚合物可溶性的聚乙二醇血影細(xì)胞脂質(zhì)體和聚乙烯吡咯烷酮結(jié)合的微粒體尼龍微囊急淋白血病尿胰機(jī)能不全癌瘤癌瘤取代和補(bǔ)償先天缺失補(bǔ)償先天缺失黃疸約2d1d1d24h24h18h短暫優(yōu)點(diǎn)：加速尿酸移去缺點(diǎn)：需移去尿素優(yōu)點(diǎn)：無免疫原性質(zhì)優(yōu)點(diǎn)：易缺點(diǎn)：消亡快；載體有毒優(yōu)點(diǎn)：抗酸優(yōu)點(diǎn)：最適pH向中性偏優(yōu)點(diǎn)：無抗原性半壽期長(zhǎng)優(yōu)點(diǎn)：抗原性優(yōu)點(diǎn)：載體能被代謝缺點(diǎn)：對(duì)載體內(nèi)含物敏感優(yōu)點(diǎn)：不需分離酶缺點(diǎn)：需輔助因子擴(kuò)散優(yōu)點(diǎn)：能做成糊狀缺點(diǎn)：在唾液很快移除現(xiàn)在是70頁\一共有97頁\編輯于星期四4、固定化酶與基礎(chǔ)理論

用固定化酶研究亞基間關(guān)系：在適宜的條件下將寡聚體酶的一個(gè)亞基和載體偶聯(lián)固定變性并除去其他亞基復(fù)性及活性檢測(cè)亞基重組和酶性質(zhì)的測(cè)定

現(xiàn)在是71頁\一共有97頁\編輯于星期四七、固定化酶和水溶性酶比較具有以下特點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：(1)極易將固定化酶與底物、產(chǎn)物分開；產(chǎn)物溶液中沒有酶的殘留，簡(jiǎn)化了提純工藝.(2)可以在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)反復(fù)使用，有利于工藝的連續(xù)化、管道化。(3)酶反應(yīng)過程可以嚴(yán)格控制，有利于工藝自動(dòng)化和微電腦化。(4)在絕大多數(shù)情況下提高了酶的穩(wěn)定性。(5)較能適應(yīng)于多酶反應(yīng)。(6)酶的使用效率提高，產(chǎn)物得率提高，產(chǎn)品質(zhì)量有保障，成本低?，F(xiàn)在是72頁\一共有97頁\編輯于星期四缺點(diǎn)：(1)酶固定化時(shí)酶的活力有所損失。同時(shí)也增加了固定化的成本，使工廠開始投資大。(2)比較適應(yīng)水溶性底物和小分子底物。(3)與完整細(xì)胞比較，不適于多酶反應(yīng)，特別是需要輔因子的反應(yīng)，同時(shí)對(duì)胞內(nèi)酶需經(jīng)分離后，才能固定化?，F(xiàn)在是73頁\一共有97頁\編輯于星期四第二節(jié)輔酶及細(xì)胞的固定一、輔酶固定1、輔基的固定：1）、概念：將載體與連接臂連接，再以適當(dāng)反應(yīng)與輔基連接。2）、載體：瓊脂糖，纖維素，玻璃珠，及合成高分子載體，他們均具有：非特異性吸附，多孔，穩(wěn)定性好，耐一定的機(jī)械強(qiáng)度。3）、連接臂：如溴化氰等小分子?，F(xiàn)在是74頁\一共有97頁\編輯于星期四2、輔酶的固定1）方法載體結(jié)合法現(xiàn)在是75頁\一共有97頁\編輯于星期四現(xiàn)在是76頁\一共有97頁\編輯于星期四包埋法類似于酶的包埋現(xiàn)在是77頁\一共有97頁\編輯于星期四3、輔酶的再生1）、酶法再生現(xiàn)在是78頁\一共有97頁\編輯于星期四現(xiàn)在是79頁\一共有97頁\編輯于星期四2）、電化學(xué)再生法介質(zhì)可避免電極的吸附作用和幫助電子定向傳遞。提高輔酶的再生效率?，F(xiàn)在是80頁\一共有97頁\編輯于星期四二、固定化細(xì)胞1、概念：就是將具有一定生理功能的生物細(xì)胞用一定的方法將其固定，作為固定生物催化劑而加以利用的一門技術(shù)?，F(xiàn)在是81頁\一共有97頁\編輯于星期四2、固定化細(xì)胞的特點(diǎn)1）、優(yōu)點(diǎn)省去了酶分離的成本；無需輔助因子的固定與再生；耐受性增加，細(xì)胞可重復(fù)使用；保持酶在細(xì)胞內(nèi)的原始狀態(tài)，穩(wěn)定性增加?，F(xiàn)在是82頁\一共有97頁\編輯于星期四2）、缺點(diǎn)細(xì)胞膜和壁會(huì)阻礙底物的滲透與擴(kuò)散；副產(chǎn)物多，難分離目的產(chǎn)物；維持固定化細(xì)胞的活性較固定化酶難。現(xiàn)在是83頁\一共有97頁\編輯于星期四3、固定方法現(xiàn)在是84頁\一共有97頁\編輯于星期四1）、吸附法天然載體：纖維素、葡聚糖、瓊脂糖、明膠、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃等；人工載體：多孔塑料、金屬網(wǎng)絲、微載體和中空明膠以及合成的離子交換介質(zhì)?，F(xiàn)在是85頁\一共有97頁\編輯于星期四2）、共價(jià)交聯(lián)3）、包埋法瓊脂糖凝膠；海藻酸鈣凝膠；角叉菜膠；明膠；聚丙烯酰胺凝膠；光交聯(lián)樹脂。現(xiàn)在是86頁\一共有97頁\編輯于星期四4）、無載體固定化1）、用雙功能試劑或多功能試劑進(jìn)行細(xì)胞間的交聯(lián)；2）、誘導(dǎo)細(xì)胞形成細(xì)胞團(tuán)，誘導(dǎo)物有：鈦或鋯的氫氧化物聚合物，但鈦或鋯的氫氧化物通常要對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒害；3）、自聚體。現(xiàn)在是87頁\一共有97頁\編輯于星期四４、固定化細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)如下:(1)省去了酶的分離手續(xù)．為多酶系統(tǒng)，無須輔因子再生。(2)細(xì)胞生長(zhǎng)快、而且多、反應(yīng)快。(3)可以連續(xù)發(fā)酵，節(jié)約了成本，而且在蒸餾和提取前不用分離去細(xì)胞，能一邊徘出發(fā)酵液，一邊進(jìn)行培養(yǎng)，排除了產(chǎn)物抑制和消耗。(4)保持酶在細(xì)胞內(nèi)的原始狀況，增加了酶的穩(wěn)定、特別是對(duì)污染因子的抵抗力增加?，F(xiàn)在是88頁\一共有97頁\編輯于星期四５、固定化細(xì)胞存在的缺點(diǎn)：(1)必須保持菌體的完整，防止菌體自溶，否則，將影響產(chǎn)品純度。

(2)必須防止細(xì)胞內(nèi)蛋白酶對(duì)所需酶的分解，同時(shí)，需抑制胞內(nèi)其他酶的活性阻止副產(chǎn)物的形成。

(3)細(xì)胞膜、壁會(huì)阻礙底物滲透和擴(kuò)散?，F(xiàn)在是89頁\一共有97頁\編輯于星期四4、固定化微生物細(xì)胞的應(yīng)用1）、利用固定化微生物細(xì)胞生產(chǎn)