PCR基因擴增課件

PCR基因擴增一、實驗?zāi)康耐ㄟ^本實驗學習PCR反應(yīng)的基本原理與實驗技術(shù)二、實驗原理PCR是一種由引物介導(dǎo)的選擇性體外擴增DNA的方法，由美國人B.Mullis于1983年發(fā)明包括三個基本步驟:變性（Denature）：目的雙鏈DNA片段在94℃下解鏈退火（Anneal）：兩種寡核苷酸引物在適當溫度（50℃左右）下與模板上的目的序列通過氫鍵配對延伸（Extension）：在TaqDNA聚合酶合成DNA的最適溫度下，以目的DNA為模板進行合成由這三個基本步驟組成一輪循環(huán)，理論上每一輪循環(huán)將使目的DNA擴增一倍，這些經(jīng)合成產(chǎn)生的DNA又可作為下一輪循環(huán)的模板，所以經(jīng)25～35輪循環(huán)就可使DNA擴增達106倍引物PCR反應(yīng)產(chǎn)物的特異性由一對上下游引物所決定引物設(shè)計和選擇目的DNA序列區(qū)域時遵循下列原則：引物長度約為16～30bp引物中G+C含量通常為40%～60%，可按Tm＝4(G+C)+2(A+T)粗略估計引物的解鏈溫度四種堿基應(yīng)隨機分布，在3’端不存在連續(xù)3個G或C，因這樣易導(dǎo)致錯誤引發(fā)引物3’端最好與目的序列閱讀框架中密碼子第一或第二位核苷酸對應(yīng)，以減少由于密碼子擺動產(chǎn)生的不配對在引物內(nèi)，尤其在3’端應(yīng)不存在二級結(jié)構(gòu)兩引物之間尤其在3’端不能互補，以防出現(xiàn)引物二聚體，減少產(chǎn)量引物5’端對擴增特異性影響不大，可引入酶切位點或突變位點引物不與模板結(jié)合位點以外的序列互補簡并引物應(yīng)選用簡并程度低的密碼子引物的濃度一般為0.1～0.5μmol/L，引物濃度偏高會引起錯配和非特異性產(chǎn)物擴增，引物濃度偏低則降低產(chǎn)量dNTPdNTP常用的濃度為20～200μmol/，而且4種dNTP的終濃度相等，以減少合成中由于某種dNTP的不足而出現(xiàn)的錯誤摻入dNTP濃度過高雖可加快反應(yīng)速度，但會增加堿基的錯誤摻入率，同時會抑制TaqDNA聚合酶的反應(yīng)活性；適當?shù)牡蜐舛葧岣叻磻?yīng)的精確度注意協(xié)調(diào)Mg2+濃度和dNTP濃度之間的關(guān)系Mg2+Mg2+濃度會影響TaqDNA聚合酶的活性、真實性，影響引物退火、解鏈溫度，影響產(chǎn)物的特異性以及引物二聚體的形成等通常Mg2+濃度范圍為0.5～2mmol/L在PCR反應(yīng)混合物中，應(yīng)盡量減少有高濃度的帶負電荷的基團，例如磷酸基團或EDTA等可能影響Mg2+濃度的物質(zhì)，以保證最適Mg2+濃度模板PCR反應(yīng)必須以DNA為模板進行擴增，單鏈分子、雙鏈分子、線狀分子或環(huán)狀分子均可以作為模板DNA（線狀分子比環(huán)狀分子的擴增效果稍好）模板的數(shù)量和純度均會影響PCR結(jié)果：一般反應(yīng)中的模板數(shù)量為102

～105個拷貝。模板拷貝數(shù)過多可能會增加非特異性產(chǎn)物模板DNA中的雜質(zhì)也會影響PCR的效率反應(yīng)緩沖液一般含100mmol/LTris·Cl（20℃下pH8.3-8.8）,500mmol/LKCl和0.1％的明膠，有時候還有適當濃度的Mg2+Tris·Cl是一種雙極性離子緩沖液，主要靠其調(diào)節(jié)pH，使TaqDNA聚合酶的作用環(huán)境維持偏堿性KCl有利于引物的退火，但濃度過高會抑制TaqDNA聚合酶的活性明膠保護酶不變性失活Mg2+影響TaqDNA聚合酶的活性，直接影響反應(yīng)的特異性和擴增DNA的產(chǎn)率反應(yīng)液可加入5mmol/L的二硫蘇糖醇（DDT）或100μg/ml的牛血清白蛋白（BSA），它們可穩(wěn)定酶活性2、PCR反應(yīng)參數(shù)變性退火延伸循環(huán)次數(shù)退火引物退火的溫度和所需時間的長短取決于引物的堿基組成，引物的長度、引物與模板的配對程度以及引物的濃度實際使用的退火溫度比擴增引物的Tm值約低5℃。一般當引物中GC含量高、長度長并與模板完全配對時，應(yīng)提高退火溫度。退火溫度越高，所得產(chǎn)物的特異性越高有些反應(yīng)可將退火與延伸兩步合并，只用兩種溫度（如用60℃和94℃）完成整個擴增循環(huán)，既省時間又提高了特異性退火一般僅需數(shù)秒鐘即可完成，反應(yīng)中所需時間主要是為使整個反應(yīng)體系達到合適的溫度。通常退火溫度和時間為37℃～55℃，1-2min延伸延伸反應(yīng)溫度通常為72℃，接近于TaqDNA聚合酶的最適反應(yīng)溫度75℃TaqDNA聚合酶的作用溫度范圍可從20℃～85℃，引物延伸在退火時即已開始延伸時間的長短取決于目的序列的長度和濃度。一般反應(yīng)體系中，TaqDNA聚合酶每分鐘約可合成1kb長的DNA。延伸時間過長會導(dǎo)致產(chǎn)物非特異性增加。對很低濃度的目的序列，則可適當增加延伸反應(yīng)的時間擴增反應(yīng)完成后，都需要一步較長時間（10～30min）的延伸反應(yīng)，以獲得盡可能完整的產(chǎn)物，這對以后進行克隆或測序反應(yīng)尤為重要循環(huán)次數(shù)當其它參數(shù)確定之后，循環(huán)次數(shù)主要取決于DNA濃度一般而言25～30輪循環(huán)已經(jīng)足夠。循環(huán)次數(shù)過多,會使PCR產(chǎn)物中非特異性產(chǎn)物大量增加通常25～30輪循環(huán)擴增后，反應(yīng)中TaqDNA聚合酶已經(jīng)不足，如果此時產(chǎn)物量仍不夠，需要進一步擴增，可將擴增的DNA樣品稀釋103～105倍作為模板，重新加入各種反應(yīng)底物進行擴增，這樣經(jīng)60輪循環(huán)后，擴增水平可達109～10105’3’5’3’DesignprimerswiththissequenceinformationIdenticaltothissequenceReversecomplementofthissequenceDoublestrandedDNAtemplate5’3’5’3’PCRCycle1PrimersTaqTaqDoublestrandedDNAtemplate5’5’3’3’PCRCycle1Denaturation95℃

strandsseparate

PrimersTaqTaqTaqpolymeraseisthermostable3’5’5’3’Annealing~55℃TaqbindsTaqTaqPCRCycle13’5’5’3’Extension72℃Taqcopies

DNA

strand

dNTPsTaqTaqTaqsynthesisesDNAinthe5’to3’direction

PCRCycle13’5’5’3’TaqTaqTaqsynthesisesDNAinthe5’to3’directionPCRCycle1Extension72℃Taqcopies

DNA

strand

dNTPs3’5’5’3’TaqsynthesisesDNAinthe5’to3’directionPCRCycle1TaqTaqExtension72℃Taqcopies

DNA

strand

dNTPs3’5’5’3’5’3’5’3’Endcycle1

PCRCYCLE13’5’5’3’5’5’3’3’Annealing~55℃PrimersbindPCRCycle2Extension72℃TaqcopiesDNAstrandPCRCycle2TwosinglestrandsofcorrectlengthPCRCycle2Endcycle2

Endcycle3

Endcycle4

FollowingncyclesofPCRtherewillbeNo(1+Y)ncopiesNo initialnumberoftargetsY efficiencyofPCRreactionn cyclenumber三、儀器、材料與試劑PCR熱循環(huán)儀移液槍（配套槍頭）DNA模板（質(zhì)粒R-pGEX-4T-1，R指代外源基因）2.5mmol/LdNTP（TaKaRa）10×PCR緩沖液（TaKaRa）25mmol/LMgCl2（TaKaRa）引物1、引物2（5pmol/μL）引物1：5’-CGGAATTCATGGACGGTCAGA-3’引物2：5’-GCGTCGACTCATTCAGATTTGCG-3’TaqDNA聚合酶（TaKaRa）四、實驗步驟PCR反應(yīng)體系的配制，即在0.5mLEppendorf管內(nèi)配制25μL反應(yīng)體系，按下表準確加入各反應(yīng)物反應(yīng)物體積（μL）10×PCR緩沖液2.525mmol/LMgCl21.52.5mmol/LdNTP2.0引物12.0引物22.0TaqDNA聚合酶0.2模板DNA(1ng/μL)2.0加ddH2O至25μL12.8PCR反應(yīng)條件的設(shè)置，即在PCR熱循環(huán)儀上設(shè)置程序，按程序設(shè)置的條件進行擴增94℃預(yù)變性5min