生物樣品的預處理

生物樣品的預處理第1頁/共48頁生物樣品的預處理不同來源樣品分離的預處理植物組織提取物的制備動物組織提取物的制備細菌中重組蛋白的提取制備細胞的破碎與分離常見的方法細胞破碎技術(shù)的發(fā)展方向第2頁/共48頁1不同來源樣品分離的預處理樣品來源：植物、動物、微生物，例如：植物或動物細胞培養(yǎng)液、微生物發(fā)酵液、動物血液、乳液和動植物組織提取液等。生物樣品中往往含有大量有機物、無機物及各種微量元素等，因此對目標組分進行初步富集和分離，對干擾組分進行初步去除等工作都屬于預處理。第3頁/共48頁生物樣品特征：目標產(chǎn)物濃度普遍較低，懸浮液大部分是“水”，組分復雜，是含有細胞、細胞碎片、蛋白質(zhì)、核酸、脂類、糖類、無機鹽類等多種物質(zhì)的混合物；分離過程很容易發(fā)生失活現(xiàn)象，pH、離子強度、溫度等變化常常造成產(chǎn)物的失活；性質(zhì)不穩(wěn)定，易隨時間變化，如受空氣氧化，微生物污染，蛋白水解作用等。第4頁/共48頁分離過程注意點迅速加工，縮短停留時間控制好操作溫度和pH減少和避免與空氣接觸受污染的機會總體設計好各組分的分離順序第5頁/共48頁不同來源樣品分離的預處理1.1植物組織中活性物質(zhì)的提取1.1.1酶的提取植物組織中所存在的酚類化合物使植物中提取酶的過程變得復雜。植物組織被破壞時，酶和酚類處混合接觸狀態(tài)，很易發(fā)生反應。產(chǎn)物苯醌和單寧酸類會繼續(xù)和酶蛋白反應,使目的酶失去活性。為此去除酚類化合物或避免反應是必須進行的步驟。第6頁/共48頁酚類化合物與蛋白質(zhì)的結(jié)合方式可逆結(jié)合酚類化合物的兩個羥基與蛋白質(zhì)分子形成氫鍵，例如肽鍵的CO端和NH端不可逆結(jié)合酚類化合物的兩個相鄰羥基被氧化為鄰苯醌之后，通過共價鍵與蛋白質(zhì)分子中的自由氨基以及巰基結(jié)合引起蛋白質(zhì)活性基團集合，引起聚集、交叉結(jié)合和沉淀（酶促褐變作用）第7頁/共48頁預處理需要注意：溫度盡可能低提取液的量要保證“充分浸入”加入足量酚類吸附劑加入足量氧化酶抑制劑攪拌轉(zhuǎn)速要恰當pH要控制在合適范圍，一般5.5～7第8頁/共48頁酚類吸附劑的種類：天然和合成的聚合物清蛋白尼龍粉聚乙烯吡咯烷酮-可溶的（PVP）通過-CO-N=與酚羥基形成氫鍵聚乙烯聚吡咯烷酮-不溶的（PVPP）聚乙烯和聚丙烯樹脂，如離子交換樹脂XAD-2、-4和-7聚苯乙烯的離子交換樹脂，包括陰離子交換樹脂（Bio-RadAG1-X8,AG2-X8和Dowex-1）和陽離子交換樹脂（Dowex-50）表面疏水，易吸附帶疏水基團的化合物第9頁/共48頁酚氧化酶抑制劑抗氧化劑：2-巰基乙醇，二硫蘇糖醇(DTT)，二硫赤蘚糖醇(DTE)，抗壞血酸鹽前三種既是多酚氧化酶的抑制者又是醌的清除劑抗壞血酸鹽能阻止醌重新還原成酚，在低濃度的醌存在下就很易被消耗，因此須在相對較高的濃度條件下使用（50mmol/L）第10頁/共48頁1.1.2RNA的提取從植物組織中提取RNA是進行植物分子生物學方面研究的必要前提。Northern雜交分析、純化mRNA以用于體外翻譯或建立cDNA文庫、RT-PCR及差示分析等過程中需要高質(zhì)量的RNA能否有效地去除多糖、酚類化合物、萜類化合物RNase和干擾RNA提取的其它代謝產(chǎn)物是提取高質(zhì)量植物RNA成敗的關(guān)鍵。酚類化合物與RNA不可逆結(jié)合導致RNA活性喪失、用苯酚或氯仿抽提時RNA丟失、形成不溶性復合物多糖會形成難溶的膠狀物，與RNA共沉淀萜類化合物和RNase會造成RNA的化學降解和酶解第11頁/共48頁酚類化合物的干擾及對策還原劑法2-巰基乙醇(ME)、二硫蘇糖醇（DTT）或Cys來防止酚類物質(zhì)被氧化，硼氫化鈉（NaBH4）是可還原醌的還原劑螯合劑法PVP和PVPP中的-CO－N＝基有很強的結(jié)合多酚化合物的能力，其結(jié)合能力隨著多酚化合物中芳環(huán)羥基數(shù)量的增加而加強Tris-硼酸法硼酸可與酚類靠氫鍵形成復合物，抑制了酚類物質(zhì)的氧化及其與RNA的結(jié)合第12頁/共48頁牛血清白蛋白（BSA）法原花色素類物質(zhì)與BSA間可產(chǎn)生類似于抗原－抗體間的相互作用，形成可溶性的或不溶性的復合物，減小了原花色素類物質(zhì)與RNA結(jié)合的機會丙酮法用-70℃的丙酮抽提冷凍研磨后的植物材料,可有效從云杉、松樹、山毛櫸等富含酚類化合物的植物材料中分離到高質(zhì)量的RNA通過Li+或Ca2+沉淀RNA的方法可以將未被氧化的酚類化合物去除。第13頁/共48頁多糖的干擾及對策植物組織往往富含多糖，而多糖的許多理化性質(zhì)與RNA很相似，較難將它們分開。含多糖的RNA沉淀難溶于水，或溶解后產(chǎn)生粘稠狀的溶液，對RNA提取造成較大的干擾。對策：

SDS-鹽酸胍處理；高濃度Na+或K+離子下，苯酚、氯仿抽提；低濃度乙醇沉淀多糖；醋酸鉀沉淀多糖。第14頁/共48頁蛋白雜質(zhì)的影響及對策蛋白質(zhì)是污染RNA樣品的又一個重要因素。由于RNase和多酚氧化酶亦屬于蛋白質(zhì)，因而要獲得完整的、高質(zhì)量的RNA就必須有效地去除蛋白雜質(zhì)。常規(guī)方法：冷凍條件下研磨植物材料以抑制RNase等的活性；提取緩沖液中含有蛋白質(zhì)變性劑，如苯酚、胍、SDS、十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）等，這樣在勻漿時可以使蛋白質(zhì)變性，凝聚；利用蛋白酶K來降解蛋白雜質(zhì)，進一步可以用苯酚、氯仿抽提去除蛋白質(zhì)。第15頁/共48頁次級代謝產(chǎn)物的影響及對策從植物組織中提取高質(zhì)量RNA的另一個難點是許多高等植物組織尤其是成熟組織能產(chǎn)生某些水溶性的次級代謝產(chǎn)物，這些次級代謝產(chǎn)物很容易與RNA結(jié)合并與RNA共同被抽提出來而阻礙具有生物活性的RNA的分離。由于不能確定次級代謝產(chǎn)物具體是什么物質(zhì)，目前沒有什么特殊的方法來解決這個問題第16頁/共48頁1.1.3多糖的提取多糖廣泛存在于植物、微生物（細菌和真菌）和海藻中，來源很廣。我國是中藥的起源之地，而糖類是中藥材中普遍存在的成分，在對各種中藥材的化學成分研究的過程中，人們都少不了對其中多糖的關(guān)注。動植物中或微生物胞內(nèi)多糖的釋放步驟：⑴去除表面脂質(zhì)，常用醇或醚回流脫脂；⑵脫脂殘渣用溶液提取(即冷水，熱水，0.1～1.0mol/LNaOH，1%醋酸或1%苯酚等)；⑶提取液除雜：對于無機鹽及低分子量的有機物質(zhì)可用透析法、離子交換樹脂或凝膠過濾法除去；對于大分子雜質(zhì)可用酶消化(如蛋白酶、木質(zhì)素酶)，乙醇或丙酮等溶劑沉淀法或金屬絡合物法。第17頁/共48頁蛋白雜質(zhì)的影響及對策多糖提取液中除去蛋白質(zhì)是一個很重要的步驟，常用的方法有Sevag法氯仿：戊醇（或正丁醇）：多糖水溶液=5：1：6較溫和三氟三氯乙烷法多糖水溶液：三氟三氯乙烷=1：1效率高、不易大量應用三氯乙酸法多糖水溶液中滴加3%三氯乙酸較劇烈，不適合含呋喃糖殘基的多糖酶解法前三種方法不適合糖肽的分離三氯醋酸法和Sevag法的脫蛋白效果相近，并且蛋白酶法與Sevag法相結(jié)合除蛋白的效果較好。第18頁/共48頁1.2動物組織預處理注意事項勻漿化前的預處理(冷凍)提取物緩沖液的選擇(中性)蛋白酶抑制劑的添加保護劑的添加(β-巰基乙醇、EDTA、輔酶等)提取液的澄清(高速離心、沉淀、吸附等)第19頁/共48頁1.3微生物物質(zhì)的提取制備各種發(fā)酵產(chǎn)品，由于菌種不同和發(fā)酵液特性不同，其預處理方法的選擇也有所不同。大多數(shù)發(fā)酵產(chǎn)物存在于發(fā)酵液中，也有少數(shù)產(chǎn)物存在于菌體中，或發(fā)酵液和菌體中都含有。對于胞外產(chǎn)物，經(jīng)預處理應盡可能使目的產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到液相，然后經(jīng)固液分離除去固相；對于胞內(nèi)產(chǎn)物，則應首先收集菌體或細胞，經(jīng)細胞破碎后，目的產(chǎn)物進入液相，隨后再將細胞碎片分離。第20頁/共48頁大腸桿菌重組蛋白的提取制備多拷貝質(zhì)粒上強啟動子過量表達重組蛋白質(zhì)使整個細胞的蛋白質(zhì)表達水平提高,但大多情形下會導致諸如包含體的不溶性蛋白聚集的形成重組菌E.coliM15(pQE32-AGN)外源基因的誘導表達(A未誘導，B誘導)第21頁/共48頁包含體包含體（inclusionbodies）是無定形的蛋白質(zhì)的聚集，不被任何膜所包圍。細胞破碎后，包含體呈顆粒狀，致密，低速離心就可以沉淀。包含體難溶于水中，在變性劑溶液（如鹽酸胍、脲）中才能溶解。在這些溶液中，溶解的蛋白質(zhì)呈變性狀態(tài)，即所有的氫鍵、疏水鍵全被破壞，疏水側(cè)鏈完全暴露，但一級結(jié)構(gòu)和共價鍵不被破壞。因此當除去變性劑時，一部分蛋白質(zhì)可以自動折疊成具有活性的正確構(gòu)型，這一折疊過程稱為蛋白質(zhì)的復性。包含體主要由蛋白質(zhì)構(gòu)成，其中大多是基因表達產(chǎn)物。這些基因表達產(chǎn)物沒有生物活性。為此，欲獲得天然活性態(tài)的目標產(chǎn)物，必需分離包含體后，溶解包含體并使其中的目標蛋白恢復應有的天然活性。所以，包含體的出現(xiàn)增加了生化工程師生物分離設計的難度第22頁/共48頁重組蛋白的提取步驟大腸桿菌的酶解采用溶菌酶或超聲破碎方法來破壁包含體的清洗用溶劑清洗包含體能進一步除去雜蛋白從包含體中溶解重組蛋白（變性）選擇和優(yōu)化溶解液（一般為尿素和鹽酸胍），使包含體中重組蛋白溶解重組蛋白的復性稀釋法、透析法、層析法、分子伴侶等第23頁/共48頁2細胞的破碎與分離細胞的破碎：用一定方法（機械法、物理法、化學法、酶法等）打開細胞壁或膜，使細胞內(nèi)含物有效地釋放出來。提?。耗康奈飶陌麅?nèi)轉(zhuǎn)移到外界溶液中。細胞提取劑提取液（液體目的物）沉淀洗滌提取物（固體目的物）破碎勻漿離心第24頁/共48頁2.1細胞的破碎方法2.1.1機械法原理：機械運動產(chǎn)生剪切力的作用破細胞組織搗碎法適合：硬度較大的動、植物組織第25頁/共48頁高速勻漿法特點破碎程度高，而其機械剪切力對生物大分子的破壞較少，處理量大。原理利用高壓使細胞懸浮液通過針性閥，由于突然減壓和高速沖擊撞擊環(huán)使細胞破裂。適用較柔軟、易分散的組織細胞第26頁/共48頁高速勻漿機高速勻漿法為大規(guī)模細胞破碎的常用方法，設備由高壓泵和勻漿閥組成。第27頁/共48頁研磨法與珠磨法研磨法(實驗室規(guī)模)由陶瓷的研缽和研桿組成，加入少量研磨劑（如精制石英砂、玻璃粉、硅藻土）珠磨法(工業(yè)規(guī)模)進入珠磨機的細胞懸浮液與極細的玻璃小珠、石英沙、氧化鋁等研磨劑（直徑<1mm）一起快速攪拌或研磨，研磨劑、珠子與細胞之間的互相剪切、碰撞，使細胞破碎,釋放出內(nèi)含物。在珠液分離器的協(xié)助下，珠子被滯留在破碎室內(nèi)，漿液流出從而實現(xiàn)連續(xù)操作。適用：微生物（細菌）與植物細胞第28頁/共48頁珠磨機臥式珠磨機立式珠磨機第29頁/共48頁擠壓法微生物細胞在高壓下通過一個狹窄的孔道高速沖出，因突然減壓而引起一種空穴效應，使細胞破碎。適用：細菌（革蘭氏陰性菌）第30頁/共48頁2.1.2物理法超聲波破碎頻率為20kHz以上的波，超過人耳可聽范圍。其對細胞的破碎與空穴的形成有關(guān)?？昭ㄗ饔茫涸诔暡ㄗ饔孟拢箽馀菪纬?、脹大和破碎的現(xiàn)象。一般樣品濃度、聲強、頻率、介質(zhì)的離子強度、pH、處理時間都對破碎有影響。微生物細胞條件:樣品濃度50～100mg/ml，輸出功率100～200W，破碎時間3～5分鐘，間歇操作，樣品量≤40ml，冰浴操作第31頁/共48頁超聲破碎儀第32頁/共48頁滲透壓沖擊法高滲突然低滲，反復后可造成細胞破碎，促使內(nèi)含物釋放。適用：處理胞壁較脆弱的微生物。反復凍融法將材料深冷（-15℃～-20℃），形成水晶，破壞胞膜疏水鍵，增加親水性，反復可破細胞。適用：動物材料第33頁/共48頁急熱驟冷法將材料投入沸水，維持85～90℃數(shù)分鐘，冰浴中急速冷卻，使胞壁結(jié)構(gòu)破壞。適用：細菌及病毒等中對熱不太敏感的物質(zhì)提取干燥法第34頁/共48頁2.1.3化學法溶劑處理法丙酮、氯仿、甲苯等脂溶性溶劑可溶解胞膜上脂質(zhì)化合物，使細胞結(jié)構(gòu)破壞。表面活性劑法添加如十二烷基磺酸鈉、去氧膽酸鈉等，通過破壞細胞膜而破碎細胞，釋放目的物。此法常需與其它方法結(jié)合應用第35頁/共48頁2.1.4酶解法自溶法將欲破碎細胞在一定條件（pH、T）下保溫一定時間，通過細胞本身存在的酶系的作用，將細胞破壞，使胞內(nèi)物質(zhì)釋放。外加酶法利用各種水解酶專一性地將細胞壁分解，使內(nèi)含物釋放出來。細菌：加溶菌酶（結(jié)合反復凍融或加EDTA）酵母：采用β-葡聚糖酶霉菌：添加幾丁質(zhì)酶植物材料：加纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶等。第36頁/共48頁2.2選擇依據(jù)總原則：最大提取、不易變性、減少干擾具體須從材料特性、目的物特性綜合考慮材料細胞的特性動物細胞易破碎，只需用溫和方法植物細胞較難破碎，須用中等或強度大的方法微生物細胞較復雜，一般用較強的方法第37頁/共48頁目的物的特性⑴．細胞中的位置游離狀：只需溫和破碎，除去不溶部分。結(jié)合狀：可能結(jié)合在膜或細胞器內(nèi)，需先收集膜或細胞器，再破碎⑵．敏感性溫度、pH、氧、剪切力、雜酶等影響⑶．處理量有些處理量大，如組織搗碎機、勻漿器等。有些處理量少，如超聲波破碎等。第38頁/共48頁2.3提取劑2.3.1組成要求：目的物溶于其中，?；钚?，減雜質(zhì)。考慮因素如下：（1）．離子強度影響物質(zhì)溶解度的主要因素，適當?shù)牡碗x子強度溶液（0.05～0.2mol/L）除增加溶解度，還對活性有穩(wěn)定作用。第39頁/共48頁（2）．pH 影響目的物的溶解度及穩(wěn)定性。 一般控制在pI附近的穩(wěn)定性范圍內(nèi)。（3）．添加劑 抑制劑（主要水解酶抑制劑），如提取核酸時，添加核酸酶抑制劑防目的物被分解。 保護劑（穩(wěn)定性），如對含巰基的酶添加谷胱甘肽等巰基保護劑第40頁/共48頁2.3.2用量目標 收率（80%以上）且目的物濃度大動物、微生物—加1.5～3體積的提取劑；植物—加入0.5～1體積的提取劑。第41頁/共48頁2.4提取液的澄清動物、微生物提取液往往較混濁，需澄清 沉降速度：V=d2(σ-ρ)ω2γ/18η 顯然：加大ω或d或減小η都可增加V方法：㈠．粒子聚結(jié)（增大d）25%(NH4)2SO4處理酸化法適用于動物細胞第42頁/共48頁㈡．降低提取液粘度NA（DNA、RNA），類樹膠等易造成粘度大